Mollusk içinde hücre içi kalsiyum konsantrasyonu ve Synaptic Etkinliği İzlenmesi Değişiklikler<em&gt; Aplysia&#39;nın</em

Özet

Biz intrasellüler serbest kalsiyum konsantrasyonu ve sinaptik etkinliği değişiklikleri eşzamanlı bir ganglion hazırlanmasında nasıl takip edilebileceğini göstermektedir Aplysia'nın. Biz görüntü intraselüler kalsiyum floresan boya, Kalsiyum Turuncu ve keskin (hücre içi) elektrotlar ile sinaptik iletim teşvik ve izlemek kullanarak.

Özet

Bu, hücre içi kalsiyumda değişiklikler sinaptik plastisite (örn., homosynaptic kolaylaştırma ¹⁾ arasında önemli formları bir dizi indüksiyon aracılık öne sürülmüştür. Bu hipotezler eşzamanlı intraselüler kalsiyum değişiklikleri ve sinaptik etkinliği değişiklikler izlenerek test edilebilir. Bu hücre içi kayıt tekniği ile kalsiyum görüntüleme birleştirerek gerçekleştirilebilir gösterilmektedir. Bizim deneyler yumuşakça Aplysia'nın californica bir bukkal ganglion yapılmaktadır. Bu hazırlık deneysel avantajlı bir dizi özellik vardır: Gangliyon kolayca Aplysia'nın kaldırılır ve deneyler, normal sinaptik bağlantıları yapmak ve normal bir iyon kanal dağıtım olan yetişkin nöron kullanmak olabilir. Aplysia için doğal hayvan düşük metabolik oranı ve nispeten düşük sıcaklıklarda (14-16 ° C) bağlı olarak, müstahzarlar uzun süreler boyunca stabildir. Bu uzun dalga boyu floresan boya kalsiyum bağlandığı zaman biz kolayca iyontoforez yoluyla nöron içine 'yüklü' olduğunu Kalsiyum Turuncu ² hücre geçirgenliği olmayan sürümünü kullanacaktır intrasellüler serbest kalsiyum değişiklikleri. saptamak için ent ">, floresan yoğunluğu artar. Kalsiyum Turuncu var hızlı kinetik özellikleri ³ ve rasyometrik boyalar aksine (örneğin, Fura 2), görüntüleme için herhangi bir filtre tekerleği gerektirir. Kararlı ve diğer boyalar (örneğin, flüoresan 3) ^2,4 daha az fototoksik oldukça fotoğrafı. olmayan tüm rasyometrik gibi Bu yükleme ve difüzyon nedeniyle boya konsantrasyon değişiklikleri hesaba katmak için mümkün değildir, çünkü boyalar, kalsiyum Orange, kalsiyum konsantrasyonu olarak göreceli değişiklikleri gösterir. Ancak, bu mutlak bir kalsiyum konsantrasyonu sağlayacak şekilde kalibre edilebilir değildir.

Bir dik, sabit sahne, bileşik mikroskop saniyede 30 kare etrafında kayıt yapabilen bir CCD kamera ile görüntü nöronlar için kullanılmıştır. Aplysia'nın Bu zamansal çözünürlükteHücre içi kalsiyum konsantrasyonunda dahi, tek bir sivri uç oluşturulan değişiklik tespit etmek için yeterli olacaktır. Keskin elektrotlar aynı anda tespit pre-ve postsinaptik nöronların sinaptik indüklemek ve kaydetmek için kullanılır. Her denemenin sonunda, özel bir komut dosyası elektrofizyoloji ve görüntüleme verileri birleştirir. Doğru senkronizasyon sağlamak için biz mikroskop kamera bağlantı noktasına monte edilmiş bir LED bir ışık nabız kullanın. Presinaptik kalsiyum düzeyleri (intrasellüler EGTA enjeksiyon yoluyla örneğin) Manipülasyonu bize plastisite çeşitli şekillerde arabuluculuk intraselüler kalsiyum rolüne ilişkin spesifik hipotezleri test etmeye imkan vermektedir.

Protokol

1. Hazırlık

1. 75-100 ml izotonik magnezyum klorid çözeltisi enjekte edilerek hayvan anestetize. Biz görüntüleme için kullanmak Aplysia'nın genellikle 150-200 gram ve Marinus Bilimsel elde edilir.
2. Bir balmumu kaplı çanak anestezi hayvan Pin. Şırınga iğneleri bu amaç için iyi çalışır; steril teknikler gerekli değildir. Brüt forseps ve standart makas kullanarak hayvanın ayağı bir kesi yapmak ve bukkal kitle maruz. Bukkal ganglion bulun. Tüm bukkal sinirler kesilerek ganglion dikkatle ücretsiz, yay makas ve ince forseps kullanma.
3. Ganglion çıkarın ve yapay deniz suyu içeren bir Sylgard astarlı çanak yerleştirin. Ganglion stabilize....

Tartışma

Bu aynı anda hücre için kalsiyum konsantrasyonunun izlemek ve sinaptik etkinliğinin değerlendirilmesi için de kullanılabilir yöntemleri göstermektedir. Bu teknikler, kısa süreli plastiklik çeşitli şekillerde nasıl yönlendirildiğini belirlenmesi bakımından yararlıdır.

Görüntüleme floresan mikroskop ve CCD kamera ile yürütülmektedir. En fonksiyonel görüntüleme set-up ile karşılaştırıldığında bu ekipman gereksinimleri nispeten mütevazı. Tekniği basit ve öğrenmesi kolay. CCD kamera ile görüntüle.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlamak
Kalsiyum Turuncu	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
Kalsiyum kalibrasyon tampon kiti	Invitrogen	C-3008MP	sinyalinin duyarlılık ve dinamik aralığı test etmek için yararlı
Magnezyum klorür hekzahidrat	Sigma	M0250	hayvan anestetize 0.33 M solüsyon olarak kullanılmaktadır

Ekipman Adı	Şirket	Yorumlamak
FN-1 dik floresan mikroskop	Nikon Instruments	Narishige ile ITS-FN1 aşamasında
NMN-21 manipülatörler	Narishige	mıknatıslar ile sahne üzerine monte
CoolSNAP HQ 2 CCD kamera	Fotometrik
NIS elemanları AR (Sürüm 3.22)	Nikon Instruments	görüntüleme yazılımı floresans verileri toplamak için kullanılan
10X/0.3w Planı Fluor hedefi	Nikon Instruments	Bu suya daldırma objektifi 3,5 mm çok uzun bir çalışma mesafesi vardır
120 PC metal halide lamba X-Cite	EXFO	floresan görüntüleme için kullanılır
LS-DWL halojen lâmba	Sumica
ET-Cy3 filtre seti	Chroma Teknoloji	;
Güç 1401 A / D dönüştürücü	Cambridge Elektronik Tasarım	örnekleme 3 kHz'de yapıldı
Spike II (Sürüm 7.07)	Cambridge Elektronik Tasarım	Yazılım elektrofizyoloji verileri toplamak için kullanılan
SEC-10 LX amplifikatör	NPI elektroniği	10X bir headstage ile ikinci
Model 410 amplifikatör	Brownlee hassas	sinyali yükseltmek ve filtrelemek için kullanılır
WS-4	eksi k Teknolojisi	görüntüleme için titreşim izolasyonu
soğutma platformu	ısmarlama	pirinç levha hangi aracılığıyla buz su bir değişken hızında pompalanan