ASC farklılaşma kontrol için bir iki tabakalı Hidrojel mühendislik

Özet

Bu protokol çevreleyen hücre dışı matriks gelen ipucu almak ve birden fenotipleri farklılaşması için indüklenebilir kök hücrelerin doğal yeteneği kullanılmasına odaklanmıştır. Bu yöntemler yazının aynı anda yağ kaynaklı kök hücreleri birlikte ayırt etmek için, PEG-fibrin ve kollajen oluşan iki katmanlı hidrojel kullanan bir model, bizim ve nitelendirilmesi uzanır ¹.

Özet

Yılda Doğal polimerler nedeniyle ana biyouyumluluk ve in vitro ve in vivo olarak hücreleri ile etkileşim yeteneği daha fazla önem kazanmıştır. Rejeneratif tıpta umut vaat araştırma bir alan roman biyomalzemeler ve kök hücre kombinatoryal kullanılmasıdır. Doku mühendisliği alanında temel bir strateji hücre fonksiyonu yönlendirilmesi için üç boyutlu İskele (örneğin, hücre dışı matriks, hidrojeller, mikro / nano parçacıklar decellularized) kullanılmasıdır. Bu teknoloji, hücrelerin, onlar yapışabilir bunun üzerine bir substrata ihtiyaç çoğalırlar ve onların farklılaşmış hücre fenotipi ve fonksiyonu ^2-3 olduğunu ifade keşif dönüşmüştür. Daha yakın zamanlarda, aynı zamanda hücre yapışması için, bu yüzeyler kullanımı, aynı zamanda etkileşime girer ve matris substrat (örn., hücre dışı matris, ECM) ⁴ kuyruklar alır sadece olduğu tespit edilmiştir. Bu nedenle, hücre ve iskelesi bir karşılıklı bağlantısı vardırdoku gelişimi, organizasyon ve nihai fonksiyonunu kontrol etmek için hizmet vermektedir. Yağ kökenli kök hücreleri (TSK) mezenkimal olan, non-hematopoetik kök hücreler çok soy diferansiyasyon sergileyen ve hücrelerin hazır kaynağıdır (yani pre-vasküler endotelin ve perisitler) olarak hizmet verebilir adipoz dokuda sunuyoruz. Bizim hipotezi yağ kaynaklı kök hücreleri iki katmanlı matrisler ^{1 tek} ortak kültür onlar tarafından eş zamanlı olarak farklı fenotipleri doğru yönlendirilecek olmasıdır. Laboratuvarımız dermal yara iyileşmesi üzerine odaklanmıştır. Bu amaçla, bir dermal özgü yara iyileşmesi ECM çevrenin özelliklerini ve işlevlerini taklit tek bir kompozit doğal biyomalzemeler gelen matrisi, fibrin, kollajen ve kitosan yarattı.

Protokol

1. Yağ-Türetilmiş Kök Hücre (TSK) ^{1, 5} Ayırma

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Sıçan perirenal ve epididimal adipoz yalıtmak ve daha önce açıklanan ⁵ olarak% 1 fetal sığır serumu (FBS) içeren steril Hank tamponlu tuz solüsyonu (HBSS) ile yıkayın. Bu çalışma, Hayvan Refahı Yasası, uygulanması Hayvan Refahı Yönetmeliği ve Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu esaslarına göre uygun olarak yapılmıştır.
2. Doku kıyma ve oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 500 g'de 50 mL'lik bir tüp ve santrifüj içine% 1 FBS içeren HBSS 25 mL içine 1-2 g transfer.
3. Serbest yüzen adipoz doku tabakası ve 125 ml Erlenmeyer şişesinde transfer toplayın ve 37 az 45 HBSS kollajenaz tip II (200 U / ml) 25 mL ° orbital çalkalayıcı (125 rpm) üzerinde C ile tedavi.
Dikkatle pipeting tarafından sıvı kısmı (petrol ve yağ tabakası altında) çıkarın ve 100 sıralı olarak bu filtre - um ve 70 - mikron naylon ağ filtre. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 g'de santrifüje süzüntü, süpernatan aspire ve HBSS 25 mL ile iki kez pelet yıkanır.
4. MesenPRO RS Büyüme katkısı, (penisilin G, 100 U / mL, 100 ug / streptomisin sülfat mL, ve amfoterisin 0.25 ug / mL antibiyotik-antimikotik ile desteklenmiş büyüme medyumu (MesenPRO RS Bazal Medium) 50 mL hücre pelletini İki T75 şişeler (25 mL / şişeye) içine L-glutamin ve pipetle hücreleri B), ve 2 mM.
5. Kültür 37 azından% 5 _CO2-nemli bir inkübatörde ASC ° C (pasaj 2-4 TSK ve tüm deney için kullanılmaktadır).

2. Chitosan Mikroküreler (KGYS) hazırlanması

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. 5 Koaservasyon tekniği ile birlikte, bir su-içinde-yağ emülsiyonlaştırıcı işlem ile hazırlanır. Soya yağı, n-oktanol (1:2 v / v) ve 5 oluşan bir yağ fazı karışımı, 100 mL kitosan sulu bir çözeltisi (asetik asit içinde 0.5 M% 3 ağırlık / hacim kitosan 6 mL), emülsifiye % sorbitan-mono-oleat (p 80) emülgatör, zıt yönlerde aynı anda havai (1700 rpm) ve manyetik karıştırma (1000 rpm) ile. Çapraz bağlama oluşmadan önce erken oluşan miseller çözüm kalır ve dibe kadar olmadığı karıştırma temin eder bu ikili yöntemi. Dahası, içinde manyetik karıştırıcı yardımcıları misel oluşumu ve rigidization sırasında kitosan de-toplamak.
2. Karışım sürekli stabil bir su-içinde-yağ emülsiyonu elde edilene kadar, yaklaşık 1 saat karıştırıldı karıştırın. 4 saat (24 mL toplam) n-oktanol, her 15 dakika içinde% 1 w / v potasyum hidroksit ile 1.5 mL ilavesi ile bağlama iyonik çapraz başlatabilir
4. Bir vakum desikatörde kurtarıldı küreler kurulayın ve daha fazla işlem olmadan analiz. Eğer ortalama parçacık boyutu CSM, miligram başına yüzey alanına ve bir parçacık boyutu analizörü kullanılarak birim hacmi kübik belirleyebilir.
5. Daha sonraki deneylerde, kalıntı tuzları uzaklaştırmak ve mutlak etanol 5 mL gece boyunca yıkanarak sterilize edilmesi steril su ile CSM üç kez yıkanır.

3. BelirlenmesiKGYS Serbest Amino Gruplarının sayısı

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Trinitro benzensülfonik (TNBS) Bubnis ve Ofner ⁶ asit yöntemi kullanılarak bağlayan iyonik çapraz sonra KGYS mevcut serbest amino gruplarının sayısını belirleyin. 40 ° C'de 4 saat süreyle 50 mL'lik bir cam tüp içinde% 0.5 TNBS solüsyonu 1 mL mikrosferler 5 mg inkübe ve 60 6N HCI ile 3 ml ilave ° C'de 2 saat süreyle ile hidroliz.
2. Oda sıcaklığına kadar soğumaya örnekleri ve deiyonize su ile 5 mL etil eter ve 10 ml ilave edilerek serbest TNBS özü.
3. ° C bir su banyosunda 15 dakika oda sıcaklığına kadar soğutulur ve kalan eter, buharlaşma ve 15 ml su ile dilüe etmek için 40 sulu faz bir 5-mL'lik kısım ısıtılır.
4. Boş ve kitosan CSM p için kullanılan kitosan olmadan TNBS çözümü kullanarak bir spektrofotometre ile 345 nm de absorbansı ölçülürAmino gruplarının sayısı tespit etmek telafi. Kitosan göre CSM serbest amino grubu ile kestirilebilir.

4. CSM içinde yükleniyor ASC

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Gece steril HBSS bölümünde 2,5 sterilize KGYS 5 mg dengeye ve 8 eklemek - mikron gözenek büyüklüğüne membran kültür plakası eki (24-iyi plaka).
2. KGYS membran üzerine yerleşmiş sonra, dikkatlice HBSS aspire ve uç dışına büyüme ortamının ekleme ve 700 uL içine büyüme ortamının 300 uL ekleyebilir.
3. Kültürü plakası içine eklemek CSM içinde büyüme ortamı ve tohum 200 uL uygun konsantrasyonda Pastör pipetiyle TSK (1 × ^Ekim 4-4 x 10 ^4). Kültürü insert içinde orta son hacim, tohumlama sonra, 500 uL olup.
4. Incub37 azından% 5 _CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 24 saat süre ile KGYS üzerine ASC tohumlu ° C. yiyen

5.. KGYS yılında ASC Yükleme ve Hücre Uygulanabilirlik Yüzde Belirlenmesi

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Insert membran içine göç etmiş hücreleri bozmadan steril 1,5 ml mikrosantrifüj tüp inkübasyon, pipet ASC yüklü CSM sonra.
2. Artık orta çıkarın ve tüp taze besiyeri 250 uL ekleyin.
3. Her tüpe, MTT ile 25 ul ilave [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-il) -2,5-difeniltetrazolium bromür] çözeltisi (5 mg / mL) ve ₂ nemlendirilmiş% 5 CO 4 saat için inkübe 37 ° C inkübatör
4. İnkübasyondan sonra, orta kaldırmak dimetil sülfoksit 250 uL ekleyin ve karmaşık formazan çözünürleştirmek için 2-5 dakika boyunca vorteks karışımı.
5. 2700 g at CSM santrifüjleyiniçin 5 dakika, süpernatant kapalı pipet ve MTT üreticinin talimatlarına göre bir standart plaka okuyucu kullanarak 570 nm ve 630 nm dalga boyunda absorbans kendi belirler.
6. Bir standart eğri geliştirmek için kültüre tanımlandığı ASC numaraları elde edilen değerlere göre KGYS ile ilişkili hücre sayısının belirlenmesi.

6. ASC-CSM Hazırlanması ve Karakterizasyonu PEG-fibrin Jeller Gömülü

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Polietilen glikol (PEG), fibrin (PEG-fibrin) hidrojel Suggs ve arkadaşları tarafından hazırlanan ⁷ süksinimidil glutarat modifiye polietilen glikol (PEG; 3400 Da) eriterek. Tris tamponlu tuz (TBS, pH 7.8) ve filtre sterilize 4 mL kullanılarak Sadece deney başlamadan önce bir-0.22 mikron filtre ile. Çözünmüş PEG ilk 3-4 saat boyunca bu uygulamada, sadece etkili olur.
2. Mix 500 Μ fibrinojen stokunun l (TBS, pH 7.8 içinde 40 mg / mL) ve 37 de bir% 5 _CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 20 dakika boyunca bir 6-kuyulu plakalı ve inkübe bir kültür PEG stokunun 250μl ° C. Fibrinojen: Bu karışım, 1:10, SG-PEG-SG bir molar konsantrasyon oranı oluşturmaktadır.
3. CSM 5 mg arasında derişimde ASC-CSM 250 ul al, (≈ 2 x 10 hücre ⁴⁾ ve pegile fibrinojen çözeltisi ile karıştırılır.
4. Hemen trombin stok (25U/mL) 1 ml ekleyin ve hızlı bir şekilde pipetle bir veya iki kez çiğnemek. 10 dk tam jelleşme için izin vermek için 37 ° C'da PEG-fibrinojen ile trombin karıştırıldıktan sonra, hemen bir 12-kuyulu plakalı olarak hücre-jel karışımı yerleştirmek _ve% 5 CO2 inkübatöründe inkübe nemlendirilmiş. Jelleşme süresi, hızlı olduğu için, fazla 5 saniye pipet içindeki jel çözümü deneyin ve tutmayın. Pegile fibrinojen trombin ile parçalanabilen bir pegile fibrin hidrojel oluşturur. Gibi the nihai ürünün jel PEG-fibrin olarak anılır.
5. HBSS ile iki kez PEG-fibrin jeller yıkayın ve 37% 5 CO ₂ nemli inkübatörde% 10 FBS ile takviye alfa minimal gerekli ortam (α-MEM) ° C ile inkübe
6. Standart ışık mikroskopi teknikleri kullanan bir 11 günlük süre içinde jel içine CSM hücreleri göç gözlemleyin.

7. ASC-CSM Hazırlanması ve Karakterizasyonu Kollajen Jeller Gömülü

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. 2N NaOH ile 6.8 pH arındırılmış Bornstein ⁸ ve fibrillate yöntemine uygun olarak, fare kuyruk tendonları ekstrakte tipi 1 kolajen (7.5 mg / mL) karışımı ASC-CSM (5 mg ≈ 2 x 10 hücre ihtiva eden ^4).
2. Bir 12-iyi levhaya fibrile kolajen-ASC-CSM karışımı ekleyin ve _bir% 5 CO2 humidi içinde 30 dakika süreyle inkübe37 fied inkübatör ° C
3. Tam fibrilasyon sonra, 37 ° C kadar bir% 5 CO ₂ nemli inkübatörde 11 gün için kolajen-ASC-CSM jeller inkübe
4. Standart mikroskopi teknikleri kullanan bir 11 günlük süre içinde jel içine CSM hücreleri göç gözlemleyin.

8. Iki tabakalı PEG-fibrin (ASC-CSM)-Kolajen Jel Oluşumlar Gelişimi

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

1. Iki tabakalı yapı geliştirmek için, hafif bir değişiklik ile, yukarıda açıklandığı gibi Kolajen ve PEG-fibrin jeller hem hazırlanır. 1) Yük ASC: Kısaca, dört adımlı bir işlemi kullanarak kolajen ve PEG-fibrin iskeleleri arasında "sandviç" ASC-KGYS, iki bioscaffolds kullanarak kök hücre kaynağının tek göçmen ve co-indüksiyon özelliklerini incelemek için CSM, 2) üzerine col üzerinden fibrilizedir kollajen jel ve katman ASC-CSM boncuk dökümlagen jel, 3) dökme PEG-fibrin ASC-CSM-kollajen jel üzerinde jel ve jel katılaşmaya izin ve 4) iyi orta eklemek ve Vitro hücreleri üzerinde çalışma, (bkz. Şekil 1 in vivo uygulamalar için insert kaldırmak eklemek ).
2. A-1 mL tipi karışıma ASC-CSM ilave etmeksizin, 7,1, yukarıda tarif edildiği gibi 1 kolajen (7.5 mg / mL) karışımı hazırlandı. Bir 6-de doku kültürü uç (8-um gözenek boyutu) içinde karışımı yerleştirin ve 37 ° C'de% 5 _CO2 inkübatöründe nemlendirilmiş 30 dakika süreyle inkübe
3. Kültür ortamına (200 ul) içinde süspanse ASC-CSM kolajen yüzeyi 5 mg (10, 000 hücre / mg) üzerinde tam fibrilasyon, tabakası sonra. Mikrosferler jel üzerinde yapıldıktan sonra, karışıma ASC-CSM eklenmesi ve ASC-CSM-kollajen katmanların üstüne tabakası pegile fibrinojen / trombin solüsyonu olmaksızın, bölümünde açıklandığı 6,0-PEG fibrin jel hazırlanması. PEG-fibrin jel hazırlanırken, t yerine, hücre kültür aracı maddesi 250 ul kullanımıhücreler içeren orta O 250 ul.
4. Tamamlandığında, kültür ortamı ile yapı beslemeden önce tam jelleşme ulaşmak için% 5 CO ₂ nemli inkübatörde 30 dakika yapıları tasarlamak.
5. Tamamlandıktan sonra jelleşme, düşük odacık içinde bir yapı ve orta 3 mL üzerinde üst odacık içinde orta yerde 1 mL.

9. Stok Çözümler yapma

Not: aksi belirtilmediği sürece tüm işlemler oda sıcaklığında yapıldı.

• Kalsiyum klorür stok (40 mM): Sadece CaCl ₂ .2 H ₂ O kullanın Deiyonize su 100 ml CaCl ₂ .2 H ₂ O 588,4 mg eritin. 0.22-mikron filtre kullanılarak sterilize edin.
• Polietilen glikol: PEG oksijen ile son derece reaktif ve oda havasına maruz kaldığında okside olabilir. Bunun gibi, PEG azot (N ₂₎ bir atmosfer altında muhafaza edilmelidir. Accurately kullanıma hazır olana kadar -80 az 2 ml santrifüj tüpüne (Kullanmadan önce _N2 ile tüpleri temizlemek için emin olun) ve mağaza ° C 32 mg ağırlığında. Kullanmadan önce TBS çözeltisi 4 mL PEG 32 mg eritilir.
  Aşağıdaki çözümler her deneyde önce taze yapılmalıdır.
  
• TBS Çözüm: (25 pH 7,75-7,77 ° C 25 ° C pH çok önemlidir). TBS çözeltisi 15 ml'lik hazırlamak için, dikkatle filtre ile sterilize deiyonize su içinde bir tampon tablet çözülür ve istenen pH değerine ayarlanır. Her zaman taze çözüm hazırlamak stok tutmayın.
• Fibrinojen çözeltisi (40 mg / ml). Fibrinojen konsantrasyonu 40 mg / ml yapmak TBS fibrinojen tozu eritin. 4 de, bir manyetik karıştırıcı kullanılarak bir gece boyunca eritilmesi ° C. Bu, TBS ile istenen miktarı ile, tüm 1-g miktarı çözünmesi kolaylaşır. Ertesi gün, 4 ° C (genellikle bulanık) den fibrinojen kaldırmak ve buna izinBir homojen çözelti elde edilene kadar bir su banyosu içinde ısıtmak için. Son olarak, 0.45 mikron filtre kullanarak fibrinojen sterilize filtre.
• Trombin solüsyonu (25 adet / ml): trombin solüsyonu yapmak için, gerekli miktarda tartılarak hazırlanan 40 mM CaCl ₂ .2 H ₂ O ile çözülür Her zaman stok yapmak için trombin tüm flakon kullanmak iyi bir uygulamadır. Örnek: -20 ° C'de 200 CaCl ₂ mM .2 H ₂ O, tablet ve mağaza ile 5 kU trombin bir şişe eritilir

10. Temsilcisi Sonuçlar

Burada sunulan tekniğin genel amacı bir teslimat aracı olarak CSM kullanarak birden fenotipleri içine ASC eşzamanlı matris odaklı farklılaşma potansiyeli göstermektir. Biz bir iki katmanlı kollajen-PEG-fibrin İskele içine KGYS kök hücre sunmak için bir in vitro stratejisi göstermektedir. ASC Karakterizasyonu Bu iskele reveale içinde gömülüASC-yüklü KGYS kollajen ve PEG-fibrin tabakası arasında "sandviç" edilebilir d aynı anda ve farklı şekilde yeni koşullar altında başarılı olmak için hem de ekstraselüler ortamlardan ipucu alabilir. Biz ilk hücre canlılığı ve göçmen kapasitelerini korumak için model sistemi için yeteneği karakterizedir. Kollajen bunların "stemness," olarak Stro-1 kendi ifade ve bunların fibroblast-benzeri morfolojisi (Şekil 2 ve 2F) tarafından gösterilmiştir korumak için TSK yeteneği desteklenir. Onların tüp benzeri yapı morfoloji, von Willebrand faktör (Şekil 2E ve 2G) onların endotel hücre özel ifade ve pericyte özel ifadesine gösterdiği gibi aksine, PEG-fibrin, vasküler bir fenotipe doğru ayırt etmek için TSK ve bağlı NG2 ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü beta (PDGFRβ) (veriler gösterilmemiştir). Ayrıca, bu gözlenen fenotipleri erken kültürünün oluştuğu ortaya çıktı ve 11 gün boyunca devam edilmiştir, gibi demlenirŞekil 3 'de hücre dizilerindeki ardışık.

Tablolar ve Şekiller

Çift-katlı Faydaları Construct:

• Hücreleri olmadan iskele tek başına bir biyoaktif yapı iskelesi olarak gerçekleştirebilirsiniz.
• PEG-fibrin büyüme faktörlerinin katkısı olmadan ayırt etmek için kök hücre uyarabilir.
• Kollajen TSK ve kök hücre fenotipi korumada yardımcı olabilir.
• Bir çift-katlı bir yapı diğer hücre tipleri geçirmek ve (örneğin, endotel hücreleri, fibroblast, keratinositler, düz kas hücreleri, perisitler) prolifere için aktif bir tabaka olarak kullanılabilir.
• Sert ve yumuşak doku yenilenmesine hydroxyaptite veya demineralize kemik gibi sert doku mühendisliği iskeleleri ile kullanılabilir.
• Bu çok katmanlı, farklı doku mühendisliği yapı (vb, dermal-damar, damar-epitel, dermal-vasküler-hipodermal gibi) geliştirmek için kullanılabilir.
• Aynı anda geliştirmek için bir tek hücre kaynağı kullanırçok hücreli bölmeleri.
• Bu doğal kökenli olduğundan ev sahibi doku ile entegre bir potansiyele sahiptir.
• Jel yapısı içinde CSM göç etmek hücreleri için bir platform sağlar.
• CSM hazırlamak için kullanılan Kitosan, iyi bilinen bir aktif kemo-cezbedicidir.
• "Matrix-güdümlü kök hücre farklılaşması", bu protokolü uygulanan genel konsepti diğer kök hücre tiplerine uygulanabilir. Ancak, daha fazla araştırma matris odaklı farklılaşma fizibilite belirlemek için garantilidir. Iki katmanlı jel iskele sürekli ve kontrollü bir şekilde hücreleri sunmak için bir rezervuar olarak hareket edebilir.
• Rekonstrüksiyon sonra, jeller hala bileşenleri tek tek ayrılabilir.

Şekil 1. Şematik genel amacı ve tekniği süreci resmediyor. 1) Yağ kaynaklı kök hücreler (TSK) lo vardırkitosan mikroküreler üzerine aktarıldı. 2) Collagen daha sonra bir 6-de insert, kolajen fibrillate ayarlandı pH, ve bir 6-kuyucuklu plak odacık içine yerleştirilir insert içine dökülür. ASC-yüklü CSM küreler sonra kolajen üzerindeki katmanıdır. 3) pegile fibrinojen sonra kolajen (Artan-CSM) üzerine döküldü ve trombin ilavesiyle jölelenmişti edilir. 4) son iki tabakalı yapı daha sonra kültür uç çıkarılır ve in vitro veya in vivo analiz için de kullanılabilir.

ASC Şekil 2. Karakterizasyonu kollajen ve PEG-fibrin 3D matrisinin içinde kültüre. Izole ASC A) Faz-kontrast fotomikrografıdır pasajlandı ve rutin 2-boyutlu hücre kültür teknikleri kullanılarak korunur. Fotomikrografları B, D ve F ASC-CSM 3 boyutlu kollajen jel içinde kültüre betimliyor; C, E ve G gösterisi ASC-CSM 1. günde bir 3 boyutlu PEG-fibrin jel, hem de içinde kültüre ise2. B ve C), hem TSK iskelesi tipte CSM küre uzağa geçiş gösterilmiştir. TSK ve kök hücre belirleyicisi Stro-1 (; ok D) kendi ifadesi korurken, kolajen (B) 'de bir basık, mil gibi morfoloji var görünüyor. PEG-fibrin TSK ve kültüre zaman daha tüp benzeri yapılar sergilerler ve von Willebrand Faktör (E) gibi vasküler hücre işaretleyicileri ifade indüklenir. Transmisyon elektron mikroskobu her iskele içinde TSK gösterdiği tipik bir morfoloji gösteriyor. (; Ok G) kollajen jel TSK TSK tipik lumenal (L etiketli) yapılar oluşmuş ise, hücre (F) gövdesinden uzanan küçük filopodia (fl) var görünüyor.

Şekil 3. Kollajen bilayers ve PEG-fibrin jel arasındaki ASC-KGYS morfolojik analizi. ASC-KGYS kollajen ve PEG-fibrin jel arasında "sandviç" ve 11 gün kültüre edildi. Sol column göç ve kollajen matriks içinde çoğalan TSK resmediyor ve mil benzeri morfolojisi almaya görünür. Sağ sütunda TSK uzak KGYS göç ve PEG-fibrin jel boyunca tüp benzeri yapılar oluşturan resmediyor.

Tartışma

TSK ve izolasyon ve çeşitli hücre tipleri doğru ayırt etmek için yeteneği edilmeleri kolay olduğundan iyi bilinmektedir. Bu yazıda anlatılan teknikleri ile, aynı anda birden fazla biomatrices bu hücrelerin teşhir ederek TSK plastisite yararlanmak için edebiliyoruz. Hücreler CSM tabanı uzağa göç ve onların çevresindeki ekstrasellüler çevre girerken, hücrelerin iskele gelen ipucu almak ve ya "stemness" (kollajen) koruyabilir veya damar-damar-destekleyici hücre tipleri (fibrin) doğru ayırt teşvik edilecektir. Lab...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif / ekipman Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)	Gibco	14175	Sarf
Sığır fetüs serumu	Hyclone	SH30071.03	Sarf
Kollajenaz Tip II	Sigma-Aldrich	C6685	Sarf
70-um Naylon Mesh Filtre	BD Biosciences	352350	Sarf
100 mikron Naylon Mesh Filtre	BD Biosciences	352360	Sarf
MesenPRO Büyüme Orta Sistemi	Invitrogen	12746-012	Sarf
L-Glutamine	Gibco	25030	Sarf
CaCI2 0,2 H2O	Sigma	C8106	Sarf
T75 Doku Kültürü Flask	BD Biosciences	137787	Sarf
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Sarf
Asetik asit	Sigma-Aldrich	320099	Sarf
N-oktanol	Acros Organics	150630025	Sarf
Sorbitan-Mono-oleat	Sigma-Aldrich	S6760	Sarf
Potasyum hidroksit	Sigma-Aldrich	P1767	Sarf
Aseton	Fisher Scientific	L-4859	Sarf
Etanol	Sigma-Aldrich	270741	Sarf
Trinitro benzensülfonik asit	Sigma-Aldrich	P2297	Sarf
Hidroklorik asit	Sigma-Aldrich	320331	Sarf
Etil eter	Sigma-Aldrich	472-484	Sarf
8-um Doku Kültürü Plaka Uçlar	BD Biosciences	353097	Sarf
1.5 ml Mikrosantrifüj Tüpler	Balıkçı	05-408-129	Sarf
MTT Reaktif	Invitrogen	M6494	Sarf
Dimetil Sulfoxide	Sigma-Aldrich	D8779	Sarf
Qtracker Hücre Etiketleme Kiti (QTracker 655)	Molecular Probes	Q2502PMP	Sarf
1 Kollajen Tip	Travigen	3447-020-01	Sarf
Sodyum Hidroksit	Sigma-Aldrich	S8045	Sarf
12-Peki Doku Kültürü Tabaklar	BD Biosciences	353043	Sarf
Fibrinojen	Sigma	F3879	Sarf
Trombin	Sigma	T6884	Sarf
Polietilen Benztriazole Türev	Sunbio	DE-034GS	Sarf
Tampon Tris Tablet (pH 7.6)	Sigma	T5030	Sarf
Santrifüj	Eppendorf	5417R	Equipment
Orbital Çalkalayıcı	New Brunswick Bilimsel	C24	Ekipman
Hava-% 5 CO2 ile nemlendirilmiş Kuluçka	Thermo Scientific	Model 370	Ekipman
Tepegöz Karıştırıcı	IKA	Visc6000	Ekipman
Manyetik Karıştırıcı	Corning	PC-210	Ekipman
Vakum Desikatör	-	-	Ekipman
Parçacık Boyut Analiz Cihazı	Malvern	STP2000 Spraytec	Ekipman
Su Banyosu	Fisher Scientific	Isotemp210	Ekipman
Spektrofotometre	Beckman	Beckman Coulter DU 800UV/Visible Spektrofotometre	Ekipman
Girdap	Diagger	3030a	Ekipman
Mikroplaka Okuyucu	Molecular Devices	SpectraMax M2	Ekipman
Floresan / Işık Mikroskobu	Olympus	IX71	Ekipman
Konfokal Mikroskop	Olympus	Konfokal Mikroskop FV-500 Lazer	Ekipman
Taramalı Elektron Mikroskobu	Carl Zeiss MicroImaging	Leo 435 VP	Ekipman
Transmisyon Elektron Mikroskobu	JEOL	JEOL 1230	Ekipman