Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Summary

Bu makale, yüksek bir verim yöntemi antijen sunan hücreler üzerinde belirli reseptörlerine yönelik olarak kullanım için polianhidrid Nanopartiküllerin yüzeyine oligosaccharidler ve ekin sentezi için sunulmuştur.

Abstract

Bu malzeme tasarım, nanoteknoloji, kimya ve immünoloji gibi alanlarda ilgili Transdisipliner yaklaşımlar rasyonel etkili aşılar taşıyıcıları tasarlamak için kullanılmıştır gerekir. Nanopartikül-tabanlı platformlar aşı immünojenitesi ¹ artırabilirsiniz aşı antijenleri sebat uzatabilir. Çeşitli biyo-bozunabilir polimerler aşı dağıtım araçları ¹ olarak ele alınmıştır, özellikle de, polianhidrid partikülleri stabil protein antijenleri arasında sürekli bir şekilde tahliye edilmesini sağlayacak ve antijen sunan hücreler aktif hale getirmek ve bağışıklık yanıtı ^2-12 modüle etmek için yeteneğini göstermişlerdir.

Bu aşı taşıyıcıların moleküler tasarım polimerin özelliklerinin rasyonel seçimi gibi uygun bir hedef ajanların eklenmesi entegre gerekiyor. Ligandlar ve fonksiyonlandırılmış parçacıklar hedefliyorsunuz Yüksek throughput otomatik imalat geniş bir r çalışma yeteneğini artıracak güçlü bir araçtırözelliklerinin ange ve tekrarlanabilir bir aşı uygulama araçları tasarımına yol açacaktır.

Bağışıklık hücreleri belirli reseptörleri tarafından kabul olma yeteneğine sahip ligandların hedefleme Ayrıca ^10,11,13 C-tipi lektin reseptörleri (CLRs) üzerine karbonhidrat mevcut tanıması örüntü tanıma reseptörleri (PRR) olan modüle ve kişiye bağışıklık yanıtlarını gösterilmiştir patojenlerin yüzey. CLRs ile bağışıklık hücreleri antijene uyarılması ve daha da T hücresi aktivasyonu için ^14,15 sonraki sunum geliştirilmiş interne sağlar. Bu nedenle, karbonhidrat molekülleri immün yanıtın çalışmada önemli bir rol oynar, ancak bu biyomoleküllerin kullanımı sıklıkla yapısal olarak iyi tanımlanmış ve saf karbonhidrat kullanılabilirlik eksikliğinden muzdarip. Çözüm fazlı reaksiyonlar iteratif dayalı bir otomasyon platformu anlamlı derecede düşük b kullanarak bu zorlu sentetik moleküllerin hızlı ve kontrollü sentezi etkinleştirebilirsinizGeleneksel bir katı-faz yöntemleri ^16,17 'den blok miktarlarda uilding.

Bu yazıda böyle bir ara arıtma için fluorous katı-faz ekstraksiyon ile mannoz tabanlı ligandları olarak oligosakkarid otomatikleştirilmiş bir çözüm-faz sentezi için bir protokol rapor. Karbonhidrat bazlı hedeflemeyi ajan yapmak için otomatik yöntemler geliştirilmesi sonra, daha önce açıklandığı gibi ¹⁰ LabVIEW tarafından işletilen bir otomatik robotlu kurulum istihdam polianhidrid Nano partikülleri yüzeyinde bağlılığını yöntemleri açıklanmaktadır. Karbonhidrat ile yüzeyi fonksiyonlandırmalar CLRs ^10,11 hedefleme ve ortaya çıkarmak bir çoklu-parametrik sistemi ile ilişkili karmaşıklıklara büyük bir değer (Şekil 1a) olacak kadar imalat yönteminin verim artan etkinlik göstermiştir.

Protocol

1. Yüksek verim Karbonhidrat Sentez

1. Önce dimannoside ve otomatik sentezi, uygun bir şekilde korunan şeker donör, genellikle trichloroacetimidate, ve alıcı, özellikle bir alkenil fluorous alkol için tezgah-üst sentezlenir.
2. Bir program dimannoside arasında otomatik sentezi için yazılmıştır. Temel otomatikleştirilmiş prosedürün bir şematik Şekil 2 'de gösterilmiştir. Program, bu promotör eklenmesinden önce, verici ve alıcı bir karışımı, en azından 30 dakika süreyle karıştırıldı sağlanır.
3. Sentetik donör, alıcı ve trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate çözeltileri diklorometan içinde yapılır. Toluen ve diklorometan glikozilasyon reaksiyonlar için, en sık kullanılmaktadır.
4. Ayrıca,% 80 metanol ve% 100 metanol içindeki geçici koruyucu gruplarının korumasının kaldırılması için reaktifler çözeltileri hazırlanır.
5. Programın başlamasından önce, emin relatOdadaki ive nem otomasyonu odacık içinde% 30 ya da daha düşüktür. Yüksek nem glikozilasyon reaksiyonlar için zararlıdır.
6. Program başladıktan sonra, robot kol sırayla reaksiyon şişeye donör ve alıcı çözümleri aktarır. Daha sonra karışım, 30 dakika boyunca karıştırıldı.
7. Robotik kol karışımı içine trimethylsilyltrifluoromethanesulfonate arasında 0,2-0,3 benzerleri aktarır Sonra, tipik olarak oda sıcaklığında, -20 gibi düşük sıcaklıklarda ° C de elde edilebilir. Reaksiyon karışımı 30 dakika boyunca karıştırıldı.
8. 30 dk sonra reaksiyon durduruldu ve küçük bir alikotu reaksiyon ilerlemesini izlemek için çıkarılır. Tamamlanmaz, reaksiyon devam edilebilir ve sonuçta gerekli süreyi modifiye edilebilir.
9. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, reaksiyon karışımı saflaştırılması için C'de ₈ F _{17-değiştirilmiş} silika jel içeren fluorous katı faz ekstraksiyonu (FSPE) kartuşlar transfer edilir.
10. Sepetisırtlar birinci non-fluorous fraksiyonu kurtulmak için% 80 metanol-su karışımı (8 mL) ile yıkanır.
11. Sonra kartuşlar istenen fluorous-etiketli ürünü elde etmek için% 100 metanol ile yıkanır. Ek saflaştırma isteniyorsa, makinenin durduruldu ve reaksiyon ürünü (ler) ilave yoluyla saflaştırma için çıkarılabilir.
12. Arıtma döngüsü sonra, robot kol reaksiyon şişeye sodyum metoksid saçıyor. Reaksiyon 2 saat boyunca karıştırıldı. Tam edilmediğinde, reaksiyon yeniden daha uzun bir süre boyunca devam edilebilir ve sonuçta gerekli programlanmış bir süre modifiye edilebilir.
13. Reaksiyonun tamamlanmasından sonra, ürün FSPE ile saflaştırılır ve daha sonra kalan suyu uzaklaştırmak için ardından buharlaştırma ile susuz tolüen içinde çözünmesi tabi tutuldu.
14. İstenen zincir uzunluğu hedef molekül elde edilir kadar daha sonra çevrimi (adım 6-13 arası) tekrar edilir.
15. Otomasyonu elde edilen ürün th korumalı olduğuen fazla saflaştırılmış ve tamamen gibi nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi gibi teknikler ile karakterize edilmektedir. Genellikle patlayıcı hidrojen gazı ve paladyum içerir, çünkü son hedef moleküle korumasının giderilmesinden tam (tüm kalan koruyucu grubun çıkartılması) daha sonra, bir kural olarak otomasyon platformu dışında tamamlanır. Nihai korunmasına son verme işlemi otomasyon platformu dışında tezgah üstü üzerinde gerçekleştirildi. Birinci aşama, bir karboksilik asit ile üretilen aldehit oksidasyonu ile takip fluorous etiketi çift bağın ozonlanmasından idi. Ürün kolon kromatografi ile saflaştırıldı. Son adım paladyum katalizli hidrojenasyon ile benzil eter gruplarının korumasının kaldırılması idi. Ürün, saf nihai ürün elde etmek için paladyum kurtulmak için selit yastığı içinden geçirilmiştir.

2. Yüksek verim Nanopartikül Yüzey fonksiyonlandırmalar

1. Yüksek verim polimer sentezi ve nanoparçacık fabrikasyon aynı pr takip yapılırotocol ve robotik kadar Petersen ve ark ¹⁹ tarafından tarif ayarlanır. partikül imalatı için kullanılan kopolimer sistemleri sebasik asit (SA) ve 1,6-bis (para-karboksifenoksi) heksan (CPH), ve 1,8-bis (dayanmaktadır para-karboksifenoksi) -3,6-dioxaoctane (CPTEG) ve CPH. Kullanılmıştır robotik yerleştirme tertibatı şematik temsili Şekil 1b sunulmuştur.
2. Nanoparçacık fabrikasyon ardından, nanoparçacık kütüphane ile tüpler içeren tutucu lineer aktüatör sahneye tutturulur.
3. Polianhidrid parçacıklarının yüzeyine karbonhidrat tutturulması için, iki ardışık reaksiyon oluşan bir amin-karboksilik asit bağlama reaksiyonu ²⁰ gerçekleştirilir.
4. Birinci reaksiyon için, ilk programlanabilir şırınga pompası şırınga 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) ve benzerleri 10 (denklem) (parçacığın yüzey üzerinde ortalama mol karboksilik asit konsantrasyonunun eşdeğer) ile doldurulmuştur-carbodiimide hidroklorür (EDC) ve 10 eq. bir sulu çözelti içinde etilendiaminin, ikinci programlanabilir şırınga pompası şırınganın 12 eq ile yüklenir iken. sulu çözelti içinde N-hidroksisüksinimid (NHS).
5. LabVIEW programı kullanarak, reaktif süspansiyonlar nanoparçacık kütüphane * yatırılır.
6. Sonra, her bir numune sonicated edilir (40 Hz 30 s) ve tüp tutucu robot platformu kopar.
7. Nanoparçacık süspansiyonlar 4 ° C'de sabit dönüş ile 9 saat süreyle inkübe edilir **
8. Reaksiyon süresi tamamlandıktan sonra, tüpler santrifüjlendi (5 dakika boyunca 12.000 x g) ve iki yıkama işlemleri uygulamaya robotik istasyonundan geri gönderilir.
9. Ikinci bir şırınga pompası şırınga soğuk su ile doldurulur ise yıkama için, bir şırınga boş ve ilk programlanabilir şırınga pompası yerleştirilmiş kalır. Her bir tüp içinde süpernatan boş bir şırınga pompası ve ikinci yataklarının soğuk su içine geri çekilir.
10. Nano HomojenizasyonAdım 2,6 tarif edildiği gibi parçacık süspansiyonu yapılır. Tüpler daha sonra santrifüj edilir (5 dakika boyunca 12.000 x g) ve 2,9 adım tarif edildiği gibi ikinci bir yıkama adımı gerçekleştirilir.
11. İkinci reaksiyon için, iki biriktirme adımları kullanılır. Birinci yerleştirme adımda, 12 eq. EDC bir pompa ve 12 eq ile yüklenir. NHS ikinci pompa ile yüklenir.
12. İkinci yerleştirme basamağı 10 eq içerir. Birinci ve ikinci pompaları (yani, galaktoz, laktoz ya da di-mannoz) ve *** 10 eq ile üçüncü bir pompa, bir spesifik bir sakarit. ve glikolik asit (kontrol olarak kullanılmıştır ****).
13. 4 ° C'de adım 2.6 'da açıklanan ve sürekli rotasyon ile 9 saat inkübe olarak Nanopartikül süspansiyonlar homojenize edilir
14. Reaksiyon süresi tamamlandıktan sonra adım 2.8, 2.9 ve 2.10 'da anlatıldığı gibi, bir yıkama adımı gerçekleştirilir.
15. Fonksiyonlandırılmış nanoparçacık kütüphanesi sonra, en azından 2 saat boyunca kurumaya bir vakum hücresinin yerleştirilir.
16. Fonksiyonlandırılmış nanopartiküller sonra karakter olanX-elektron Spektroskopisi ve sırasıyla yüzey bileşimi ve sakarit konsantrasyonunu belirlemek için yüksek bir verim fenol-sülfürik asit deneyine göre ized. Elektron mikroskobu ve dinamik ışık saçılımı Tarama tane boyutu, boyut dağılımı ve yüzey yükü belirlemek için kullanılır.

Notlar: * Biriktirme hacmi her tüpte bulunan nanoparçacıkların kütlesi ile değişir.
Birinci ve ikinci reaksiyonlar için ** Reaksiyon süresi, nihai konsantrasyonu sakarit ayarlamak için değiştirilebilir.
*** Her sakkarit istenen gruba bağlı olarak test tüpleri içine yatırılır.
Koruması giderilmiş sakaritlerin zaten nanoparçacık yüzeyine daha takılabilir kovalent olarak bağlanmış bu molekülün, beri **** karbonhidrat tutturulması için bu çalışmada kullanılan belli bir tepkime için, glikolik asit, bir bağlayıcının kontrol olarak kullanılmıştır.

3. Temsilcisi Sonuçlar

FulŞekil 2 de gösterildiği ly korunan dimannoside otomasyon platformu kullanılarak sentezlenmiştir. Sentezli bir bileşim çözücü olarak kullanarak, bir _CDCl3 VXR 400 MHz spektrometre ¹ H NMR ile karakterize edilmiştir. NMR spektrum Şekil 3 'de gösterilmiştir.

Polianhidrid yüksek verimlilik nanoparçacık imalat ve işlevsel kullanmak burada açıklanan nanoparçacıklar, dimannose, laktoz ve galaktoz eki başarıyla ^{10, 11} yapılmıştır. Bu set up kullanarak, optimum reaksiyon koşulları (yani, reaksiyon sıcaklığı ve zaman) istenen nanoparçacık fonksiyonlandırmalar ve morfolojisi ulaşmak için belirlenmiştir. Reaksiyon 4 azından gerçekleştirildiği zaman ° C yerine, oda sıcaklığı arasında, nanoparçacık yığılmasında bir azalma ile SEM ile gözlenmiştir (veri gösterilmemiştir). Di-mannoz veya biriyle CPH nanopartiküller: Tablo 1 fonksiyonlandırılmış 50:50 CPTEG karakterizasyonu temsilcisi sonuçlarını gösterir4 de sentezlenen laktoz, ° C. Veri fonksiyonlandırmalar nedeniyle ortalama nanoparçacık çapı küçük bir artış gösterir. Olmayan fonksiyonlandırılmış nanopartiküller yaklaşık bir negatif zeta potansiyeline sahipti. -20 MV, fonksiyonlandırılmış parçacıklar nanoparçacık yüzeyinin başarılı fonksiyonlandırmalar gösteren, pozitif zeta potansiyel değeri gösterdi. Laktoz ve di-mannoz hem de nötr şeker olmakla birlikte, etilen gelen serbest amin gruplarının sakaritlerin bağlamak için kullanılan bağlayıcı pozitif zeta potansiyelinin sorumlu olabilir diamin.

Reaksiyon zamanı nanopartiküllerin son morfolojisi ve elde şeker bağlanma derecesi hem de etkileyebilecek bir diğer değişkendir. Reaksiyon süresi ayarlayarak, nanopartiküller yüzeyine iliştirilmiş nihai şekeri konsantrasyonları Şekil 4A'da gösterildiği gibi, kontrol edilebilir. Beklenildiği gibi, 50:50 CPTEG yüzeyinde dimannose konsantrasyonu: CPH nanoparçacıklar artmıştırReaksiyon süresi ve toplam 18 saat sonra maksimum ulaşmıştır. 24 saat toplam reaksiyon zamanı ile fonksiyonelleştirilmiş Nanopartiküller fare kemik iliği kökenli dendritik hücreler (DC) üzerine CLRs hedef yeteneklerini değerlendirmek için kullanıldı. Flow sitometri iki CL reseptörleri (yani, Cire (CD209, DC-SIGN) ve mannoz reseptörü (CD206)) non-fonksiyonlandırılmış ile uyarılması sonrasında ve laktoz ve di-mannoz fonksiyonlandırılmış nanopartiküller (Şekil 4B) ifadesi değerlendirmek için kullanıldı. Hücreler laktoz ve di-mannoz fonksiyonlandırılmış nanopartiküller her ikisi ile uyarılan edildiğinde etkili hedefleme bir göstergesidir Her iki reseptör daha yüksek bir ifadesi, elde edildi. Bununla birlikte, di-mannoz-fonksiyonlu parçacıklar incelenmiştir reseptörleri için, bu bir ligant spesifite gösteren ifade daha yüksek bir seviyeye gösterdi.

Nanopartikül tipi	Ortalama Partikül Çapı (nm)	Aveöfke Parçacık ζ-Potansiyeli (mV)
Sigara fonksiyonlandırılmış	162 ± 43	-20 ± 0.6
Laktoz	235 ± 34	26 ± 2.4
Di-mannoz	243 ± 32	30 ± 4.2

Tablo 1. Nanopartikül karakterizasyonu. Sigara fonksiyonlandırılmış ve fonksiyonlandırılmış yarı elastik ışık saçılması ve zeta potansiyel ölçümleri ile karakterize edildi. Parçacık boyutu verileri ortalama değer ± üç bağımsız deneyde toplanan dinamik ışık saçılımı verilerinin standart sapma (SD) temsil eder. Zeta potansiyel veriler ortalama değer ± SD üç bağımsız okuma temsil eder. CPH nanoparçacık yüzey: zeta potansiyelin işareti olarak değiştirin ki şeker 50:50 CPTEG verimli konjuge göstermektedir.

= "/ Files/ftp_upload/3967/3967fig1.jpg" />
Şekil 1. Karbonhidrat polianhidrid nanopartiküllerin fonksiyonlandırmalar ve açıklanan yüksek verimlilik yaklaşımı ile tasarlanmış olabilir fonksiyonlandırılmış nanoparçacık kütüphanelerin bir örnek ile izlenen yaklaşımın (A) grafiksel gösterimi. (B) otomatik yerleştirme tertibatı şematik gösterimi (i) Üç KD 1000 pompaları oluşan parçacık fonksiyonlandırmalar için kullanılan, (ii) bir robot aşamada iki aktüatörler (Zaber) tarafından entegre: x yönünde hareket için bir ve diğer iki komşu raf (tüpler ve küvetler için uygun) üç aktüatörler, her yön için bir (x, y ve z) oluşan ile (iii) bir ikinci aşama robotik; y yönde hareket için. Pompalar ve beş aktüatörler toplam seri olarak bağlanmış. Aktüatörler ve pompalar LabVIEW yazılımı kullanarak bir bilgisayar tarafından işletilmektedir. Bu şema ölçek değildir.arge.jpg "target =" _blank "> büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. Otomatik grafiksel gösterimi örnek olarak mannoz kullanarak karbonhidrat sentezi iteratif.

Şekil 3. Korunan dimannoside ¹ H-NMR.

Şekil 4. (A) Sakkarit ve nanoparçacık yüzey konsantrasyonu reaksiyon süresi etkisi. Gösterilen veriler, 50:50 CPTEG: CPH nanopartiküller farklı reaksiyon bazen dimannose ile fonksiyonelleştirilmiş edildi ve reaksiyon 4 gerçekleştirildi ° C. İki bağımsız fonksiyonlandırmalar deneylerin ortalama ve standart hata gösterilir. (B) Laktoz ve di-mannoz fonksiyonlandırılmış nanopartiküllerelde ifadesi ile karşılaştırıldığında CPH nanopartiküller: Kemik fonksiyonlandırılmış 50:50 CPTEG ile uyarıldıktan sonra bu iki belirteçlerin gelişmiş ifadesi gösterdiği gibi iliği kökenli dendritik hücreler üzerinde etkili hedef DC-SIGN (Cire, CD209) ve mannoz reseptörü (CD206) non-fonksiyonlu partikülleri ile.

Discussion

Bağışıklık hücreleri için doğrudan nanoparçacık etkileşimler maddeleri hedeflemek olarak karbonhidrat etkinliği, daha önce ^{10, 11} gösterilmiştir. Laboratuvarlarımızda Önceki araştırma ve böylece daha fazla T hücre aktivasyonunun ^{10, 11} için önemli olabilir bağışıklık hücreleri aktivasyonu arttırılması, polianhidrid nanopartiküller bağlı belirli şekerler antijen sunan hücreler (APC) üzerinde farklı CLRs hedeflemek için mümkün olduğunu göstermiştir. Ancak, çeşitli parametreleri gibi polianhidrid-kimy...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isim	Şirket	Katalog numarası
Motorlu XYZ Aşama: 3x T-LSM050A, eksen başına 50 mm seyahat	Zaber Teknolojileri	T-XYZ-LSM050A-KT04
KD-1000 Tek Şırınga Pompası	New Era Pompa Sistemleri	KD-1000
Pyrex * Vista * Rimless Yeniden Cam Kültür Tüpler	Corning	07-250-125
ASW 1000	Chemspeed Teknolojileri
LabVIEW	National Instruments	776671-35
SGE Gaz Geçirmez Şırınga, Luer Loc	Sigma Aldrich	509507
XL-2000 Sonicator	Qsonica	Q55
Mini tüp rotator	Fisher Scientific	05-450-127