Yöntem makalesi

Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi

18.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/3991

⸱

20 Temmuz 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Center for Neuroscience Research, Tufts School of Medicine, 2Department of Internal Medicine, Geriatrics & Gerontology, Wake Forest Baptist Medical Center, 3Department of Medicine, Boston University Medical Center

Bu makalede

Özet

Mitokondriyal füzyon zamanla mitokondriyal ağ üzerinden photoconverted matris hedefli YFP dengelenme izleme ölçüldü. Şimdiye kadar, sadece bir hücre bir anda bir saat uzun kinetik analizine tabi olabilir. Biz aynı anda böylece veri toplama işlemini hızlandıracak, birden çok hücre ölçen bir yöntem sunuyoruz.

Özet

Mitokondriyal füzyon; mitokondriyal kalsiyum homeostazı, biyoenerjetik, otofaji ve kalite kontrolünde temel bir rol oynar. Füzyon, canlı hücrelerde mitokondrilerin bir kısmına hedeflenmiş matris içi fotoaktive edilebilir GFP'nin (mtPAGFP) fotokonversiyonu ile nicelleştirilir. Fotokonverte olan moleküllerin tüm mitokondri popülasyonu boyunca dengelenme hızı, füzyon aktivitesinin bir ölçüsü olarak kullanılır. Şimdiye kadar ölçümler, bir saat boyunca tek bir hücredeki dengelenmeyi nicelleştiren tek hücreli zaman geçimli (time-lapse) bir yaklaşım kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Burada, mtPAGFP ve düşük konsantrasyonlu TMRE (15 nm) kullanımına dayanan, daha önce yayınlanmış bir canlı hücre yöntemini ölçeklendiriyor ve otomatikleştiriyoruz. Bu yöntem, mitokondriyal ağın küçük bir kısmının fotoaktive edilmesini, 1 saat boyunca her 15 dakikada bir yüksek çözünürlüklü konfokal kesit dizilerinin toplanmasını ve sinyal yoğunluğundaki değişimin nicelleştirilmesini içerir. PAGFP eksprese eden hücreleri bulmanın kolaylığı ve fotoaktive edilen bölgelerin sinyali gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak, 15 dakikalık aralıklarda yaklaşık 10 hücre toplamak mümkündür. Bu durum, yüksek çözünürlüklü subcellular nicelleştirmeyi ve mitokondriyal davranışın doğal sitoarkitektürel ortamındaki ayrıntıları yakalamak için gerekli olan kinetik parametreleri korurken, bu analiz yönteminin zaman verimliliğinde önemli bir iyileşme sağlar.

Mitokondriyal dinamikler; solunum, kalsiyum düzenlemesi ve apoptoz dahil olmak üzere birçok hücresel süreçte rol oynar1,2,3,13. Mitokondriyal ağın yapısı, mitokondrilerin işleyişini ve hücrenin geri kalanıyla etkileşim kurma biçimlerini etkiler. Sürekli bölünme ve füzyona uğrayan mitokondriyal ağlar, yüksek derecede kaynaşmış ağlardan daha fragmente olmuş yapılara kadar çeşitli şekiller alır. İlginç bir şekilde, Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, Charcot Marie Tooth 2A ve dominant optik atrofi, değişmiş mitokondriyal morfolojiyle, özellikle de fragmente ağlarla ilişkilendirilmiştir4,10,13. Çoğu zaman, fragmantasyon sonrası mitokondriler depolarize olur ve bu durumun birikmesi hücre fonksiyonlarının bozulmasına yol açar18. Mitokondriyal fisyonun, hücreye apoptoza doğru ilerlemesi için sinyal verdiği gösterilmiştir. Ayrıca, ağın genelini sağlıklı tutmak için depolarize ve inaktif mitokondrileri ayırmanın bir mekanizmasını da sağlayabilir14. Öte yandan, mitokondrilerin füzyonu; matriks proteinlerinin, çözünenlerin, mtDNA'nın ve elektrokimyasal gradyanın paylaşılmasını sağlar ve apoptoza ilerlemeyi önlediği görülmektedir9. Mitokondriyal fisyon ve füzyonun hücre homeostazını ve nihayetinde organizmanın işleyişini nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılması gerekmektedir; bu nedenle, bu fenomenler hakkında bilgi toplama yöntemlerinin sürekli geliştirilmesi ve optimize edilmesi gereklidir.

Mevcut mitokondriyal füzyon analizleri, her birinin kendine özgü avantajları olmak üzere, mitokondriyal fizyolojiye dair çeşitli bilgiler sağlamıştır. Hibrit PEG füzyon analizi7, farklı şekilde işaretlenmiş iki hücre popülasyonunu (mtRFP ve mtYFP) karıştırır ve füze olmuş, çok çekirdekli hücrelerdeki floroforların karışma ve kolokalizasyon miktarını analiz eder. Bu yöntem değerli bilgiler sağlamış olsa da, tüm hücre tipleri füzyon yapamaz ve füzyonun stimüle edildiği koşullar, muhtemelen normal füzyon sürecini etkileyen toksik ilaçların kullanımını içerir. Daha yakın zamanda, bir lüsiferaz analizine1,5 dayanarak füzyon olaylarını gözlemlemek için izole mitokondrilerin kullanıldığı hücre dışı bir teknik geliştirilmiştir. İki insan hücre hattı, karıştığında dimerizasyonu sağlamak için bir lösin fermuarı ile birlikte Renilla lüsiferazın ya amino veya karboksi terminal kısmıyla hedeflenir. Mitokondriler her bir hücre hattından izole edilir ve füzyon yaptırılır. Füzyon reaksiyonu, enerji, uygun sıcaklık ve iç mitokondriyal membran potansiyelinin varlığında, fizyolojik koşullar altında sitozol olmadan gerçekleşebilir. İlginç bir şekilde, sitozolün füzyon derecesini modüle ettiği bulunmuş ve bu da hücre sinyalizasyonunun füzyon sürecini düzenlediğini göstermiştir 4,5. Bu analiz, füzyon mekanizmasının bileşenlerini ve ayrıca mitokondriyal dinamikleri etkileyebilecek farmakolojik bileşikleri belirlemek için yüksek kapasiteli taramalarda oldukça yararlı olacaktır. Bununla birlikte, bu in vitro analizi tamamlamak ve bu olayları hücresel bir ortamda gözlemlemek için daha ayrıntılı tüm hücre mitokondriyal analizlerine ihtiyaç duyulacaktır.

Tüm hücre mitokondriyal dinamiklerini izlemek için bir süredir kullanılan bir teknik, mitokondriyal hedeflenmiş fotoaktive edilebilir GFP (mtPAGFP) kullanımı üzerine kuruludur6,11. mtPAGFP ekspresyonu sonrası, mitokondriyal ağın küçük bir kısmı (10-20%) fotoaktive edilir ve sinyalin mitokondriyal ağın geri kalanına yayılımı, zaman ayarlı konfokal görüntüleme kullanılarak 1 saat boyunca her 15 dakikada bir kaydedilir. Her füzyon olayı sinyal yoğunluğunun seyrelmesine yol açar, bu da füzyon hızının kantifikasyonuna olanak tanır. Hücrelerde füzyon ve fisyon sürekli olarak gerçekleşse de, fisyon PAGFP sinyalinin seyrelmesine yol açmadığı için bu teknik yalnızca füzyonu izler6. Düşük seviyelerde TMRE (INS1 hücrelerinde 7-15 nM) ile birlikte işaretleme, mitokondrilerin membran potansiyelinin kantifikasyonuna izin verir. Mitokondriler hiperpolarize olduğunda daha fazla TMRE alırlar ve depolarize olduklarında TMRE boyasını kaybederler. Depolarize olan mitokondriler artık yeterli membran potansiyeline sahip değildir ve hiç füzyon yapmasalar bile, verimli bir şekilde füzyon yapma eğiliminde değildirler. Bu nedenle, aktif füzyon yapan mitokondriler bu düşük TMRE seviyeleri ile takip edilebilir9,15. TMRE sinyali taşımayan depolarize mitokondrilerin birikimi, fototoksisitenin veya hücre ölümünün bir işareti olabilir. Yüksek TMRE konsantrasyonları mitokondrileri lazer ışığına karşı çok hassas hale getirir, bu nedenle TMRE ile aşırı işaretlemeden kaçınmak için büyük özen gösterilmelidir. Eğer mitokondrilerin depolarizasyon etkisi ilgi alanıysa, mitokondrileri kontrollü bir şekilde depolarize etmek için biraz daha yüksek TMRE seviyeleri ve daha yoğun lazer ışığı kullanan bir teknik uygulanabilir (Mitra ve Lippincott-Schwartz, 2010). TMRE kaynaklı toksisitenin bir sorun olmadığını doğrulamak için, yüklenmiş hücrelerin (3-15 nM TMRE) analizde kullanılacak görüntüleme parametrelerine (belki arka arkaya 6 optik kesitten oluşan 7 stack) maruz bırakılmasını ve 2 saat sonra hücre sağlığının değerlendirilmesini öneriyoruz. Mitokondriler çok fragmante görünürse ve hücreler ölüyorsa, TMRE yerine dsRED veya Mitotracker red gibi diğer mitokondriyal markerlar kullanılabilir.

mtPAGFP yöntemi, diğer yöntemlerle görselleştirilemeyen mitokondriyal ağ davranışına dair ayrıntıları ortaya çıkarmıştır. Örneğin, mitokondriyal füzyonun; matris içeriğinin genel ağ morfolojisini değiştirmeden karışabildiği tam veya geçici türde olabileceğini artık biliyoruz. Ayrıca, füzyon olasılığının temas süresinden ve organel boyutundan bağımsız olduğunu; organel motilitesi, membran potansiyeli ve önceki füzyon aktivitesi geçmişinden etkilendiğini biliyoruz8,15,16,17.

Bu makalede, subcellular çözünürlükten ödün vermeden aynı anda birden fazla hücreyi incelemek ve veri toplama zaman verimliliğini artırmak amacıyla, mtPAGFP ve 15nM TMRE8 kullanılarak daha önce yayınlanmış protokolün ölçeklendirilmesine yönelik bir metodoloji tanımlıyoruz. Bu, otomatik bir mikroskop tablası ve programlanabilir görüntüleme yazılımı kullanımıyla mümkün olmuştur. Zeiss'in Zen yazılımı, kullanıcının mtPAGFP eksprese eden belirlenmiş birkaç hücreyi işaretlemesine ve takip etmesine olanak tanır. Bu hücrelerin her biri, belirli bir ilgi bölgesinde fotoaktive edilebilir ve konfokal kesit yığınları, belirlenen aralıklarla hem mtPAGFP sinyali hem de TMRE için izlenebilir. Programlanabilir otomatik bir tabla, CO2 içeren bir inkübatör ve PAGFP'yi fotoaktive edecek bir yöntem (ya bir multifoton lazer ya da 405 nm diyot lazer) mevcut olduğu sürece, bu protokolü gerçekleştirmek için diğer konfokal sistemler de kullanılabilir.

Protokol

1. Görüntü Plaka Hazırlık

  1. % 10 fetal bovin serumu, standart,% 1 penisilin streptomisin, 2 mM L-glutamin, 50 uM 2-merkaptoetanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM HEPES, 2 mM piruvik asit, ve 11 mM glukoz ihtiva eden RPMI ortamında kültüre INS1 hücreleri % 80 izdiham için.
  2. % 0.05 tripsin ve plakası ile poli-D-lizin kaplı coverslip dipli görüntüleme plakaları (% 30-40 izdiham) üzerine olan INS1 hücre kültürleri Trypsinize.
  3. Plakalar% 60-80 izdiham (~ 2 gün) ulaşmak ve mitokondrial matriks hedef eklemek için izin ver (COXVIII) için adenoviral PA-GFP 24 saat (İçişleri Bakanlığı = 5). Değişim medya ve hücreleri görüntüleme önce başka bir 2 gün büyümeye olanak sağlar.
  4. Görüntüleme gününde görüntüleme plakaları 7-15 nM TMRE ekleyin ve en az 45 dakika dengeye.
  5. Inkübatör bu sefer dönüş (evre üst inkübatör burada kullanılmıştır) sırasında ve mikroskop ° C'de yaklaşık 1 saat 37 denge sağlaması için bekletin. % 5 CO 2 açın.

2. Zeiss LSM 710 Konfokal Mikroskop Görüntüleme Parametreler

  1. Mikroskop dengelenmiş sahip sonra, Toplama sekmesi altında, "show el aletleri" linkine tıklayın görüntüleme paneli kurmak açın ve "kanal modu" seçeneğini seçin ve her bir "çerçeve" takip geçiş.
  2. Işık yolu panelinde, EKK ve kanal modunu seçin. Örnek simgesinden Çalışma yukarı, 690 +, ve MBS 488 "arka", MBS seçin. Panelin alt kısmında, parlak saha veya DIC kanalının görselleştirme sağlamak için "T-PMT" tercih.
  3. 490-540 nm ve TMRE boya için 580-700 nm GFP boya için aralığı ayarlayarak ışık yolu parametrelerini ayarlayarak bitirin.
  4. Satın alma modunda, × 512 piksel tarama alanı, ortalama 4x 512 kullanın ve yakınlaştırma faktörü (Eğer kalibrasyon amaçlı tutarlı tutmak istiyor olabilir) seçin.

3. Görüntüleme Parametreleri Optimize

  1. Diz, (1.4 NA) 100x objektif lens planı apochromat kullanmafototoksisite gelen mitokondri korumak için halojen ışık değil, floresan ışık, ile hücreler bizi.
  2. PA-GFP bir maksimum açık iğne deliği kullanarak hücrelerin ifade ve parlak yeşil hücreleri bulmak için tarama için ekran.
  3. PA-GFP aktif hale getirmek ve doyurmak sinyal detektör etmediğini sağlanması görüntüleme parametreleri optimize etmek için gerekli 2-foton lazer en düşük güç ara. PA-GFP sinyali birkaç z serisi için TMRE sinyali ile colocalizes olmadığını kontrol edin. TMRE sinyal kaybı mitokondriyal depolarizasyon veya fototoksisite gösterir ve hücrelerin bu özellikleri analiz için kullanılmamalıdır sergiliyor.
  4. Bir PA-GFP eksprese eden hücre bulun ve yakınlaştırma faktörü belirtin.
  5. 6 dilim (belirli bir z-odak her pozisyonda ayarlanmadığı sürece bu aralığın tüm 10 hücre karşılamak gerekir) toplamak için Z-serisi aralığı ayarlayın.
  6. Her hücre (hücre 1, hücre 2 vb) görüntüleme yöntemi kaydedin.

4. Otomatikleştir ayarlayınd Programı Taksit ve Sen 1 Saat Mitokondrial Füzyon Deneyi için Will Follow 10 Hücreleri belirtin

  1. Multitime pencerenin sol panelinde, "tasarruf" paneli seçin ve dosyaların kaydedileceği konumu belirtin.
  2. "Toplama" panelinde, tarama yapılandırma hücre 1 için kaydedilen alma yöntemi yüklemek ve z yığını onay kutusunu işaretleyin. Ayrıca "z yığını Z-orta işaretlenmiş" seçeneğini seçin.
  3. "Bloklar" panelinde, "Her yerde tek bir blok" seçeneğini seçin. Ölçülecek her aralığı için "add blok" a tıklayın.
  4. "Zamanlama" panelinde, "ilk konumu yalnızca az blok öncesi bekleme aralığı" olarak "aralık bekleyin" ve "0" seçeneğini seçin. Bloklar 2-4 Bu bölümdeki "15 dakika" olacaktır.
  5. Konumu panelinde, seçim "lokasyonlar arasında pozisyon yüklemek için odak taşımak" ve çok "seçin ve" tümünü temizlemek düzenleme yerler listesi "tercih" "yük veya 'sonraki loc' tıklayan 'loc geçmek' zaman altında. Config tarama" yerlerde "sahne motorlu.
  6. Under "Bleach" paneli, "çamaşır suyu" kutusunu tıklatın ve "config" yapılandırma dosyası tayin menü aşağı çekme gibi temel yazılım penceresinde belirlenir. Sonra, "bleaching" penceresinde, uygun fotoaktivasyon yöntemi kaydedin. Bölgelerde panelinde, bu özel hücre için ROI seçin ve pencere "ROI listesine eklemek geçerli bölge" seçerek multitime bu ROI ekleyin. Menüyü aşağı doğru "ROI" aynı konumu seçin emin olun.

Zamanlama düzgün çalışması için ve her hücrenin bir 15 dakikalık aralıklarla olması için, iki yöntem kaydedilmesi gerekir. Blok listesinde, ilk "gerçek" fotoaktivasyon yapılandırma olacak ve geri kalan iki-foton lazer kullanan bir "taklit" yapılandırma olacaktır. Ayrıca, birinci blok (= 0 BKIntv) bir gecikme sahip değildir, sadece blok olacaktır. Dolayısıyla, yöntem, bir tarama fotoaktivasyon takiben bir baz tarama ile başlar. Blokların kalanı 900 sn BkIntv var veher noktada zamanlama tutarlılığı korumak için tıpkı süresi 0 sn iki tarama vardır.

  1. Zaman içinde takip edilmesi gereken 10 hücrelerin her biri için, bu sıra gerçekleştirin:
    Ifade eden bir PAGFP bul kendi görüntüleme yöntemi hücre kaydetmek
    Yer sahne pozisyon paneli-işaretlemek, görüntüleme yöntemi belirtin
    Ana ROI panel seçim özel ROI paneli-kaydedebilir ve aynı zamanda yatırım getirisini kutusuna yüklemek photoactivated Bleach olmak için ilgilenilen bölge:
    ROI Erase ve 1 tarama zum sıfırlamak
    Sonraki hücre bulun ve zoom ayarı
    Sonraki 9 hücreler için işlemi tekrarlayın

Her aşamada yer ve tüm blokları ilişkili uygun görüntüleme yöntemi (tarama yapılandırma) olduğundan emin olun. Ayrıca geri kalan bir "taklit" yöntemi içeren süre her yerde ilk blok uygun fotoaktivasyon yöntemine karşılık emin olun. Son olarak, "Çalıştır" seçeneğini seçin.

5.. PA-GFP Sinyal yoğunluğu analiz

  1. photoactivatable-GFP sinyali kırmızı TMRE sinyali ile colocalizes hangi hücreler için, PAGFP görüntüleri (burada Metamorph kullanın) arka plan çıkarmak.
  2. Sonra excel verileri ve her zaman noktasında z-yığınlar için ortalama yoğunluğunu hesaplamak. Herhangi bir sinyal var optik bölümleri atın.
  3. Orijinal photoactivated sinyalinin yüzdesi hesaplanarak, her z-yığın sinyali seyreltme ölçün.

Her bir veri noktası, her bir zaman noktası için çift z-yığın bilgileri ile sonuçlanan, iki kez taranan ve kaydedilmektedir. Z-yığın değerleri kabul olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, bu bir sorun (örneğin odağı, hücre hareketi) göstergesidir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bir füzyon olayı aktive ve aktive olmayan PA-GFP mitokondri arasında oluştuğunda, mitokondrial matriks içinde PAGFP olmayan etiketli matriks ile karıştırır ve daha geniş bir alana seyreltilmiş olur, sinyal azalanyoğunluğu (Şekil 1A). Mitokondriyal füzyon dengelenme (yaklaşık 1 saat) ulaşıncaya kadar INS1 hücresinde, sinyal yoğunluğunda önemli bir azalma, her 15 dakikada gerçekleşir. Şekil 1B hücre PA-GFP ve TMRE sinyallerin hemen hemen tam ko sergileyen dikkat ediniz. Bu yöntemlerde TMRE çok düşük bir yoğunluğu (15 nM) ile PAGFP fotoaktivasyon hedef yardımcı olmak için, ve aynı zamanda hücre sağlığı izlemek için kullanılır. Bu da fototoksisite veya ölmekte olan bir devlet hücreleri gösterir, çünkü depolarize mitokondri bir zenginliği ile Hücreleri PAGFP ve TMRE eksik kolokalizasyon sahip olacak ve analiz edilmesi gerekir.

~ Mitokondriyal hacminin% 15 aktif olduğunda mitokondriyal füzyon için Denge süresi genellikle INS1 hücrelerde 1 saat. Bazen, küçük bir alanda aydınlatılır bile, mitokondrinin en dolayı daha da füzyon tespit etmek zordur, bu durumda son derece, ağ olmak üzere photoactivated haline. Diğer hücre tipleri farklı alışım kez gösterebilir ve mitokondriyal dinamiğini karakterize etmek için kısa aralıklarla ve uzun bir süre boyunca test edilmelidir. Mitokondriyal füzyon inhibe etmek için, hücreler, bir lipotoxic ortam içinde yerleştirilebilir. Bu, daha önce 0.4 mM fragmanları mitokondri palmitat olduğunu gösterdi, ve mitokondriyal füzyon 9 inhibe edilmiştir. Bu etki, mitokondri parçalanmış Şekil 2, görülebilir, fakat mtPAGFP bir sinyal normal koşullar (Şekil 1) altına kadar değişmez. Bu nedenle, PA-GFP sinyali seyreltme yerine bölünme daha mitokondriyal füzyon bağlı olması olasıdır. Diğer hücreler türleri, biz böyle mitokondriyal füzyon 14 için gerekli olan OPA1 susturmak gibi mitokondriyal parçalanma uyardığı bilinen diğer yollarla kullanmanızı öneririz.

figure-protocol-1
Şekil 1.. a mitokondriyal füzyon deneyi sırasında fotoaktivasyon sonra, PA-GFP sinyali Tipik seyreltme. A. PA-GFP tedricen selektör bu projeksiyon görüntü görülebilir olarak artan bir alanı üzerine proteinin seyreltme yol açan mitokondriyal füzyon olaylar yüzünden hale 6 optik bölümlerde her 15 dakikada bir miktarı ile. PA-GFP B. TMRE mitokondri depolarize aktif olmadığını göstermektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-protocol-2
. Mitokondrial füzyon 0.4 mM palmitat ile inhibe Şekil 2 PA-GFP seyreltilmesi azaltır. Zamanla değişmeyen bir sinyal yoğunluğu ile kısa mitokondri gösteren 6 optik bölümleri A. Projeksiyonları. TMRE PA-GFP B. kolokalizasyon mitokondrinin değildir gösterir dePolarize. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Tartışma

Edinim fotoaktivasyon sonra her 15 dakikada oluşursa Bu yöntem, bir anda yaklaşık 10 hücre görüntüleme sağlar. Hücrelerin tam sayısı bir mtPAGFP ifade kültürü çanak içinde hücreleri, ve nasıl hızlı bir şekilde tüm yazılım parametrelerini bulmak ve işaretlemek mümkün olduğu kadar hızlı bağlıdır. Belirlenen z-yığın marjları tüm hücreler için geçerli olacak, çünkü otomasyon sorunsuz yapmak için hücrelerin bir tabaka kullanılmalıdır.

Bu ilk fotoaktivasyon alanın büyüklüğü Denge süresi yönetecektir. Mitokondriyal füzyon ölçmek için edebilmek için, bu ağ geri kalanına sinyalinin zaman içinde yayılması izlenebilir olduğu gibi, ağ sadece% 10-20, photoactivate için önemlidir. Şebekenin çok photoactivated ise, tam bir füzyon çok hızlı gerçekleşirse olasıdır, ve olay ele alınmayacaktır.

Extreme bakıma alınmalıiki-fotonlu lazer lazer güç aynı zamanda mitokondriyal depolarizasyonu yol açar fototoksisite önlemek için TMRE konsantrasyonu ayarlanır. MtPAGFP sinyal TMRE sinyali ile colocalizes sağlanması fototoksisite ve genel hücre sağlığı 8,15 değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Epifluoerescent ışık ile aydınlatma kaçınılmalıdır. MtPAGFP salgılayan hücrelerin ararken düşük güç 488nm uyarma ile tararken, iğne deliği maksimum açık olmalıdır. PA-1 saat boyunca GFP sinyali ölçmek için, ancak herhangi bir hücre 8 zor olabilir oversaturate için yeterli photoactivate için iki-fotonlu lazer güç ayarlanması. Bir kez otomatik program başlatılır Ancak, zaman bu optimizasyon adımda harcanması gerektiğini, bunun daha fazla hücre seçmek için, onu durdurmak ve devam ettirmek için sıkıcı bir iştir.

Kalite kontrol için, diferansiyel müdahale kontrast (DIC) satın alma hücreleri üzerinde odak izlemek için görüntü (ya da iletilen ışık) çok olabiliryardımsever ve aynı zamanda tarama sırasında immersiyon yağı oluşan kabarcıklar algılamak için iyi bir yol, bu bazen sahne hareketlerinden olur.

Bu yöntemi kullanarak mtPAGFP etiketlenmemiş olanlar için photoactivated mitokondriden mitokondriyal matriks protein hareketin tek yönlü verileri toplayan rağmen, diğer işlemler incelemek için bu teknik kullanmak için makuldür. Örneğin, özel florokromlar ABC-me, 15 çözünür matriks protein karıştırma farklı bir zaman ölçeği üzerinde oluştuğu bir füzyon için gösterildiği gibi, olayların füzyon sırasında belirli bir hareketini izlemek zar proteinleri eklenebilir.

Açıklamalar

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Zeiss, Inc tarafından desteklenmektedir

Teşekkürler

Biz Neuroscience Araştırma Merkezi Tufts, P30 NS047243 (Jackson), Boston Üniversitesi Tıp Kampüsü, Link Tıp Corporation Disiplinlerarası Biyomedikal Araştırma Evans Center tarafından desteklenen Mitokondri Affinity Araştırma Ortak (mtARC) ve bu çalışmaları desteklemek için Zeiss teşekkür ederim.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
COXIII-adenoviral PA-GFP Dr Lippincott-Schwartz
TMRE Invitrogen T669
Zeiss LSM 710 konfokal Zeiss

Kaynaklar

  1. Braschi, E., McBride, H. M. Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism. Bioessays. 32, 958-966 (2010).
  2. Chan, D. C. Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development. Cell. 125, 1241-1252 (2006).
  3. Chan, D. C., Detmer, S. A. Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).
  4. Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).
  5. Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation. Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).
  6. Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis. J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).
  7. Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins. Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).
  8. Molina, A. J., Shirihai, O. S. Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein. Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).
  9. Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis. Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).
  10. Otera, H., Mihara, K. Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics. J. Biochem. 149, 241-251 (2011).
  11. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  12. Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators. BMC Biol. 8, 100(2011).
  13. Sheridan, C., Martin, S. J. Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis. Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).
  14. Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27, 433-446 (2008).
  15. Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).
  16. Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view. Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).
  17. Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).
  18. Twig, G., Shirihai, O. S. The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy. Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

mtPAGFP YöntemiKonfokal Mikroskopi GörüntülemeMitokondriyal FotoaktivasyonTMRE BoyamaZ-Yığını KazanımıOtomatik Mikroskopi SahnesiSinyal Şiddeti KantifikasyonuMitokondriyal Dinamik AnaliziCanlı Hücre Görüntüleme
Paralel Konfokal Mikroskop kullanarak birden fazla Hücre Kinetik Veri Kazanılması A Daha hızlı, Yüksek Çözünürlük, MTPA-GFP tabanlı Mitokondrial Füzyon Deneyi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.