Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

Özet

Planaria arasında tanımlanmış ve tutarlı bir büyüklükte doku aşılama için etkili bir yöntem tarif edilmiştir. Ayrıca nakli için kullanılan immobilizasyon tekniği canlı hayvanların kısmi ışınlanması için kurşun kalkanlar, ile birlikte, nasıl uyarlanabileceğini bir açıklama dahildir.

Özet

Planarian, bir tatlı su yassı solucan, metazoan rejenerasyonu ve kök hücre biyolojisi ^1,2 diseksiyon için güçlü bir sistem olduğu kanıtlanmıştır. Herhangi bir eksik veya hasarlı dokuların Planarian rejenerasyon neoblasts ³ olarak adlandırılan yetişkin kök hücreler sayesinde mümkün olmaktadır. Bu kök hücreler kesin pluripotent ve bütün bir hayvan ⁴ yeniden yapılandırılması ve tek başına sahip olduğu gösterilmiş olsa da, kök hücre sayısı ve hücresel davranışları dinamikleri içinde heterojenite büyük ölçüde hâlâ çözülememiştir. Sayıda ve planarian vücut planı boyunca kök hücrelerin geniş dağılımı nedeniyle, in vivo moleküler ve işlevsel çalışması için kök hücre subpopülasyonunun işlenmesi için gelişmiş yöntemlere ihtiyaç vardır.

Doku nakli ve kısmi ışınlama planarian kök hücrelerin bir alt daha fazla çalışma için izole edilebilir hangi iki yöntem bulunmaktadır. Her tekniğin avantajları vardır. Tsorun nakli ya doğal genetik olarak farklı olan veya daha önce farmakolojik tedavi edilmiştir naif bir konak, içine, kök hücrelerin giriş için izin verir. Alternatif olarak, kısmi ışınlama bir yara getirilmesi veya doku bütünlüğünün herhangi bir makat olmayan, kök hücrelerin yoksun doku bitişik bir ev sahibi, içindeki kök hücrelerin izolasyonu sağlar. Bu iki yöntem kullanarak, tek bir hücrenin özerk ve özerk olmayan faktörleri araştırmak için böyle çoğalma, farklılaşma ve göç kontrolü kök hücre fonksiyonları.

Doku nakli ^5,6 ve kısmi ışınlama ⁷ ikisi de bugün çalışmanın altında kalması planarian rejenerasyon ilgili soruların çoğunu tanımlamada tarihsel olarak kullanılmıştır. Ancak, bu teknikler önceki yöntemlerin zahmetli ve tutarsız doğası gereği az kullanıldığı kaldı. Burada sunulan protokolleri bir zaman azalan ileriye atılmış büyük bir adımı temsilnd tekrarlanabilir yüzde 100 yaklaşırken etkinliği ile aşılanmış hayvanlardan ya da kısmen ışınlanmış sayıda üretmek için gerekli olan efor. Biz büyük hayvanların kültür, immobilizasyon, kısmi ışınlama, doku nakli için hazırlık ve hayvan kurtarma optimizasyonu kapsar. Bundan başka, burada açıklanan çalışma en geniş bir şekilde araştırılmıştır planarian, Schmidtea mediterranea ile kullanım için kısmi irradyasyonu yöntemin birinci uygulamasını göstermektedir. Ayrıca, planaria uygulanan aşılama etkili doku uzun memeliler ⁸ erişkin kök hücre potansiyelini test edilmesinden ve altın standart yöntem olmuştur yeniden çoğalması tayinlerde naif ya da tedavi edilen kök hücrelerin altgrupları, fonksiyonel test için kapıyı açar. Bu tekniklerin yaygın olarak benimsenmesi hiçbir doku homeostazında ve rejenerasyon sırasında erişkin kök hücrelerin hücresel davranışları daha iyi anlayabilmek için kurşun kuşkusuz olacaktır.

Protokol

Not: Bu protokol potansiyel olarak tehlikeli maddelerin kullanımı (kurşun ve chloretone) öneriyor. Acquire, okumak ve tüm potansiyel olarak tehlikeli maddeler için MSDS izleyin.

1. Hayvan Kültür, Seçimi ve Hazırlama

1. Hayvan yetiştiriciliği ve işleme kullanımı planarian su (1X Montjuïc tuzları ⁹⁾ ve plastik transferi pipetler için.
2. Normal kültürü koşulları altında ¹⁰ laboratuarda yükseltilmiş olduğunda cinsel biyotip Schmidtea mediterranea kullanılabilir. Gerekli boyutta aseksüel örnekleri üretmek için, S. mediterranea ⁹ kullanımdan önce 1-2 ay süreyle üçlü normal bir frekansta (2-3 haftada) için çift de beslenen edilmelidir normal koşullar altında, oda sıcaklığında, yükseltilmiş. Alternatif olarak, normal frekans üzerinden beslenen aseksüel hayvanların ortalama büyüklüğü artırmak için süresiz olarak 10 santigrat derecede muhafaza edilebilir.
3. 1 ila 2 cm arasında olan hayvanları seçinuzunluk ve 2 mm 'den daha geniş sonra hayvanlar kullanılmadan önce, 3-7 gün açlık.
4. Tasarlanan konaklar, donörler, kısmen veya ışınlanmış hayvanlar üzerinde herhangi bir farmakolojik veya radyolojik tedavi yapılması halinde, bu noktada tedavi (ler) gerçekleştirmek.
5. Farmakolojik tedavilerin hayvan besleme gerekli olduğu takdirde yapıldı, hayvanlar kullanımdan önce ilave bir 3-7 gün açlık.

2. Çözümler ve Malzeme Hazırlanması

1. Planarian su içinde% 0.1-0.2 w / v chloretone eriterek ve buz üzerinde bir çözüm soğutma ile chloretone çözeltisi, hafif bir lokal anestezik, hazırlayın.
2. Kısmi ışınlama yapıldığı takdirde sadece 2.7 adıma geçin. Doku nakli için 2.3 adıma geçin.
3. Bir Bunsen beki kullanarak, 1-2 cm greft, 90 kapiler tüpler ° açı alacaksınız konak bir delik oluşturmak için kullanılan greft doku kesmek için kullanılan 0.75 mm iç çap, ve 0.7 mm dış çapı, viraj adet bitiminden itibarench tüp. Malzeme tasarrufu için, her kılcal tüpün her iki ucu bükülür ve iki araç üretmek için yarım onları kırmak. Alev tüplerin uçları çok dikkat edin.
4. Belirtilen boyutları için aşağıdaki belgeleri Cut:
   • Siyah filtre kağıdı (. 2.5 cm x 1.5 cm dikdörtgenler yaklaşık şeklinde kesilmiş)
   • Whatman # 3 filtre kağıdı (. 2 cm x 0.5 cm dikdörtgenler yaklaşık şeklinde kesilmiş)
   • Kimwipe (katlanıp wads yaklaşık oyulmuş. 3 cm x 0.5 cm x 4 kat)
   • Sigara haddeleme kağıt (sakız bandını çıkarın ve dikdörtgenler yaklaşık oyulmuş. 3 cm x 2 cm)
5. Modifiye Holtfreter en çözeltisi (3.5 g / L NaCl, 0.2 g / L NaHCO _3, 0.05 g / L KCI, 0.2 g / L MgSO _4, 0.1 g / L _CaCl2, pH 7.0-7.5) hazırlanması ve en kazein Holtfreter çözeltisi ve soğuk doymuş Her iki ila 4 ° C.
6. Peltier soğutucusu plakası veya bir mikroskop altında bulunan diğer soğutma cihazı bir parafilm kare ile yere katlanmış bir Kimwipe takın. Soğutulmuş Holtf ile Kimwipe Doymuşreter çözümü ve yer Kimwipe iki siyah filtre kağıdı dikdörtgenler.
7. Whatman # 2 filtre kağıdı ile hat Petri. Holtfreter çözümü ile filtre kağıdı ıslatın ve buz üzerinde yemekleri soğutun. Kısmi ışınlanması için daha büyük bir çanak ve filtre kağıdı astar kullanılabilir.

3. Anesthetization ve immobilizasyon

1. Çanak içine soğutulmuş chloretone çözüm ve pipetle solucanlar ile Petri doldurun. Nakli için sadece bir bilgisayar ve bir seferde bir donör uyutmak. Kısmi ışınlanması için çoğu (n> 10) hayvanlar anda anestezi olabilir.
2. Onlar hareketsiz hale kadar solucanlar chloretone solüsyonda bekletilebilir izin ver (5-10 dk).
3. Soğutulmuş Holtfreter çözümü ile dolu bir çanak içine pipetleme tarafından solucanlar durulayın.
4. Soğutulmuş Holtfreter çözümü ve forseps ile yönlendirmek onları ventral yüzü aşağı doymuş siyah filtre kağıdı üzerine onları pipetleme hayvanların hareketsiz. Hayvanlar loc atabiliyorsanızOmote, aşırı Holtfreter çözümü kadar emmek, hafifçe Peltier veya soğuk plaka sıcaklığı azaltmak veya chloretone tedavi uzunluğunu artırmak.

4. Kısmi Işınlama

Not: kısmi ışınlanması için hayvanları hazırlamak için aşağıdaki adımları izleyin. Yerine nakli yapılması durumunda, bölüm 5 geçin.

1. X-ray irradiator bir üst kaynak, içine yerleştirilen bir buz kovasının içinde buz üzerinde adım 2.7 bir soğutulmuş Petri yerleştirin.
2. Onlar immobilize edildiği siyah filtre kağıdı hareket ettirerek bir Petri kabındaki vanlarda düzenleyin. Doğrudan anestezi solucanlar taşımak için forseps kullanarak onları yaralayabilir.
3. Nakliye X-ışını irradiator bir üst kaynak hayvanlar düzenlenir ve hayvanlar için katod tüpten mesafenin en aza olduğu gibi buz kovası yerleştirmek, ve böylece etkili doz oranı maksimize edilmesidir.
4. Hayvanlar ve katot t arasında pozisyon kurşun kalkanı (ler) (Şekil 1)Ube istediğiniz gibi. Shields bir 325kV X-ışını ¹¹ 97% 99 zayıflama sağlamak için kalın 4.5 ila 6 mm olmalıdır.
5. X-ışını doz sunun. Olmayan korumalı bölgelerden tam kök hücre ablasyon isteniyorsa, bir X-ışını irradiator kullanılarak 30 Gy veya daha sunuyor. Başvuru için, 30 Gy 320 kilovolt az 3.6 dakika ve 30 santimetrelik bir alan için kaynak mesafe ile Hassas Röntgen A.Ş. XRAD320 10 miliamper eşdeğerdir.
6. Hemen uygulamadan sonra soğutulmuş planarian suya siyah filtre kağıdı, transfer hayvanlar tarafından solucan işleme, tamamlandı. Planarian su siyah filtre kağıdı kendilerini çıkarmak için oda sıcaklığı ve hayvanlara ısınmasını bekleyin. Kısmi ışınlama işlemi tamamlandı.

5.. Doku Nakli

1. Bir transfer pipet ve forseps kullanarak Pelti üzerine soğutulmuş Kimwipe siyah filtre kağıdı ayrı diktörtgenlere anestezi host ve donör solucanlar düzenlemekdiseksiyon mikroskobu altında er veya soğutucu plaka.
2. 0,75 mm iç çapı kılcal tüp kullanarak donörden greft fiş kesip, forseps kullanarak, ana yol bölümünün dışında bir üzerine yerleştirin. Greft materyali kılcal tüp içinde sıkışırsa, forseps ile çıkarmak.
3. Bir 0.7 mm dış çaplı kılcal tüp ana bir fişi kullanımı ve geride deliğe forseps pozisyonu greft kullanarak.
4. Adım 2.7 hazırlanmış petri içine onun siyah filtre kağıdı dikdörtgen nakledilen ana aktarın.
5. Kazein doymuş Holtfreter çözümü ile inişli çıkışlı bir kağıt parçası ıslatın ve Şekil 2A diagramed olarak nakledilen ana üstüne yerleştirin.
6. Kazein doymuş Holtfreter çözümü ve Şekil 2B diagramed olarak nakledilen ana örten filtre kağıdı dört adet bekletin.
7. Kazein doymuş Holtfreter çözümü içinde kesme Kimwipe dört wads daldırın ve onlar üzerinde yatıyorduAdım 5.6 den filtre kağıdı (Şekil 2B). Kapağı değiştirin ve buz üzerinde Petri koydu.
8. Planarian su, kurtarmak, iyileşmek ve yenilenmesine halinde bağış solucan aktarın.
9. Tüm nakli tamamlandığında, bir gecede 10 ° C inkübatör içine nakledilen solucanlar yerleştirin.
10. Ertesi sabah, bakımı, greft rahatsız solucan ortaya çıkarmak ve planaria su dolu bir petri için (onun siyah filtre kağıdı üzerinde) aktarmak değil.
11. Ya solucan filtre kağıdı kendisini çıkarmak veya hafifçe forseps ile temizlemesine izin verin.
12. 2-3 günde bir kez planarian su değiştirin.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Hemen kısmi ışınlama planaria sonrasında normal ve etkilenmemiş görünecektir. Teslim dozu ve kullanılan kalkan geometri bağlı olarak, ışınlanmış doku geriler ve hatta ⁷ parçalanır olabilir. Korumalı dokusu bozulmadan kalmalıdır. Follnedeniyle doku regresyon ve doku bütünlüğünün kaybı, bir blastem oluşturacak ve eksik yapılar (Şekil 3A) yeniden oluşturulur. Amputasyon kısmen ışınlanan bölgede yapılıyorsa, ışınlanmış doku (Şekil 3B) (yani gerileme veya dağılmakta engellenebilir) kurtarılmış olacaktır. Yaralanmamış ve ampute olmayan ışınlanmış planaria (Şekil 3C) göre kesilmiş durumda rejenerasyon gecikecektir. Hem de 30 Gy bir X-ışını doz teslim ve kısmen ışınlanmış hayvan kullanılan kurşun kalkan ile ilgili kök hücre için in situ hibridizasyon tarafından kısmi irradyasyonu takiben 2 ila 3 gün teyit edilebilir bir desen yaralanmamış, başarılı kök hücre ablasyon oldu ise belirteç SMED-Piwi-1 ¹² (aka smedwi-1) (Şekil 4).

Nakli, nakledilen doku başarılı bir aşılama sonrası sabah bariz w olmalıev sahibi (Şekil 5A) dorsal ve ventral yüzeyleri hem uyulması olan, konak doku ithin. Bazen greft sadece ventral veya dorsal yüzeyine yapışır. Nakli tamamen başarısız olduysa, greft hiçbir işaret konak (Şekil 5B) birini dorsal veya ventral yüzeyleri görünür olacaktır. Kısa bir süre SMED-Piwi-1 (Şekil 5C öncelikle greft içinde kök hücreler var olduğunu ortaya koyacaktır için in situ hibridizasyon ölümcül radyasyon ^13,14, kök hücrelerin ablazeydi olan bir konak haline ışınlanmamış dokusu başarılı bir greft takip ). Ayrıca, ölümcül ışınlanmış hosts içine ışınlanmamış doku başarılı greft konak doku ve ev sahibi ¹⁵ uzun süreli sağkalım kurtarma neden olacaktır.

Şekil 1.. Temel bileşen genel düzenlemeKısmi ışınlanması için s. bir üst konumlandırılmış X-ışını kaynağı ile bir X-ray irradiator yılında (katot tüpü) anestezi planarian ışınlama alanında doğrudan X-ışını kaynağı altına yerleştirilir. X-ışını doz oranı maksimize etmek için, planarian ve X-ışını kaynağından arasındaki mesafenin en aza edilmelidir. Bir kurşun kalkanı katot tüpü ve pratik olarak solucan olarak yakın anestezi solucanı arasında yerleştirilmelidir. Kurşun kalkanı tasarlanan, üretilen ve yerleştirilmelidir böylece kalkanlar istenilen doku olduğunu ama tamamen solucanın kalanı gösterir. Birçok ticari sizin basit tasarım diyagramda özel kurşun kalkanlar üretecek üretmektedir; başarıyla Alpha Systems Corp (Bluffdale, UT) kullandık. Kurşun koruyucu istenen miktarda olanak sağlamak için yeterli kalınlıkta olacaktır. 320 kV X-ışını demetinin koruyucu tam yanında istenirse Örneğin, kurşun kalınlığı 4.5 ila 6 mm olmalıdır. Planarian ve kalkan konumlandırılırBir Holtfreter Kullanıcı batırılmış filtre kağıdı bir buz kovası dinleniyor Petri dizildi. Yeterince büyük bir X-ışını radyasyon alan ve aynı kurşun kalkan bir dizi göz önüne alındığında, pek çok örnekler kısmen bir kez (Resim mevcut değil) az ışınlanmış olabilir.

Şekil 2. Kurtarma odası Bina. Doku nakli kurtarma odası (A) Bir patladı görünümü, kazein doymuş Holtfreter Çözümü batırılmış sonra birbiri üstüne katmanlı tüm bileşenleri gösteriyor. (B) whatman ile iç içe yerleşim gösteren bir bitmek kurtarma odası, # 3 filtre kağıdı dikdörtgenler hangi rahatça anestezi planarian örtmek, iyileşme sırasında hareketinin önlenmesi. Kurtarma odasının dikkatli inşaat doku nakli hızlı iyileşme ve daha fazla etkinlik teşvik, hayvan hareketleri ve kuruma önler.

Şekil 3. Basit posterior kısmi ışınlama Temsilcisi sonuçları. Dubois ⁷ açıklandığı gibi, (A) Planaryalar posterior yarısında kurşun ile korumalı ve daha sonra x-ışınlarıyla maruz kalan zaman ön doku ışınlanmış ve korumalı arasındaki sınır geri gerileme gözlendi doku noktayı unpigmented blastemas oluşan ve hayvanların yeniden başladı. (B), diğer yandan, hayvanlar (A), doku regresyon gözlenmemiştir ve kalan ışınlanmış ön doku kurtarıldı gerçekleştirilir aynı kısmi irradyasyonu takiben başları kesilir üç gruba ayrılmıştır. Işınlanmamış Decapitated kontroller (C) ile karşılaştırıldığında, hayvanlarda kısmen ışınlanmış rejenere kafaları (B) başları kesilir, bununla birlikte, rejenerasyon önemli ölçüde gecikmiştir.

Şekil 4. Temsilcisi outcokısmi kök hücre ablasyon bana kısmi ışınlama sonrasında. kök hücre belirleyicisi SMED-Piwi-1 in situ hibridizasyon (DİLERİZ) In Tüm montaj olduğunu vahşi tip planaria ortaya kök hücre için ön doku hariç vücutlarının boyunca dağıttık fotoreseptör (ok) ve yutak uygun (yıldız) ^14. (A) ışınlanmış ama tam korumalı kontrol SMED-Piwi-1 için DİLERİZ planaria ışınlama izleyen üç gün vahşi tip planaria farksız bir kök hücre dağılımı gösterir düzeltildi. (B), diğer yandan, ön ve arka maruz bırakarak, sadece kısmen korumalı edildi hayvanlarda SMED-Piwi-1 arzu değil, aynı zamanda kök hücre dışı korumalı bölgelerden ablazeydi olduğunu gösterir irradyasyonu takip eden üç gün tespit edildi . Ölçek çubukları 500 mikron vardır.

Şekil 5. Exabaşarılı ve başarısız doku nakli mples. (A) üç gün Transplantasyon sonrası başarıyla transplante planarian dorsal ve ventral görüş görüntüleri yaşayın. Greft (belirtilen) dorsal ve ventral yüzeyleri hem de açıkça görülebilir ve greft-host arayüzü de karakteristik unpigmented doku ile çevrilidir. (B) Buna karşılık, başarısız nakilleri nakli sitesi (belirtilen) hiç görünür greft dokusu görüntülemek ve yerine nakli başarısız bir iyileşmiş, unpigmented, lateral yara göstermektedir. Sadece dorsal veya ventral yüzeyi yapışır A graft (A), diğer taraftan bakıldığında bir yan ve başarısız bir nakil (B) bakıldığında, başarılı bir nakil benzer olabilir. (C) vahşi tip (wt) doku ikamet kök hücre ve nakledilen kök hücrelerin ablazeydi edilmiş ışınlanmış bir konak haline aşılı zaman sonra nakli sonrası SMED-Piwi-1 iki gün, arzu tarafından vahyedilmiştirekiminin başarısını açıkça sadece greft konumu (ok başları) veya etrafında kök hücrelerin özel varlığı ile görüntülenir. Ölçek çubukları 500 mikron vardır.

Tartışma

Immobilizasyon Önemi

İmmobilizasyon tarafından bugüne kadar bu işlemlerin herhangi birinin başarıyla tamamlanması için en kritik adımdır. Planaria yanlış kısmi ışınlama öncesi immobilize edilirse, tutarsız ve kafa karıştırıcı sonuçlar üreten, kurşun kalkanı altında hareket edebilir. Hayvanlar yeterince transplantasyonundan sonra immobilize edilir, ayrıca, ev sahibi solucan olasılıkla ana düzgün iyileşmek için greft bir başarısızlıkla sonuçlanan, greft doku uzak hareket edecektir. Uygun immobili...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Genel Amaçlı Transferi Pipet	Samco	691
Kapiler tüpler (ID 0.75 mm)	FHC	30-30-0
Kapiler tüpler (OD 0,7 mm)	FHC	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34.155	VWR	500029-891
Siyah filtre kağıdı	Schleicher & Schuell	10310809
Whatman # 2 filtre kağıdı 1002-055	Fisher Scientific	09-810B
Whatman # 3 filtre kağıdı 1003-185	Fisher Scientific	09-820E
Sigara haddeleme kağıt	Zig-Zag, orijinal	NA
Petribulaşık	VWR	82050-544
Forseps DUMONT, INOX # 5	FST	11251-20
Chloretone	Sigma Aldrich	112054
Kazein	Sigma Aldrich	C3400
Shields Kurşun	Alpha Systems Corp, Bluffdale, UT	Özel tasarım
XRAD-320 Biyolojik Irradiator	Hassas X-Ray, Kuzey Branford, CT	NA