Katarakt dünyada körlüğün en önde gelen nedenidir. Güneş ultraviyole radyasyon (UVR) katarakt gelişimi için en önemli risk faktörüdür. Kadar UVR-B ile indüklenen katarakt bir hayvan modeli geliştirilmiştir. UVR, kantitatif RT-PCR ve immünohistokimyasal maruziyet: Bu yazıda katarakt oluşumu soruşturma yöntemleri açıklanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Moleküler Mekanizmalarının Karakterizasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Katarakt dünyada 1 körlüğün önde gelen nedenidir. Dünya Sağlık Örgütü ışık transferi engellediğini göz merceğinden bir karaltı olarak katarakt tanımlar. Katarakt diyabet, sigara, ultraviyole radyasyon (UVR), alkol, iyonize radyasyon, steroidler ve hipertansiyon ile ilişkili bir çok faktörlü bir hastalıktır. UVR katarakt neden olduğu güçlü 2-4 deneysel ve epidemiyolojik kanıtlar 5,6 yoktur. Biz anestezi 7 ve olmayan anestezi altındaki hayvanlarda 8 hem UVR B indüklenmiş katarakt için bir hayvan modeli geliştirdi.
Katarakt için tek çare cerrahidir ancak bu tedavinin herkes için erişilebilir değildir. Bu 10 yıl boyunca katarakt başlangıcı bir gecikme 50% 9 ile katarakt ameliyatı gereksinimini azaltabilir tahmin edilmiştir. Katarakt insidansı geciktirmek için, katarakt oluşumu mekanizmasını anlamak ve etkin önleme stratejilerini bulmak için gereklidiregies. Katarakt gelişimi için mekanizmalar arasında, apoptoz insanlar ve hayvanlar 10 katarakt başlamasında önemli bir rol oynar. Bizim odak son zamanlarda katarakt gelişimi 8,11,12 için mekanizma olarak objektif apoptoz olmuştur. Bu apoptoz yolu üzerinde UVR etkisi daha iyi anlaşılmasını katarakt önlemek için yeni ilaç keşfi için imkanlar sağlayacağı tahmin edilmektedir.
Bu yazıda, deneysel UVR-B vivo maruz kalınmasına neden olabilir nasıl katarakt açıklar. Ayrıca RT-PCR ve immünohistokimyasal araçları UVR-B ile indüklenen katarakt moleküler mekanizmaları çalışmak olarak sunulmaktadır.
Protokol
1. Ultraviyole Radyasyon Maruziyet
- 15 dakika maruz kalmadan önce, 90 mg / kg Ketalar (ketamin) ve karın zarı içinden enjeksiyon ile 10 mg / kg Rompun (ksilazin) oluşan bir karışım ile bir dişi Sprague-Dawley sıçan anestetize.
- Bir sıçan süzgeç içinde hayvan yerleştirin ve bir gövde sıkmak 13 neden olmadan sıçan immobilizasyon kadar kemerleri sıkın.
- Midriazis sebep olmak için her iki sıçan gözünde Mydriacyl (tropikamid), 10 mg / ml, aşılamak.
- O bir gözü yarısı maksimum 10 nm tam genişliği ile 300 nm arasında 14 UVR dar bir ışın karşı konumlandırılmış böylece hayvan yerleştirin ve siyah bant ile kontralateral göz kalkan.
- 15 için 300 nm dk 15 sıçan tek taraflı alt-eşik dozu 1 kJ / m 2 UVR-B Açığa.
2. Teşrih
- Önceden belirlenmiş bir süre maruz kalma sonrası (1, 5, 24 ve 120 saat) sonra, aktif kömür ile altı haftalık bir sıçan (ağırlık <200 g) kurbann dioksit ile boğularak ve servikal vertebra dislokasyonu.
- Aydınlatmak gözler. Bundan sonra, aşağı arka tarafında gözün kornea koymak. Sonra, yumruk 27 gauge kanül uygulayarak ve sklera çok yakın Merceğin zarar görmemesi için sklera teğet itin tarafından minimal bir delik. Sonra sklera arka kısmı kapalı kaldırılabilir kadar sadece limbus arkasında çevresel kesmek oftalmik cerrahi bir makas kullanın. Sonra, bir künt kavisli bir forseps ile objektif kaldırın.
- 5-10 dakika daha, artık dengeli tuz çözeltisi içinde mercek tutarak, bir mikroskop altında objektif ekvatordan silier cisim kalıntıları çıkarın.
3. Nicel RT-PCR
- 350 ul RA1 lizis tamponu (NucleoSpin RNA II, total RNA izolasyon kiti) ve 2 ml Eppendorf tüp içinde 3.5 ul β-merkaptoetanol bir karışımı içine bir mercek yerleştirin.
- Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bu karışıma, mercek tutun.
- Lensi homojenizeObjektifin sadece sert nükleus kadar bir iğne lens (korteks ve lens kapsülü lizis tamponu ile parçalanırlar edilmiştir) gelen bırakılır. Karışımı çekirdeğini çıkarın.
- Mağaza örnekleri hemen -70 ° C'de
- Örnekleri çözülme ve protokol "kültür hücreleri ve doku total RNA saflaştırılması" (NucleoSpin RNA II, total RNA izolasyon kiti) izleyin.
- Mağaza RNA örnekleri -70 ° C'de
- 2 dakika için 95 ° C, 40 çevrim için Adım 2: Her bir numune DNA yeterli kaldırma doğrulamak için, aşağıdaki koşullar (adım 1 altında bir PCR çalıştırmak 95 ° C'de 20 saniye, 55 ° C 20 sn için, 72 ° 20 saniye için C, aşama 3: 7 dakika için 72 ° C) p53 DNA spesifik primerler, ileri 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3 've 5'-ters TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' ve Taq DNA polimeraz (dNTPack), üretimi için uygun protokolü. Beklenen PCR ürünü 243 baz çifti olduğunu.
- 243 baz çifti DNA spesifik PCR ürününü algılamak için,% 1.5 agaroz jel elektroforezi çalıştırın. Hazırlamak için:TBE tamponu% 1.5 agaroz jel agaroz 3.75 g alıp TBE tamponu 250 ml çözmek. Etidiyum bromid (0.5 mg / ml),% 1.5 agaroz jel çözeltisi, 500 ml içinde 500 ul ekle. Bir mikrodalga fırında karışımı ısıtın ve agaroz çözmek için karıştırın.
Örneklerin hiçbiri% 1.5 agaroz jel elektroforezi üzerinde herhangi bir özel DNA PCR ürünlerinin ortaya çıkarmak için bulunur.
- RNA örnekleri (1 ul) konsantrasyonu ve bir Nanodrop ND-1000 spektrofotometre içinde 260 nm (RNA) ve 280 nm (protein) de absorbans numune oranı ölçülür. RNA örnek absorbans protein oranı RNA 2.0 ya da daha fazla ise, o zaman RNA numune saf. RNA örnek absorbans oranı 2.0 'den daha düşük ise, saflaştırma adımı 3,5 RNA yinele.
- 1 ug RNA, karşılık gelen örnek bir hacme al ve protokol 1. Strand cDNA sentez kiti (RT-PCR için 1. Strand cDNA sentez kiti) aşağıdaki cDNA sentezlenir.
- -20 ° C'de cDNA örneklerinde Mağaza(Bir dönem 1 ve daha fazla yıl için, -70 mağaza ° C).
- ICycler MyiQ Tek Renk Real Time PCR sistemi kantitatif gerçek zamanlı PCR çalıştırın. Yük, 1 ul cDNA örnek, TaqMan Gen Ekspresyonu Master Mix, kaspaz 3 TaqMan Gen Ekspresyonu Testi ile 96-plaka üzerine üç kez talimatlara üretimi için uygun. Yük, 1 ul cDNA örnek, TaqMan Gen Ekspresyonu Master Mix, 18s için TaqMan Gen Ekspresyonu Assay ile başka bir 96-plaka üzerine üç kez talimatları (TaqMan Gen Ekspresyonu Assay Protokolü) üretimi için uygun. Serisi üç rastgele seçilmiş açık olmayan lensler cDNA bir kısmını seyreltin. 96 çukurlu bir plaka içinde örnekten elde edilen cDNA ile birlikte seri dilüsyonları çalıştırın.
- Sonuçlarının ölçümü için standart eğri yöntemi kullanın. Eşik floresan az döngü sayısı MyiQ yazılım ölçümü olarak kullanılır. Kalibratörün göreli konsantrasyon fonksiyonu olarak eşiğinde döngü sayısı ifade standart eğri es olduğunuHer plaka seri dilüsyonları için tablished. olmayan üç kabul lens örnekleri cDNA kalibrasyonu için kullanılmıştır. CDNA ölçülen numune göreli konsantrasyonunu elde etmek için standart eğri için her bir örnek için döngü sayısı eşik ilişkilendirir. Son olarak, cDNA iç kontrol 18s için cDNA hedef göreli konsantrasyon ile ilgili olarak, hedef genlerin ekspresyon seviyesi olsun.
4. İmmünhistokimyasal Boyama
- Tespit
- PBS içinde göz (; pH 7.4 Fosfat Tamponlu Salin) teşrih.
- 20 dakika boyunca buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit (PFA) ile dolu bir tüp içinde göz koyun. Bir gün önce PFA% 4 hazırlayın. +4 ° C'de saklayın kullanımı kadar. PFA yaklaşık bir hafta taze.
- Bir mikropipet PFA ile çıkarın. Daha sonra, 20 dakika süreyle buz gibi soğuk PBS ile yıkayın.
- ° C gece boyunca +4 sakaroz% 30 göz koy.
- Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta ile dolu bir kap içine göz koyun (Doku-Tek). Kesme işlemi için uygun bir konuma göz koyun.
- Kuru buz üzerinde OCT-orta dondurun.
- -70 ° C'de saklayın kullanımı kadar.
- Kesit
- Uygun bir düzlemde kriyo-kesit için göz yerleştirin.
- Her bir lensin merkezi bir kısmı üç 5 um kalınlıkta orta sagital bölümleri kesin. Farklı bölümlerde aynı çekirdekleri boyama önlemek için sıralı bölümler arasında en az 6 bölümden atın.
- Bir bölümü kesip edildikten sonra, hafifçe üstüne bir slayt yerleştirin. Bölümü daha sonra slayt ayrılmamak gerekir.
- Kullanmadan önce kurumasını bekleyin slaytlar bırakın. Slaytlar kullanılıncaya kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
- Floresans immünhistokimya
- Numuneler oda sıcaklığında (5-10 dk) elde edelim.
- Bir PAP-kalem (Invitrogen) ile örnekler etrafında kenarları çizin.
- Bir süre (10 dk) için sınır kurumasını bekleyin.
- Mikroskop slaytlar etiketleyin.
- 1 × P rehidrate15 dakika boyunca BS.
- 30 dakika için standart blok çözelti içinde geçirgen.
- Standart blok çözüm 1:3,000 seyreltilmiş; (Cep Sinyalizasyon Teknolojisi, Inc tavşan poliklonal, bölünmüş kaspaz-3 antikor Asp175 9661) primer antikor ekleyin.
- Gece boyunca +4 ° C'de nemlendirilmiş bir odasında saklayın.
- (3 × 5 dk) pipetleme veya büyük bir banyo (> 15 dk, 1-2 değişiklikleri) daldırarak PBS içinde yıkayın.
- Standart blok çözelti içinde 1:300 oranında seyreltilmiş sekonder antikor (belirli bir emilim / emisyon spektrumunu ile anti-tavşan ikincil antikoru) ekleyin.
- (3 × 5 dk) pipetleme veya büyük bir banyo (> 15 dk, 1-2 değişiklikleri) daldırarak PBS içinde yıkayın.
- PAP-kalem lekeleri silin.
- 3 saat boyunca oda sıcaklığında nemlendirilmiş bir oda içinde muhafaza edin. Işığa maruz kalmaktan kaçının.
- Vectashield bir damla ekleyin ve slayt üzerinde bir kapak kayma yerleştirin. Kabarcıklar yapmaktan kaçının.
- Vectashield sertleşmeye (~ 20 dk) olsun.
- Bölümler i tutunanalizi kadar karanlık n.
- Kontrol grubundaki bütün bölümler primer antikorun yokluğunda işlenir.
- Bir floresan mikroskop altında birkaç saat içinde sonuç arayın.
- Bir taraftan nükleer yay her merceğin diğer tarafında nükleer yay epitel hücre 'çekirdekler sayın. Mavi tüm lens epitel çekirdekler ve yeşil kaspaz-3 pozitif boyanan görmek için ikincil antikor emisyon uyan bir standart filtre görmek için standart mavi filtre uygulayın.
- Tüm çekirdekler mercek epitelyal ve pozitif çekirdek sayısı numarasını kaydedin. Her bölüm için hücreleri üç kez sayın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Ölçümlerinde varyasyon çeşitli kaynaklardan varyans analizi ile tahmin edildi ve hayvan başına üç ölçümleri dikkate ölçümler için varyans hayvanlar için bunun% 15 mertebesinde olduğu görülmüştür. Bu nedenle, bütün lens analiz göz önüne alındığında, bu hassasiyetini artırmak için mümkün değildir. Ortogonal test 120 saat gecikme aralığının karşılık daha kısa gecikme aralıkları arasında kaspaz-3 mesajı için istatistiksel olarak anlamlı bir kontrast aydınlatılmıştır.
Vivo UVR maruzi...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu kağıt UVR-B ile indüklenen katarakt sırasında meydana gelen moleküler olayları inceleyerek sağlayan yöntemler açıklanır.
Vivo UVR indüklenmiş katarakt kullanılabilir bilgilerin çoğu albino Sprague-Dawley sıçanlara 7, 16, 17, 18, 19, deneylerden türetilen olduğu göz önüne alındığında, biz bu çalışmada albino Sprague-Dawley sıçan kullanmaya karar verdi. Sıçanların Yaş altı hafta eski oldu. Erkeklerde aksine, kadınlarda daha az alerjik idrar var, çünkü ci...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
S och Drottning ViktoriaS Frimurarstiftelse: Bu çalışma Karolinska Enstitüsünde KID-finansman, İsveç Radyasyondan Korunma Kurumu, Karolinska Enstitüsünde Göz Araştırma Vakfı, Silah och Bertil Stohnes Stiftelse, St Erik'in Göz Hastanesi Araştırma Vakfı, Ögonfonden, Konung Gustav V tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Ketalar | Pfizer | 150086 | 50 mg / ml |
| Rompun | Bayer | 022545 | 20 mg / ml |
| Oculentum Simplex | Apoteket, İsveç | 336164 | 5 g |
| Mydriacyl | Alcon | 00352 | 10 mg / ml |
| Dengelenmiş tuz çözeltisi | Alcon | 0007950055 | |
| 3.5 ul β-merkaptoetanol | |||
| NucleoSpin RNA II, total RNA izolasyon kiti | Macherey-Nagel GmbH & Co, Düren, Almanya | 740955.50 | |
| p53 DNA spesifik primerler | biomers.net GmbH | Özel yapılmış | |
| Taq DNA polimeraz, dNTPack | Roche | 04 728 866 001 | |
| Agaroz | Sigma | A5093 | |
| Etidyum bromür çözeltisi 0.5 mg / ml ' | Sigma | E1385 | |
| Nano-Bırak ND-1000 spektrofotometre | Nanodrop Ürünler | ||
| RT-PCR için 1. Strand cDNA sentez kiti (AMV) | Roche Diagnostics GmbH | 11 483 188 001 | |
| iCycler MyiQ Tek Renk Real Time PCR algılama sistemi | Bio-Rad Laboratories | ||
| 96-kuyulu plakalı | Sarstedt | 72.1979.202 | |
| TaqMan Gen Ekspresyonu Master Mix | Applied Biosystems | 4369016 | |
| Kaspaz 3 TaqMan Gen Ekspresyonu Assay | Applied Biosystems | Rn00563902_m1 | |
| 18s için TaqMan Gen Ekspresyonu Assay | Applied Biosystems | Hs99999901_s1 | |
| MyiQ yazılım | Bio-Rad Laboratories | ||
| Cleaved kaspaz-3 (Asp175) | Hücre sinyalizasyon teknolojisi | 9661 | |
| Anti-tavşan IgG | Abcam | Ab6798 | |
| Sakaroz | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Vectashield | Vektör Laboratuvarları | ||
| Evrensel Mikroskop Axioplan 2 Görüntüleme | Carl Zeiss | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 441244 | |
| 10x TBE tamponu | Promega | V4251 |
Kaynaklar
- Brian, G., Taylor, H. R. Cataract blindness: challenge for the 21 st century. Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).
- Jose, J. G., Pitts, D. G. Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure. Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).
- Söderberg, P. G. Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure. Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).
- Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice. Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).
- McCarty, C., et al. Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project. Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).
- Sasaki, H., et al. Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).
- Söderberg, P. G. Experimental cataract induced by ultraviolet radiation. Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).
- Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis. Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).
- McCarty, C. A., Taylor, H. R. A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts. Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).
- Li, W. C., et al. Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals. Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).
- Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).
- Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure. Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).
- Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. A new universal rat restrainer for ophthalmic research. Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation. Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).
- Söderberg, P. G., et al. Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD). Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).
- Michael, R. Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation. Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).
- Löfgren, S. Cataract from ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).
- Ayala, M. N. Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Dong, X. Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).
- Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).
- Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
