Biz, antijen-spesifik sıçan T lenfosit hatları in vitro genişlemesi için kullanılan T hücre büyüme faktörü hazırlık açıklar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Rat splenositlerin T Hücre Büyüme Faktörü hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre genişleme 1,2 evreleri ayrılmış antijen-bağlı aktivasyon kültür antijen spesifik T hücre hatları veya klonlar Bakım mermi gerektirir. IL-2, genişleme aşamasında kültür ortamı eklenmesi hücre ölümü önlemek için gerekli ve kısa vadeli T hücre hatları korumak için yeterli ama Th1 kutuplaşma 3 artış görülmüştür . Sitokinlerin bir karışımını içeren T hücre büyüme faktörü (TCGF) IL-2 Yedek interlökin 2 3 in vitro uzun vadeli T hücre hatlarının korunmasında daha etkili. Ayrıca, laboratuvarda büyük miktarlarda TCGF kolayca hazırlanır ve rekombinant interlökin 2 çok daha ucuz olabilir.
Burada, sıçan splenocyte kültür süpernatantlar TCGF nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu işlem için, biz, timus ve kan toplama için ötenazi naif Lewis sıçan dalak hasat. Biz kültür ortamında dalak, dalak tek hücre süspansiyonları hazırlamak, kırmızı kan hücrelerinin ozmotik şok lyze ve tohum. Concanavalin A, non-selektif olarak sitokinlerin üretimini indükleyen, tüm sıçan T lenfositleri aktive olduğunu mitojenle hücreleri uyarılır. Kültür supernantant andexcess Concanavalin 48 saat sonra toplanan bir TCGF eklendi olacak T hücre hatları aktive önlemek için alfa metil mannoside bağlıdır. TCGF sonra, steril filtrelenmiş aliquoted ve -20 ° C'de saklanır.
Protokol
- Lewis sıçan dalak (160-200g arasında fareler en iyi) ele alalım. Bir hücre süzgeç kullanarak PBS + antibiyotikler (PBS-PS) içeren bir petri buz Dilacerate. 50 ml'lik bir tüp içinde koyun. PBS-PS ile doldurun.
- 4 10 dakika Spin ° C pelet hücreleri.
- Hücreler iki kez yıkayın.
- Pelet NH 4 Cl 0.15 M (dalak başına 5 ml) tekrar Eritrositler lyse buz üzerinde 3 dakika süreyle bir pipetlemeyin yavaşça ve sürekli karıştırın. Orta tüp doldurun.
- 4 10 dakika Spin ° C pelet hücreleri.
- Hücreler iki kez yıkayın.
- Hücreleri saymak. Bir sıçan dalak 200-250 milyon hücre verir.
- Tam orta ml başına 2 milyon tohum hücreleri: 75 cm 2 şişeyi başına 50 ml.
- Inkübatörde 48 saat boyunca büyümesini sağlar.
- Pelet hücreleri Spin 15 dakika 4 ° C.
- Süpernatantı toplamak; hücrelerin atın.
- 15 mg / ml metil mannoside süpernatantı ekleyin. Iyice karıştırınız.
- Filtre (0.2 mm)
- -20 ° C'de kısım ve mağaza Gerekirse 10 gün, 4 ° C'de muhafaza edilebilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Düzenli olarak naif sıçanlarda serum ve thymi in vitro Lewis sıçan T hücre hatları teşvik etmek için hasat bu gerginlik euthanize beri Lewis sıçan splenositlerin TCGF hazırlar. Bu TCGF diğer sıçan suşları T hücre hatlarının büyüme ve hayatta kalma teşvik etmek için kullanılabilir. TCGF sıçan diğer suşları hazırlanabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Malzemeler
1 şişe PSG; 5 ml RPMI vitaminler; 5 ml sodyum piruvat; 5 ml non-esansiyel amino asitler, 50 UM% 10 FCS: tam bir kültür ortamı, RPMI 1640 ve steril filtre 500 ml şişe için aşağıdaki eklemek hazırlamak için beta-mercaptoethanol; 2 ug / ml Concanavalin A.
Kaynaklar
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
