Nöral tüpten embriyonik nöral krest izolasyonu kullanımını kolaylaştırır In vitro Göç, kendini yenileme ve nöral krest multipotency çalışmak için yöntemler.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Embriyonik Mürin Nöral Tüp çıkan sinirsel Crest Hücre İzolasyonu ve Kültür
Bu makalede
Özet
Özet
Embriyonik nöral krest (NC), nöral tüpün dorsalinde kaynaklanan multipotent progenitör nüfusu mezenkimal geçiş (EMT) bir epitel uğrar ve farklı hücre tipleri 1-3 sebebiyet veren, embriyo boyunca göç eder. NC de hedef organlar 4-6 farklılaşması ve olgunlaşması etkilemek için eşsiz bir yeteneği vardır. In vitro eksplante zaman, NC ataları kendini yenileme geçmesi, göç ve nöronlar, glia, düz kas hücreleri, kıkırdak ve kemik dokusu da dahil olmak üzere değişik türde farklılaşırlar.
NC multipotency ilk. Kuş nöral tüp 7-9 eksplant tanımlanmıştır NK hücrelerinin in vitro izolasyonunda proliferasyon, göç ve multipotency dahil NC dinamikleri çalışmaya kolaylaştırır edildi. Kuş ve sıçan sistemlerinde daha fazla çalışmalar embriyo 10 geri nakledilen zaman eksplante NK hücreleri, NK potansiyelini korumak olduğunu göstermiştir-13. Bu doğal hücresel özellikleri eksplante NC ataları korunur Çünkü nöral tüp eksplant testi in vitro NC eğitim için cazip bir seçenek sunar.
Memeli NC daha iyi anlaşılmasını sağlamak amacıyla, birçok yöntem NC nüfus yalıtmak için istihdam edilmiştir. NC kökenli ataları sonrası göçmen NC progenitörlerin 11,14-20 dinamiklerini incelemek için embriyo ve yetişkin hem de post-göçmen konumları kültüre edilebilir, ancak bunlar nöral tüp göç gibi NC progenitörlerin izolasyon optimum muhafaza sağlar NC potansiyeli hücre ve göçmen özellikleri 13,21,22. Bazı protokoller, özellikle ataları 11,13,14,17 için zenginleştirilmiş bir NC nüfusu izole etmeye fluorescence activated cell sorting (FACS) kullanır. Ancak, erken evre embriyo ile başlatırken, analizler için yeterli hücre sayıları erken NC alan nüfus izolasyonu karmaşıklaştıran, FACS ile elde etmek zorbireysel embriyolardan ns. Burada, bir Wnt1-Cre aktive soy muhabiri 23 dayanan yaklaşık% 96 oranında saf NC nüfus FACS ve sonuçları dayanmayan bir yaklaşım açıklanmaktadır.
Burada sunulan yöntemi sıçan NC 11,13 kültürü için optimize protokolleri uyarlanmıştır. Bu protokol daha önceki yöntemlere göre avantajları 1) hücre FACS)) göreceli olarak saf NC nüfusu, 3 elde etmek için gerekli değildir premigratory NC hücreleri izole edilir ve 4), bir besleyici tabakası, 2 yetiştirilen değildir sonuçlar kolayca olmalarıdır sayılabilir. Bundan başka, bu protokolü farklı genetik manipülasyon ile NC özelliklerinin çalışma kolaylaştırıcı, herhangi bir mutant fare modelinde gelen NC izole edilmesi için kullanılabilir. Bu yaklaşımın sınırlaması NC NC 2,24-28 hayatta kalması, göç ve farklılaşmayı etkileyen bilinmektedir embriyo bağlamında kaldırılır olmasıdır.
Protokol
1. Hazırlanması Tabaklar
- Her zaman steril tekniği kullanın.
- Dulbecco PBS (DPBS) içerisinde 3.3 mL 'lik bir son hacim içine insan plazmasından FN stoğu 100 uL seyreltilmesiyle fibronektin (FN) hazırlayın. Nihai konsantrasyon 30 ug / mL 'dir ve bu 1 hafta süreyle 4 ° C'de saklanabilir.
- FN çözümü ile steril doku kültürü dört sıra plakanın her alt örtün ve 15 dakika bekletin. Tüm yüzeyi kaplı olduğundan emin olun. Bu kez (2. ve 3. adımları) sırasında ortam olun.
- Çözüm FN ve plakaları kurumasını bekleyin çıkarın. Yavaşça 500 uL DMEM, kaldır DMEM ile kuyu durulayın, ve Öz-Yenileme 500 uL (SR), orta (aşağıya bakınız) ekle....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Dikkat dikkat bu yaklaşımın başarısı için embriyonun gelişim aşamasında dikkat edilmelidir. Erken fare embriyo Somitlerin sayan bir çöp içinde embriyo eşleme ve izolasyon için nöral tüpün doğru bölgelerin belirlenmesinde aşaması için hem kritik önem taşımaktadır. Embriyo arasındaki bir ya da iki Somitlerin bir varyasyonu yapılan deney çözünürlüğü bağlı olarak, gelişim zamanlama makul bir aralığı içindedir. 9 ve 9.5 DPC arasında bir embriyo 17 ve 25 Somitlerin arasında olacaktır. Embriyo fazla 25 Somitlerin varsa, NC dah.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz video yardım için Marc Wozniak kabul etmek istiyorum. Biz de kültür sıçan NK hücreleri için orijinal protokol için UT Southwestern az Sean Morrison kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Akademik Destek Programı desteklenen ve NIH (HD36720 ve HD036720-11S109) ve PAL için AHA 11GRNT7690040, NAM için AHA (0615209B) ve NIH (NS065604) den predoctoral burslar, ve ERP gelen hibelerle oldu Bir NIH eğitim bursu T32HD007502 tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| DMEM (düşük glukoz) | Gibco / Invitrogen | 11885 | |
| Neurobasal Orta | Gibco | 21103 | |
| BSA | Sigma | A3912-10G | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | -20 ° C'de 50 mcg / ml hacimde Mağaza |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | -20 ° C'de 25 mcg / ml hacimde Mağaza |
| Fibronektin | Gibco | 33016-015 | 1mg/ml al Saklanan-20 ° C'de iquots |
| Retinoik asit | Sigma | R2625 | -20 ° C'de etanol içerisinde yeniden yapılandırılması sonra, 35 ug / ml alikots içinde deposunda |
| 2-merkaptoetanol | Sigma | D-5637 | |
| N 2 takviyesi | Gibco | 17502-048 | |
| B27 takviyesi | Gibco | 17504-044 | |
| Steriflip 0,22 um filtreler | Millipore | SCGP00525 | |
| Penisilin-streptomisin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 mikron filtreleri | Corning | 431219 | |
| Şırınga (filtrasyon için) | BD Biosciences | 301604 | |
| Dört kuyucuğu | Thermo Fisher Scientific | 176740 | |
| Kollajenaz / Dispase | Roche | 269 638 | Etkinlik toplu göre değişir. -20 ° C'de 100 mg / mL alikots içinde deposunda |
| İnsülin iğneleri (29 ½ ölçer) | Becton Dickson | 309306 | |
| Hipoksi Odası | Billups-Rothenberg | ||
| Oksijen Analiz Cihazı | Billups-Rothenberg | ||
| Forseps # 5 | Güzel Bilim Araçları | Rahim ve desidua kaldırmak için. | |
| Tripsin-EDTA (% 0.25) | Gibco | 25200 |
Kaynaklar
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -P.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
