Yöntem makalesi

Çözüm Biyolojik Makromoleküllerin Küçük ve Geniş Açı X-Ray Saçılma Çalışmaları

DOI:

10.3791/4160

⸱

8 Ocak 2013

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical, Aerospace, and Nuclear Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Küçük ve geniş açılı X-ışını dağılma (SWAXS) prosedürünün gösteri Biyolojik makromoleküllerin çalışmada etkili olmuştur. Belirli bir açıda yöntemleri ve hazırlık enstrümantasyon ve prosedürlerin kullanımı sayesinde, SWAXS gelen deneysel veriler makromoleküllerin atomik ve nano ölçekli karakterizasyon görüntüler.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, makromoleküllerin Küçük ve Geniş Açı X-ışını saçılımı (SWAXS) analizi deneylerle gösterilmiştir. Ve geniş açıları (genellikle> 5 °) - SWAXS X-ışınları elastik küçük açılarla (5 ° tipik 0.1) de nm aralığında homojen olmayan bir örnek tarafından dağınık bir tekniktir. Bu teknik şekil, boyut ve makromoleküller, kısmen emretti malzemeleri, gözenek boyutları ve yüzey-hacim oranı karakteristik mesafeler dağılımı hakkında bilgi sağlar. Geniş Açı X-ışını saçılımı (WAXS) dayanan 0.33 nm ve 0,49 nm arasındaki örneklerinin bile küçük Bragg aralığı çözebilirsiniz ise Küçük Açı X-ışını saçılımı (SAXS), 1 ve 200 nm arasında makromoleküllerin yapısal bilgi sunma yeteneğine sahiptir belirli bir sistem kurulumu ve dedektör. Aralık Bragg kanunu ile belirlenen ve dalga boyu ve olay açısı bağımlıdır.

SWAXS bir deneyde, katı malzemeler olabilir,ya da sıvı ve herhangi bir kombinasyon halinde, aynı ya da başka bir malzeme, katı, sıvı veya gaz halindeki alanları (sözde partiküller) içerebilir. SWAXS uygulamaları çok geniş ve her türlü kolloidler şunlardır: metaller, kompozit malzemeler, çimento, petrol, polimerler, plastik, proteinler, gıdalar ve ilaçlar. Katı örnekler için, kalınlığı yaklaşık olarak 5 mm ile sınırlıdır.

Bir laboratuvar tabanlı SWAXS enstrümanın Kullanımı Bu yazıda ayrıntılı olarak verilmiştir. SWAXS sistemi için mevcut yazılım (örneğin, D. Svergun EMBL-Hamburg ve EasySWAXS yazılımı tarafından GNOM-ATSAS 2.3 paket) ile bir deney Verilen örnek için ilgi belirli parametreleri belirlemek için yapılabilir. Bir biyolojik makromolekül deney bir örneği, seçilmiş ve çeşitli yöntemler vasıtasıyla hazırlanabilir, su bazlı bir sulu tampon içinde% 2 ağ lizozim analizidir. Numune hazırlanması Örnek bölümünün hazırlanması aşağıdaki kuralları takip eder. SWAXS deney sayesinde,lizozim önemli yapısal parametreler, dönme yarıçapı, örneğin analiz edilebilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Numune Hazırlanması

  1. Numune kabından örnek bazı kaldırmak için bir iğne kullanın. *
  2. Kılcal doldurmak için iğne kullanın (2.2 mm maksimum çapı) numune ile. Kılcal alttan 2 ve 3 cm arasında doldurulmuş olmalıdır.
  3. Onun ucunda mum eritme tarafından kılcal kapatın.
  4. Sökün sisteminden vakum numune tutucu.
  5. Sigortalı sonunda (balmumu sonu) tarafından kapiller atın ve numune tutucu içine un-kaynaşmış ucunu.
  6. Yerinde sistem ve vida geri tutucu yerleştirin.

Sıvı numuneleri bir kapiler yerleştirilmesi gerekir ise * Katı örnekler (toz numuneleri de dahil) direkt olarak, numune tutucusu (Kılcal gerekli) yerleştirilebilir.

Start-Up SWAXS Makinesi

2. Kaynak Soğuk Başlangıç ​​Prosedürü

  1. Emniyet deklanşöre basarak çekim kapatın.
  2. Ana güç geçişDüğmesine yeşil iterek "ON".
  3. Acil "Shut-Off" butonu uzatılmış konumda olduğunu doğrulayın.
  4. Yeşil düğmeye basarak, ana güç açın.
  5. Interlok LED ışık tüm kilitlerini ok gösteren yeşil olduğunu doğrulayın.
  6. Yüklemek için dokunmatik ekran bekleyin. Bir kere yüklendiğinde, menüsünde "R6" tuşuna basın.
  7. "ON" konumuna Bekleme anahtarı çevirin.
  8. "ON" konumuna X-ray Anahtarı çevirin. Kırmızı X-ray ışık yanacaktır.
  9. Bekleme düzeyleri (30 kV ve 0,4 mA) okumak için dokunmatik ekran bekleyin.
  10. "OFF" pozisyonuna Bekleme Güvenlik Anahtarı çevirin. Dokunmatik ekranın alt kısmında "Başlat Döngüsü" düğmesine basın.
  11. Nominal gücü (50 kV ve 1 mA) okumak için dokunmatik ekran bekleyin. Farklı bir güç seviyesi isteniyorsa, dokunmatik ekranda "R4" tuşuna basarak ve istediğiniz ayarları girerek yapılandırma ekranına girin.

3. Chiller Prosedürü

  1. Güç SWI getirinsıcaklık kontrol paneli üzerindeki "ON" konumuna tch. A kontrol lambası ve LED sıcaklık göstergesi yanacaktır.
  2. Chiller üzerindeki "ON" konumuna güç anahtarını çevirin.
  3. Sıcaklık göstergesi okur kadar bekleyin "KAPALI". Bu bekleme modu.
  4. Basın ve yaklaşık 4 saniye veya sıcaklık göstergesi kadar enter tuşuna (geri dönüş sembolü) tutun bir gerçek sıcaklık gösterir.
  5. Sıcaklığı değiştirmek için yukarı veya aşağı oklarına basın. Bunun gerçek değeri dönecektir önce ayar değeri yaklaşık 8 saniye boyunca sıcaklık göstergesi üzerinde gösterilecek.
  6. Istenilen set değeri görüntülenecektir kez enter tuşuna basın. Bu bu değeri depolar.
  7. Gerçek sıcaklık istenilen set değeri ulaşana kadar bekleyin.

NOT: Herhangi bir zamanda hata "E 01" sıcaklık göstergesi üzerinde gelirse, tankın fil içine arıtılmış su dökerek Chiller Kapatma talimatları, dolum banyo ünitesi izleyinl, ve sonra tekrar Chiller Devreye alma işlemi gerçekleştirin.

4. Chiller Kapatma

  1. Yaklaşık 4 saniye için "enter" tuşuna basın.
  2. "OFF" konumuna güç anahtarını çevirin.

5. Vakum açma

  1. Vakum kapı yerine sabitlenmiş olduğundan emin olun.
  2. "AÇIK" konuma Vakum 1 ve 2 düğme açın.
  3. VAP5 vakum göstergesi 1,5 mbar daha vakum seviyesi az okuyana kadar bekleyin.

6. Dedektör Sistem Kurulumu

  1. Gaz basıncını ayarlamak için, doğrulamak azaltma valfi Ana Basınç Ölçer en az 10 bar.
  2. Ana Vana açın.
  3. Basınç Çalışma Basıncı Ölçer az 8 bar ulaşana kadar yavaşça İşletim Basınç Valfi açın.
  4. İkinci Ana Vana açın
  5. Gaz akışını ayarlamak için, Gaz Kontrol panelindeki dikey konuma topuzunu çevirerek Ana Basınç valfi açın.
  6. Debi ayarlamaiğne vana ile hızı ölçer yaklaşık 8 bar okuyana kadar.
  7. "ON" konumuna Ana Güç anahtarını açın. LED ışık yanacaktır.
  8. Yüksek gerilim ayarlamak için "ON" konumuna getiriniz çevirerek yüksek gerilim etkinleştirin. LED ışık yanacaktır.
  9. Yaklaşık 3.5kV ölçerde ulaşılana kadar yavaşça voltaj kontrol topuzu çevirin. 4kV AŞMAYINIZ.

7. Ayarlama

  1. Yukarıdaki deneysel adımlar bilinen doruklarına bir örnek ile yapılmaktadır.
  2. ASA 3.3 5 zirveleri ile yoğunluk vs kanal grafiği elde etmek için kullanılır.
  3. Menü → Seçenekler → kanalları ve ilgili şiddetleri girin.
  4. İlk "TPF" sekmesine, ASA3 gidin.
  5. Filtresini değiştirin, üst 1 mm Nikel (ışın filtresi) bıraktı.
  6. → konuma gidin, dedektör rea olduğundan emin olun, emin vakum altında 5 mbar yapmak pozisyonu 32.000 (32.000 aralığı 28.000, 28.000 kritik bölge) ayarla1k-10K arasında ding.
  7. Saniyede yaklaşık 52 adet için 10 saniye çalıştırın.
  8. Enerji camlar, (veya filtre durum da dahil, yalnızca örnek ile enerji penceresi ölçmek) değiştirin. 10 sn için nihai çalışma ayarlayın.
  9. Primer ışın (örneğin, kanal 233) konumunu bulmak.
  10. Diğer koşular için, 2 mm Tungsten (W, kiriş stoper) tekrar filtrelemek ve 30.000 başlamak değiştirin.
  11. Numunelerin diğer tüm piklerinin konumu bulun.
  12. SAXS kalibre ImageJ-makro yazılımı kullanın - (Şekil 1) yoğunluğu vs kanal yoğunluğu vs q (veya d aralığı) geçişler yaparak.
  13. WAXS kalibre ImageJ-makro yazılımı kullanın - yoğunluğu vs kanal yoğunluğu vs q (veya d aralığı) geçişler yaparak (Şekil 2).

8. Yazılım Prosedürü

  1. Canlı veri toplamak için, yazılım ASA 3.3 kullanın: Canlı Veri → TPF sekmesini → dosyayı kaydedin.
  2. EasySWAX içinS, Aygıt Ayarları sekmesini tıklatın.
  3. "A", lambda, ve d değerlerinin yanı sıra, ağırlık merkezinin girin.
  4. Nokta Kolimasyon seçin.
  5. Küresel parçacık türü (düz bir parçacık şeklinde bir çubuk olarak bilinen olmadığı sürece).
  6. Guinier-Plot sekmesini tıklayın. Bir ben karşı q 2 grafik görüntülenir.
  7. Yaklaşık doğrusal eğim bir bölümünü çevreleyen dikey çizgiler sürükleyin.
  8. Ekranın alt kısmında, bir R değeri görüntülenir. Bunun yanında bir doğrulama gereklilik yoktur.
  9. Doğrulama değer 1 ve 2 arasında olduğu kadar birbirine yakın dikey çizgiler sürüklemeye devam edin. Bu özneldir. Elde R değeri, ya Gyration yarıçapı, bir tahmindir.

9. Kaynak Kapatma Prosedürü

  1. Emniyet doğrulamak ve hızlı panjurlar kapatılır.
  2. "ON" konumuna Bekleme anahtarı çevirin.
  3. Bekleme düzeyleri okumak için dokunmatik bekleyin.
  4. T Basın R5ouchscreen.
  5. 0 A. Geçerli azaltın
  6. 0 A. gerilimi azaltın
  7. "OFF" pozisyonuna X-ışını anahtarı çevirin.
  8. Kırmızı kapatma düğmesine basarak ana güç "OFF" geçin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gyration, partikül boyutu ve şekli, çözüm yapı faktörü, belirli iç yüzeyi ve gözenek boyutu, kafes tipi ve boyut ve elektron yoğunluğu 1 yarıçapı: SAXS ve WAXS tamamen aşağıdaki parametreleri aracılığıyla numune yapısal bilgiler sağlayabilir. SAXS WAXS ve aynı zamanda protein dinamik 2 çalışması için uygulanabilir.

SWAXS deneyler yapısal bilgi, deneysel olarak tespit spektrumları ve sistemin hesaplama sonuçlarının karşılaştırılması ile elde edilir. Hesaplama sonuçları g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SWAXS Sistemin deneysel prosedür karşılaştırmalı analizi ile tespit edilmesi çok sayıda değişkenler için olanak sağlar. Analizinden elde edilen parametreler örnek ve deneysel düzenek göre farklı amaçlar için kullanılabilir. WAXS atomik ve mikro-ölçekli yapısı (örneğin moleküler kafes, birim hücre boyutu simetri) odaklanır ise SAXS, nano-ölçek büyüklüğü ve nesnenin şekli hakkında bilgi sağlar. Daha spesifik olarak, seyreltik çözeltiler içinde partiküller için, SAXS devir, parçacık boyutu, şekli ve yan çapı incel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz Graz, Avusturya Avusturya Bilimler Akademisi Dr Manfred Hecus XRS arasında Kriechbaum ve Biyofizik ve Nanosistemler Araştırma Enstitüsü teşekkür etmek istiyorum. LL ve XW Ödülü No NRC-38-08-950 altında NERI-C Ödülü No DE-FG07-07ID14889 ve ABD Nükleer Düzenleme Komisyonu altında, ABD Enerji Bakanlığı tarafından kısmen desteklenmiştir. SWAXS araç aynı zamanda Ödülü No DE-NE0000325 altında, ABD Enerji Bakanlığı tarafından kısmen desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ürün Adı Şirket
System3 Küçük ve Geniş Açılı X-Ray Saçılma (SWAXS) Kamera Hecus XRS ve IBN,
Graz, Avusturya
GNOM D. Svergun EMBL-Hamburg ATSAS 2.3 paketi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
  2. Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
  3. Maranas, J. K. The effect of environment on local dynamics of macromolecules. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 12, 29-42 (2007).
  4. Lysozyme in Water [Internet]. , Available from: http://www.bevanlab.biochem.vt.edu/Pages/Personal/justin/gmx-tutorials/lysozyme/10_analysis2.html (2008-2012).
  5. Stribeck, N. X-Ray Scattering of Soft Matter. , Springer. Heidelberg. (2007).
  6. Mertens, H. D., Svergun, D. I. Structural characterization of proteins and complexes using small-angle X-ray solution scattering. J. Struct. Biol. 172 (1), 128(2010).
  7. Svergun, D. I. Small-angle X-ray and neutron scattering as a tool for structural systems biology. Biol. Chem. 391 (7), 737(2010).
  8. Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Quat. Rev. Biophys. 40, 191-285 (2007).
  9. Bonini, M., Fratini, E., Baglioni, P. SAXS study of chain-like structures formed by magnetic nanoparticles. Materials Science & Engineering C-Biomimetic and Supramolecular Systems. 27 (5-8), 1377-1381 (2007).
  10. Falletta, E., Ridi, F., Fratini, E., Vannucci, C., Canton, P., Bianchi, S., Castelvetro, V., Baglioni, P. A tri-block copolymer templated synthesis of gold nanostructures. Journal of Colloid and Interface Science. 357 (1), 88-94 (2011).
  11. Glatter, O., Scherf, G., Schillen, K., Brown, W. Characterization of a Poly(ethylene oxide) Poly(propylene oxide) Triblock Copolymer (EO(27)-PO39-EO(27)) in Aqueous-Solution. Macromolecules. 27 (21), 6046-6054 (1994).
  12. Mittelbach, R., Glatter, O. Direct structure analysis of small-angle scattering data from polydisperse colloidal particles. Journal of Applied Crystallography. 31, 600-608 (1998).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

K k A l X I n Sa lmasX I n Sa lma AnaliziYap sal ParametrelerJirasyon Yar apLizozim AnaliziSWAXS Enstr mantasyonuGNOM ATSAS Yaz l mEasySWAXS Yaz l m

İlgili makaleler