Yöntem makalesi

Sulu Ortamlarda Hidrokarbon Dönüşüm Enable A Toolkit

DOI:

10.3791/4182

⸱

2 Ekim 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Petrol kirliliğinin iyileştirilmesi için bakteriyel sistemini düzenleyen sürdürülebilir bir otomatik standart değiştirilebilir DNA parçalarının (BioBricks) kullanılarak tasarlanmıştır. Bir mühendislik E. coli Gerilme toksik sulu ortamlarda β-oksidasyon yoluyla alkanlar indirgemek için kullanıldı. Farklı türlerden ilgili enzimler alkan bozulması aktivite göstermiştir. Için Ayrıca, artan bir tolerans N-Hekzan alkan dayanıklı bakterilerden gen değişimleri elde edilmiştir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma ileriye Escherichia coli alkan dönüşüm sağlayan ve uygulanabilirlik ilkesinin bir kanıtı sunan bir araç koyar. Toolkit çoklu standart değiştirilebilir parçalar (BioBricks) 9 alkan dönüşüm, toksik hidrokarbon zengini ortamlarda gen ekspresyonu ve sağkalım düzenlenmesi ele oluşur.

Alkan bozulması için üç aşamalı yolun E. uygulanmıştır kendi alkanoller, alkanals ve sonuçta alkanoik asitler, orta ve uzun zincirli alkanlar dönüşümü sağlamak için coli. Ikincisi doğal β-oksidasyon yol üzerinden metabolize edildi. Orta-zincirli alkanlar (C5-C13) sikloalkanlar ve (C5-C8), Gordonia sp alkan hidroksilaz sistemi dört gen (alkB2, rubA3, rubA4 ve kolla) 'nin oksidasyonu kolaylaştırmak için. TF6 8,21 E. dönüştü coli. Ve dönüşüm içinUzun zincirli alkanlar (C15-C36), Geobacillus thermodenitrificans dan Lada gen uygulanmıştır. Bozulması sürecinin gerekli ileri adımlar için, ADH ve ALDH (G. thermodenitrificans menşeli) 10,11 tanıtıldı. Istirahat etkinlik hücrelerin analizi ile ölçülmüştür. Her oksidatif adım için, enzim aktivitesi gözlendi.

Süreci etkinliği optimize etmek için, ifade sadece düşük glikoz koşullar altında uyarılmıştır: bir alt-tabaka ile düzenlenen promotör, pCaiF kullanılmıştır. pCaiF E. mevcut coli K12 ve non-glikoz karbon kaynaklarının bozulma içerdiği genlerin ekspresyonunu düzenlemektedir.

Setinin son bölümü - yaşama hedefleme - PhPFDα ve β çözücü dayanıklılık genlerinin, Pyrococcus horikoshii OT3 hem kullanılarak uygulanmıştır. Organik solventler olumsuz affectin tarafından hücrenin stres neden ve beka azalmış olabilirg protein katlanması. Şaperonlar olarak, PhPFDα ve β alkan varlığı altında protein katlama işlemi örneğin arttırır. Kültür ortamı içinde% 10 n-heksan suretin artan bir büyüme oranı (% 50'ye kadar) ile gösterilen bir hidrokarbon iyileştirilmiş tolerans yol açmıştır, bu genlerin ekspresyonu görülmüştür.

Özetleme, sonuç seti E. sağlar belirtmek Sulu ortamlarda hidrokarbon dönüştürmek ve tolere coli. Bu nedenle, bir sentetik biyoloji yaklaşım kullanarak petrol iyileştirme için sürdürülebilir bir çözüm bulunması yönünde bir ilk adımdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Petrol kirliliği, çevre kirliliğinin en ciddi nedenleri arasındadır ve ekosistemleri, işletmeleri ve toplulukları büyük ölçüde etkiler 3. Örneğin, Kanada'nın Alberta eyaletindeki petrol kumları atık sularından kaynaklanan sürekli petrol kirliliğiyle mücadele etmek için çözümler gereklidir. Petrol kumlarından petrol çıkarma işlemi sırasında, yarı katı oksitlenmiş bir petrol formu olan bitüm, tek varil petrol başına yaklaşık 3,1 varil su tüketen termal geri kazanım teknikleri kullanılarak uzaklaştırılır 1. Esas olarak yerel bir nehirden kaynaklanan petrolle kirlenmiş proses suyu, bitüm ekstraksiyonundan sonra atık havuzlarında depolanır. Tatlı su alımına olan ihtiyacı azaltmak için proses suyunun daha etkili bir şekilde geri dönüştürülmesine ihtiyaç vardır. Bitüm ekstraksiyonunu kolaylaştırmak ve aşağı havza sahalarının su ekosistemlerinin korunmasına yönelik su kalitesi yönergelerini karşılamasını sağlamak için proses suyu arıtmaları hızla gelişmektedir 3.

Organik bileşiklerin kirlenmesini tedavi etmek için, mikroorganizmaları kullanan biyoremediasyon teknolojileri şu anda teşvik edilmektedir 1. Alkanlar, ham petrolde en bol bulunan hidrokarbon ailesidir ve molekül başına 5 ila 40 karbon atomu içerir 7, 21. Birçok bakterinin, önce alkolleri, ardından aldehitleri ve son olarak yağ asitlerini oluşturan terminal metil grubunun sıralı oksidasyonu yoluyla çeşitli uzunluklardaki alkanları parçaladığı bilinmektedir 8. Bu iGEM projesi kapsamında, farklı organizmalardan çeşitli enzimler eksprese edildi ve karakterize edildi ve BioBrick standardı ve Standart Biyolojik Parçaların Kayıt Defteri aracılığıyla kullanıma sunuldu.

Gordonia sp. TF6'nın iyi çalışılmış alkan hidroksilaz sistemi, en az dört bileşen kullanarak C5-C 13 alkanlarının yanı sıra C5-C 8 sikloalkanlarınkiyle birlikte ilk oksidasyon adımını kolaylaştırır: alkB2 (alkan 1-monooksijenaz), rubA3, rubA4 (iki rubredoksin) ve RubB (rubredoksin redüktaz) 8, 21. Uzun zincirli alkanların oksidasyonunun (C15 ila C36 arasında değişen), Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2'den bir flavoprotein alkan monooksijenaz olan ladA tarafından gerçekleştirildiği bildirilmektedir 7, 15, 18, 22. LadA, oksidasyon için atomik oksijen kullanan flavin mononükleotid (FMN) ile katalitik bir kompleks oluşturur. Bu, alkanların karşılık gelen birincil alkanole dönüştürülmesiyle sonuçlanır. Alkoller ayrıca alkol ve aldehit dehidrojenazlar tarafından yağ asitlerine oksitlenir ve bu da β-oksidasyon yolu 7, 21'e kolayca girer. Termofilik bakteri Geobacillus thermoleovorans B23'ten elde edilen çinkodan bağımsız bir alkol dehidrojenaz, NAD + 'yı bir kofaktör 10 olarak kullanarak orta zincirli alkanolleri ilgili alkanallarına oksitler. Aynı bakteriden elde edilen aldehit dehidrojenaz, orta zincirli oksidasyonda 11 NAD + 'ya bağlı son adımı katalize edebilir.

İndüksiyon maliyetlerini azaltmak ve bakteri sisteminin optimal proliferasyonunu sürdürmek için, E.coli'den promotör pCaiF karakterize edildi. Bu promotör, hidrokarbon bozunma yolu bileşenlerinin ekspresyonunu düzenleyebilir ve cAMP-Crp seviyeleri tarafından düzenlenir, bu da glikoz seviyelerine 6 bağlıdır. Ortamdaki yüksek hücre dışı glikoz konsantrasyonlarında, PTS aracılı glikoz taşınmasının bir yan etkisi olarak adenilil siklazın inhibisyonu yoluyla hücresel cAMP (siklik Adenozin Mononükleotid Fosfat) seviyesi düşüktü. Tersine, sınırlama sırasında (düşük glikoz konsantrasyonları) cAMP seviyesi artmış ve Crp, cAMP'ye bağlanarak pCaiF'yi bağlayan ve aşağı akış bileşenlerinin 6, 14 transkripsiyonunu aktive eden cAMP-Crp kompleksini oluşturmuştur.

Wildtype E. coli, yalnızca orta düzeyde hidrokarbon konsantrasyonlarını tolere edebilir. Araç setini tamamlamak için hidrokarbonlara karşı toleransın ele alınması gerekiyordu. Birkaç organik solvente toleranslı bakterinin su solventli iki fazlı sistemlerde hayatta kaldığı bilinmektedir 12. Toleransı arttırdığı bilinen moleküler bileşenler, proteinlerin doğru katlanmasını kolaylaştıran şaperonlardır. phPFDα ve phPFDβ proteinlerinden oluşan Pyrococcus horikoshii OT3'ten elde edilen prefoldin sisteminin hidrokarbon toleransını arttırdığı gösterilmiştir 17.

Alkan dönüştürme araç seti, Standart Biyolojik Parçalar 9'un Kayıt Defteri'nde belgelenen BioBrick ilkesine göre oluşturulmuştur. BioBricks, önceden tanımlanmış 4 kısıtlama bölgesi ile çevrili belirli bir fonksiyonel ek içeren plazmitlerdir. BioBrick ekleri esnek bir şekilde genişletilebilir ve yeni işlevlere sahip biyolojik sistemlerin oluşturulmasına olanak tanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. BioBrick Meclisi

  1. Standart Biyolojik parçaları Sicilinden BioBricks iGEM merkez tarafından sağlanmaktadır. Mevcut BioBricks yeni bir BioBrick oluşturmak için, alıcı kısmın verici parça aşağı konumlandırılması için enzimler EcoRI ve SpeI ile verici BioBrick (en fazla 1.0 ug) sindirimi. Alıcı kısmının yukan verici parça konumlandırılması için Xbal ve PstI ile Digest. Donör omurgasında kesen bir üçüncü uygun restriksiyon enzimi ekleyin. Satıcı (nihai konsantrasyon 1 x) 'ye göre, uygun bir tampon ile 20-25 ml'lik bir toplam hacim içinde sindirimler gerçekleştirin. Restriksiyon enzimleri için 5 adet / mg DNA kullanın.
  2. EcoRI ve Xbal ya da SpeI ve PstI ile ya da alıcı BioBrick özet.
  3. 37. az bir saat (en az) için sindirimler inkübe ° C. Kısıtlama ısı endonükleazları Inactivate, 80 inkübasyon süre 10 dakika ve santrifüj ° C.
  4. Sindirilmiş BioBrick Arterbirlikte parçaları (verici ve alıcı). Xbal ve SpeI uyumlu DNA uçları oluşturur yana, bir karma site 4 standart kısıtlama siteleri ile çevrili yeni bir 'birleşik' BioBrick sonuçlanan herhangi bir restriksiyon enzimi ile kesilmiş olamaz oluşturulur. Ligasyon karışımı, bir son DNA konsantrasyonu, tercihen ~ 100 ng / ml 'den. T4 ligasyon tampon (nihai konsantrasyon 1 x) ve T4 ligaz (1 ünite / ug DNA) birlikte 10-15 ml'lik toplam hacim içinde ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin.
  5. En azından 3 saat için 16 ° C 'de ligasyon karışımı inkübe edin.
  6. Ligasyon karışımı yaklaşık yarısı dönüşüm reaksiyonu gerçekleştirin.
  7. Sıralama ile doğru olmak BioBrick onaylayın.
  8. Sentezlenen DNA 'sından yeni BioBrick inşa etmek için, E. optimum ifade için sentez genleri için değiştirmek JCat web sitesi aracının (vasıtasıyla coli http://www.jcat.de/ ). B gereklerine uygun olarak daha fazla değişiklik yapın ioBrick standart. Bu standardizasyon her BioBrick bir önek öncesinde ve sonek ardından ilgi DNA dizisi oluşur anlamına gelir. Önek ve sonek kalan plazmid sırayla bulunmadığına önceden tanımlanmış kısıtlama siteleri içeren dizileri vardır. Bunlar standart kısıtlama siteleri değiştokuşu ve 9 esnek BioBrick ekler uzatmak mümkün kılar. Önek ve sonek aşağıdaki dizileri var:
Isim Sıra Yorumlamak
Önek 5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3' Aşağıdaki parçası kodlama sırası veya "ATG" ile başlayan herhangi bir bölümü ise
Sonek 5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'
In Vivo ove_title "> 2. Alkan Dönüşüm Dinlenme Hücre Deneyi,

Bu tahlil, Fujii ve diğ. (2004) tarafından tarif edilen yönteme göre yapıldı.

  1. Kültür E. Alkan Hidroksilaz sistemi (eksprese coli hücreleri BBa_K398014 bir boş vektör (taşıma) ve hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 5 ml LB ortam içinde).
  2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.3 bir OD (optik yoğunluk) ulaşana kadar inkübe edilir.
  3. 4,000 rpm'de 10 dakika boyunca santrifüje ve 5 ml 0.1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde tekrar süspansiyon pelet.
  4. 4,000 rpm'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüje ve artık E2 edilebilir tuzları ve% 0.66 hacim / hacim gliserol (nitrojen-ihtiva eden yetersizliklerin 5 ml 0.1 M fosfat tampon içinde tekrar süspansiyon pelett orta).
  5. Hücre bulanıklık (OD 600) ölçün.
  6. 25 ml kapalı bir kap cam şişeler ve herhangi bir hücre kontrol (E2 tuzları +% 0.66 hacim / hacim gliserol) içinde 6 ml hücre-alikotları karışım hazırlayın.
  7. Her şişeye alkan 100 nmol ekleyin.
  8. 24 saat (daha yüksek oranlar elde edildiği takdirde kısaltmak) için 37 ° C 'de karışımlarını.
  9. Inkübasyondan sonra OD 600 ölçün.
  10. Etil asetat ile kültür ortamı içinde hidrokarbon ayıklamak ve gaz kromatografisi (protokol 3'e bakınız) ile, hücre kültürü içinde hidrokarbon konsantrasyonu belirlenir.
  11. Her balona toplam biyokütle bugünkü (kuru ağırlık OD 600 dönüştürmek) tarafından dönüştürülmüş alkan toplam miktarı bölerek biyokütle birim bozulması hesaplayın. Deney süresi sonucu bölerek birim zamanda birim biyokütle başına degradasyon aktivitesinin verir. Ortalama üç ayrı çalışır alınır.

3. Alkan Dönüşüm Enzim Testi, Inİn Vitro

Bu tahlil, Li ve diğ. (2008) tarafından tarif edilen metoda göre esasen yapıldı.

  1. Kültür E. Lada gen (eksprese coli hücreleri BBa_K398017 ) ve boş vektör (taşıyan hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 50 mL LB ortam içinde).
  2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.6 bir optik yoğunluğa ulaşıncaya kadar inkübe edilir.
  3. 4000 rpm (4 ° C) de 10 dakika santrifüjlenir ve 50 mM Tris tamponu, 5 ml içinde pelet tekrar süspansiyon.
  4. 4 bir çıkış kontrolü ile% 40 görev devresi sonikasyon (Hücre bölücü, LA Biyosistem) hücreler, süresi boyunca buz üzerinde çözüm tutmak.
  5. 4 ve d az 4000 rpm'de 5 dakika için elde edilen karışım santrifüjlenirörneğin, C hücre enkaz kaldırmak için. Taze bir flakon süpernatant aktarın.
  6. Bradford tahlili ile hücre özlerinin toplam protein konsantrasyonu belirlenir. Not: Arka plan artış ve / veya protein kaybını önlemek için cam şişe kullanın.
  7. % 0.1 v / v alkan ve 50 mM Tris-HCl tampon içeren 100 ml'lik bir karışım hazırlayın.
  8. 5 dakika boyunca 100 ° C'de karışım ısıtılır. Not: Sadece yüksek kaynama noktasına sahip orta-uzun zincirli alkanlar için bu adımı gerçekleştirin. (Örneğin C 16: 287 ° C).
  9. Alkan optimal bir çözünürlük elde etmek için, 1 dak hala sıcak iken homojen, viskoz karışım elde edilinceye kadar için sonikasyon.
  10. 1 mM NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO4 ve 0.01 h / h Triton X-100 ilave edin.
  11. 25 ml kapalı kap şişeleri içinde 6 ml alikotları hazırlayın.
  12. Hücre ekstresi yeterli miktarda (Bradford deneyleri, 5 mg protein / l son konsantrasyon bağlıdır) ekleyin. No-proteini kontrol hazırlayın.
  13. Optimal e 60 ° C (inkübe24 saat süre ile) aktivitesi nzymatic.
  14. Etil asetat ile kültür ortamı içinde hidrokarbon ayıklamak ve gaz kromatografisi (protokol 3'e bakınız) ile, hücre kültürü içinde hidrokarbon konsantrasyonu belirlenir.
  15. Toplam protein tarafından dönüştürülmüş alkan toplam miktarı bölerek biyokütle birim bozulması hesaplayın Her balona (Bradford kalibrasyon eğrisi ile) eklendi. Ayrıca deneme süresi bölünerek birim zamanda hücresel protein birim degradasyon aktivitesinin verir. Ortalama üç ayrı çalışır alınır.

4. Etil Asetat Hidrokarbon Ekstraksiyon ve Konsantrasyon Ölçümleri

  1. Alkanların 6 ml deney için 2.5 ml çözelti, etil asetat (apolar çözücü) ilave edilerek sulu bir çözelti elde edilir. Dahili bir standart% 0.1 'lik bir konsantrasyonda (v / v) de çözücü ilave edilir. Standart (örn. siklo-dekan) ilgi doruklarına beklenen aralığına bağlı olarak değişmektedir.
  2. Opsiyonel: Add TritonSulu karışım, X-100 ve uygun bir iki faz sistemi elde etmek için 4000 rpm'de 10 dakika için numune santrifüjlenir.
  3. Girdap iki faz ayrı kadar 5 saniye (1,500 rpm) ile, oda sıcaklığında inkübe edin karışımı.
  4. Organik katman (üst) arasında bir maksimum miktarda kaldırma ve susuz magnezyum sülfat ile çözücü kurutun.
  5. Filtrasyon (0.2 mikron) tarafından MgSO4 çıkarın ve -20 ° C'de ölçümleri için gaz kromatografisi şişeleri içine süzülen veya mağaza aktarmak
  6. CP-SIL 5CB kolon (uzunluk = 5 kg) kullanılarak gaz kromatografisi ile konsantrasyonunun belirlenmesi. (1:10, 230 ° C) bölünmüş modda numune 10 ml enjekte edilir. 1 ml / dk (helyum) ile kolon gaz akış ayarlayın. Aşağıdaki fırın sıcaklık programı kullanılmıştır:
    Oran Sıcaklık [° C] Zaman [dk]
    0 50 7.5
    50 90 1.0
    50 110 2.0
    50 130 2.0
    50 145 2.0
    50 160 2.0
    50 170 2.0
    50 185 2.0
    50 210 2.0
    50 250 2.0
    50 320 2.0
  7. Zirveleri entegre ve iç standart ile ilgili olarak konsantrasyonları düzeltin.

5. Alkol / Aldehit Dehidrogenaz Aktivitesi Testi

Bu tahlil, Kato ve diğerleri tarafından tarif edilen metoda göre esasen yapıldı.(2010).

  1. Kültür E. ADH (eksprese coli hücreleri BBa_K398018 ) ya da ALDH ( BBa_K398030 ) geni ve bir boş vektör (taşıyan hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 50 mL LB ortam içinde).
  2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.6 bir optik yoğunluğa ulaşıncaya kadar inkübe edilir.
  3. 4 ° C'de 4,000 rpm'de 10 dakika santrifüjlenir ve 50 mM Tris tamponu, 5 ml içinde pelet tekrar süspansiyon.
  4. 4 bir çıkış kontrolü (sonication sırasında buz üzerinde çözüm tutmak) ile% 40 görev devresi hücre çözümü sonikasyon.
  5. ° C hücre tortularını çıkarmak üzere 4 az 4000 rpm'de 5 dakika için elde edilen karışım santrifüjleyin.
  6. Göre belirlenir(: Protein bağlama önlemek için bir cam şişe kullanın Not) Bradford yöntemi ile hücre ekstreleri tal protein konsantrasyonu.
  7. 180 ul 57 mM glisin tampon her bir kuyu içinde NAD (nihai konsantrasyon 1 mM, pH 9.5) ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka yerleştirin.
  8. Kuyular için test edilecek olan alkol (aldehit) 5 ul ekle. Not: bir sıvı olması testin başlamasından önce ısı uzun zincirli alkoller. Her bir alkol (aldehit) alt tabaka olmadan bir kontrol (negatif kontrol) ilave edilmelidir. Buna ek olarak, hücre özütü olmaksızın substrat tampon ve bir karışımını içeren bir boş hazırlanır.
  9. Ön ısıtma 37 'de 15 dakika için plaka okuyucu (Tecan Macellan v7.0) ve plaka ° C sisteminin denge sağlamak için.
  10. Hücre ekstresi yeterli miktarda (Bradford deneyleri, 5 mg protein / l son konsantrasyon bağlıdır) ekleyin. No-proteini kontrol hazırlayın.
  11. 340 nm dalga boyunda 37 1 saat için her 2-3 dakikada ° C
  12. OD (340 nm) eğiminden NADH üretim hızını hesaplayın. Dikkate ışık yolu uzunluğu ve 6220 M -1 cm -1 NADH sönüm katsayısı atın. Protein toplam miktarına göre NADH üretim hızı bölme hücre özütü olarak dehidrogenaz reaksiyonu (U / mg tam hücre protein) aktivitesinin eklendi. Ortalama ve üç bağımsız çalışır gelen standart sapmayı hesaplayın.

6. pCaiF Karakterizasyonu

  1. Kültür E. pCaiF-GFP construct (ifade coli hücreleri BBa_K398331 ) ve yalnız organizatörü (taşıyan hücreler BBa_K398326 uygun antibiyotik gecede 5 ml LB orta gecede).
  2. 5 ml M9 gece boyunca kültürün 50 ul ile 10 g / l glukoz ve antibiyotik içeren inoküle ve gece boyunca büyümeye.
  3. Gecede akıbet alt kültürünün 50 ul taze M9 with10 g / l ve inkübe 5 ml içine hücre bulanıklık 600 nm'de 0.2 optik yoğunluk ulaşana kadar.
  4. Her bir kuyudaki test için karbon kaynağı, istenen miktarda içeren taze M9 ortam 100 ul ile bir 96 kuyulu plakanın yerleştirin. İstatistiksel değerlendirme için üç nüsha deneyler gerçekleştirin ve ilgili negatif kontroller (yabani tip E. coli K12) ekleyin.
  5. Sıvısı içeren kuyucuklara gece boyunca kültür 5 ul ekle.
  6. Büyüme eğrisi (OD 600) ve bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresan (485 nm eksitasyon ve emisyon 520) 37 18 saat süreyle her 10 dakikada ° C sabit sallama ile ölçün.
  7. Büyüme hızı ve ilgili ölçümlerden özel GFP miktarı hesaplanır ve kontrol karşılaştırın. Ortalama, en az üç bağımsız deneyin standart sapma hesaplanır.

7. Tolerans Testi

  1. KültürE. coli PhPFDα ve β gen (eksprese BBa_K398406 5 ml LB ortamı ve uygun antibiyotikler de ertesi sabaha kadar). E. Lada geni (eksprese coli BBa_K398017 ) negatif kontrol olarak kullanılmıştır.
  2. Taze 5 LB ml (antibiyotik) ve inkübe içine gecede akıbet alt kültürünün 10 ul hücre bulanıklık 600 nm az 0,4 ile 0,3 arasındaki bir optik yoğunluk ulaşana kadar.
  3. Bir 0,1 OD 600 ulaşılıncaya kadar taze besiyeri ile kültürleri seyreltin.
  4. Uygun antibiyotik ve üç kopya halinde toksik bileşik (örneğin, 0, 4, 8, n-heksan ve% 10) uygun bir şekilde nihai konsantrasyon ihtiva eden 180 ul M9 ortam ile bir 96 oyuklu plaka yerleştirin. Alkan-su karışımları iki fazlı sistemlerde yol açabilecek Çünkü (örneğin d plaka üzerinde uygun kontrollerin olması esastırifferent suşları ile ilgili boş deneyler).
  5. Kuyulara kültürün 20 ul (kontrol) ilave edilir.
  6. Sabit sallama bir plaka okuyucu 37 24 saat boyunca her 10 dakikada ° C kullanarak biyokütle konsantrasyonu (OD 600) ölçün.
  7. Farklı bir ajan konsantrasyonları için ilgili ölçümlerden büyüme oranları hesaplayın ve negatif kontrol ile karşılaştırıldığında. Ortalama ve en az üç bağımsız ishal standart sapmayı hesaplayın.

8. Homolog Etkileşim Haritalama

  1. Uygulama HIM STRING veritabanı (akademik kullanım için ücretsiz) 20 çalıştıran bir PostgreSQL sunucu üzerinde protein sorguları gerçekleştirmek için geliştirilmiştir. Homolog etkileşimi haritalama uygulaması STRING veritabanı kullanarak orijinal konak organizma etkileşen proteinleri tanımlar. Söz konusu etkileşim gen dizileri hedef organizma içinde homolog genlerin bulmak için bir patlama arama kullanılır. Cytoscape 4 haritalama sonucu görselleştirmek için kullanılır. : HIM yazılım aracı indirilebilir https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
  2. Bir eşleme gerçekleştirmek için, (1) BioBrick kimliği girin ve uygulama otomatik olarak Standart Biyolojik parçaları 9, veya uygulama (2) enter (macun) dizisi verilerin kayıt defterinden parçası dizisi veri indirecektir.
  3. Girilen amino asit dizisi için STRING proteinin kimliğini bulmak için STRING Veritabanı web sitesini kullanın.
  4. Yüksek bir homolojiye sahip bir protein BLAST kullanılarak tespit edilir. Daha sonra uygulama konak organizma içinde homologları (örn. E. coli) için kaynak organizma ve arama içinde bilinen her etkileşimli protein listeler.
  5. Metin veya Cytoscape için oluşabilecek olası etkileşimi listesini verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alkan dönüşümü

Alkandan ilgili yağ asidine kadar olan üç oksidasyon aşamasının aktivitesi, dinlenme hücresi deneyleri ve enzim aktivitesi ölçümleri kullanılarak değerlendirildi. Sonuçlar, (1) alkan hidroksilaz, (2) alkol dehidrojenaz ve (3) aldehit dehidrojenaz yol reaksiyonlarını takiben sunulur.
İlk adım olarak, orta ve uzun zincirli alkanlar için farklı plazmitler inşa edildi. Plazmid BBa_K398014, orta zincirli alkan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BioBrick prensibi alkan bozulması için bir şase oluşturmak için kullanılan ve araç setinin tek bileşenleri için ilkesinin bir kanıtı elde edildi. Bazı deneyler, in vivo ve alkan alçaltıcı enzimler yolu in vitro aktivite ölçmek için önerilmiştir. Sunulan çalışmalar başarılı bir konak organizma içinde E. enzim aktiviteleri ile ifade belirlemek için kullanılabilecek bir dizi yöntem göstermektedir Uygun BioBricks uygulanmasından sonra coli. Üstelik, BioBrick prensip alkan bozulması için g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video-makale yapılan deneyler uluslararası Genetik Makinesi rekabete 9 için geliştirilmiştir. Yazarlar için iGEM ekip üyeleri Luke Bergwerff, Pieter van TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Cueto Rojas ve Ramon van der Valk teşekkür etmek istiyorum araştırma yardımı. Biz yararlı tartışmalar ve bu araştırma barındırma için Han de Winde, Stefan de Kok ve Esengül Yıldırım ederim. Bu çalışma Biyoteknoloji TU Delft Üniversitesi, Delft Biyoinformatik laboratuar, Bionanoscience TU Delft Bölümü, Oil Sands Liderlik İnisiyatifi (OSLI), damızlık studentenuitzendbureau, Hollanda Genomik Girişimi, Kluyver Merkezi, Nederlandse Biotechnologische Vereniging (Stichting Biyoteknoloji Nederland) tarafından desteklenmiştir DSM, Geneart, Greiner Bio-one ve Genencor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
E. coli K12New England BiolabsC2523H
OktanFluka74822
HexadecaneFluka52209
oktanol-1Fluka95446
dodekanol-1Sigma-Aldrich126799
HekzanSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4JT Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 ligazNew England BiolabsM0202L
Gaz kromatografı
Hücre bozucuLA BiyosistemlerCD-019
SpektrofotometreAmersham pharmaciaspec 2000
Plaka okuyucuTecan Group Ltd.Magellan v7.0
İnkübatör Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBDelft Teknoloji Üniversitesi, Biyoteknoloji veya Standart Biyolojik ParçalarınKayıt Defteri bölümündeBBa_K398014Alkan Hidroksilaz Sistemi
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Delft Teknoloji Üniversitesi, Biyoteknoloji veya Standart Biyolojik ParçalarınKayıt Defteri bölümündeBBa_K398027ladA Protein Jeneratörü
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Delft Teknoloji Üniversitesi, Biyoteknoloji veya Standart Biyolojik ParçalarınKayıt Defteri bölümündeBBa_K398018ADH jeneratörü
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Delft Teknoloji Üniversitesi, Biyoteknoloji veya Standart Biyolojik ParçalarınKayıt Defteri bölümündeBBa_K398030ALDH jeneratör
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398326: pCaiF Delft Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji veya Standart Biyolojik Parçaların Kayıt Defteri bölümündeBBa_K398326pCaiF destekleyici
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Delft Teknoloji Üniversitesi, Biyoteknoloji veya Standart Biyolojik Parçaların Kayıt Defteri bölümündeBBa_K398331>pCaiF ölçüm cihazı
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα -BBa_J61107- Delft Teknoloji Üniversitesi, Biyoteknoloji veya Standart Biyolojik Parçaların Kayıt DefteriBBa_K398406Solvent tolerans kümesi
Direnç: Kloramfenikol
bölümünde

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , CRC Press. (2007).
  3. Center, O. P. Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
  4. Cytoscape. An Open Source Platform for Complex Network Analysis and Visualization [Internet]. , Available from: http://www.cytoscape.org (2012).
  5. Non-Invasive Biomass Monitor with Wide Linear Range [Internet]. , Available from: http://www.buglab.com/docs/OnLineODMeasurement.pdf (2012).
  6. Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
  7. Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
  8. Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
  9. iGEM. Registry of Standard Biological Parts [Internet]. , Available from: http://partsregistry.org/Main_Page (2012).
  10. Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
  11. Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
  12. Kieboom, J., De Bont, J. aM. Bacterial Stress Responses. , ASM Press. Washington, D.C. (2000).
  13. Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355(2010).
  14. Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
  15. Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
  16. Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
  17. Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
  18. Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
  19. Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
  20. STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl (2012).
  21. Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
  22. Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Alkan DegradasyonuEscherichia coliBioBricks SistemiGen Ekspresyon D zenlemesiSolvent ToleransDinlenmi H cre DeneyleriSubstratla D zenlenen Promot rHidrokarbon ToleransSentetik Biyoloji

İlgili makaleler