Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Sulu Ortamlarda Hidrokarbon Dönüşüm Enable A Toolkit

13.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4182

⸱

2 Ekim 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, Delft University of Technology, 2Delft Center for Systems and Control, Delft University of Technology

Bu makalede

Özet

Petrol kirliliğinin iyileştirilmesi için bakteriyel sistemini düzenleyen sürdürülebilir bir otomatik standart değiştirilebilir DNA parçalarının (BioBricks) kullanılarak tasarlanmıştır. Bir mühendislik E. coli Gerilme toksik sulu ortamlarda β-oksidasyon yoluyla alkanlar indirgemek için kullanıldı. Farklı türlerden ilgili enzimler alkan bozulması aktivite göstermiştir. Için Ayrıca, artan bir tolerans N-Hekzan alkan dayanıklı bakterilerden gen değişimleri elde edilmiştir.

Özet

Bu çalışma ileriye Escherichia coli alkan dönüşüm sağlayan ve uygulanabilirlik ilkesinin bir kanıtı sunan bir araç koyar. Toolkit çoklu standart değiştirilebilir parçalar (BioBricks) 9 alkan dönüşüm, toksik hidrokarbon zengini ortamlarda gen ekspresyonu ve sağkalım düzenlenmesi ele oluşur.

Alkan bozulması için üç aşamalı yolun E. uygulanmıştır kendi alkanoller, alkanals ve sonuçta alkanoik asitler, orta ve uzun zincirli alkanlar dönüşümü sağlamak için coli. Ikincisi doğal β-oksidasyon yol üzerinden metabolize edildi. Orta-zincirli alkanlar (C5-C13) sikloalkanlar ve (C5-C8), Gordonia sp alkan hidroksilaz sistemi dört gen (alkB2, rubA3, rubA4 ve kolla) 'nin oksidasyonu kolaylaştırmak için. TF6 8,21 E. dönüştü coli. Ve dönüşüm içinUzun zincirli alkanlar (C15-C36), Geobacillus thermodenitrificans dan Lada gen uygulanmıştır. Bozulması sürecinin gerekli ileri adımlar için, ADH ve ALDH (G. thermodenitrificans menşeli) 10,11 tanıtıldı. Istirahat etkinlik hücrelerin analizi ile ölçülmüştür. Her oksidatif adım için, enzim aktivitesi gözlendi.

Süreci etkinliği optimize etmek için, ifade sadece düşük glikoz koşullar altında uyarılmıştır: bir alt-tabaka ile düzenlenen promotör, pCaiF kullanılmıştır. pCaiF E. mevcut coli K12 ve non-glikoz karbon kaynaklarının bozulma içerdiği genlerin ekspresyonunu düzenlemektedir.

Setinin son bölümü - yaşama hedefleme - PhPFDα ve β çözücü dayanıklılık genlerinin, Pyrococcus horikoshii OT3 hem kullanılarak uygulanmıştır. Organik solventler olumsuz affectin tarafından hücrenin stres neden ve beka azalmış olabilirg protein katlanması. Şaperonlar olarak, PhPFDα ve β alkan varlığı altında protein katlama işlemi örneğin arttırır. Kültür ortamı içinde% 10 n-heksan suretin artan bir büyüme oranı (% 50'ye kadar) ile gösterilen bir hidrokarbon iyileştirilmiş tolerans yol açmıştır, bu genlerin ekspresyonu görülmüştür.

Özetleme, sonuç seti E. sağlar belirtmek Sulu ortamlarda hidrokarbon dönüştürmek ve tolere coli. Bu nedenle, bir sentetik biyoloji yaklaşım kullanarak petrol iyileştirme için sürdürülebilir bir çözüm bulunması yönünde bir ilk adımdır.

Giriş

Petrol kirliliği, çevresel kontaminasyonun en ciddi nedenleri arasındadır ve ekosistemleri, işletmeleri ve toplulukları büyük ölçüde etkiler 3. Örneğin, Kanada'nın Alberta eyaletindeki petrol kumları atık sularından kaynaklanan sürekli petrol kirliliğiyle mücadele etmek için çözümlere ihtiyaç duyulmaktadır. Petrol kumlarından petrol çıkarma işlemi sırasında, petrolün yarı katı oksitlenmiş bir formu olan bitüm, tek bir varil petrol başına yaklaşık 3,1 varil su tüketen termal geri kazanım teknikleri kullanılarak uzaklaştırılır 1. Çoğunlukla yerel bir nehirden kaynaklanan, petrolle kontamine olmuş proses suyu, bitüm ekstraksiyonundan sonra atık havuzlarında depolanır. Taze su alımı ihtiyacını azaltmak amacıyla, proses suyunun daha etkili bir şekilde geri dönüştürülmesine ihtiyaç vardır. Bitüm ekstraksiyonunu kolaylaştırmak ve alt havzada yer alan bölgelerin suikaratik ekosistemlerin korunmasına yönelik su kalitesi kılavuzlarına uygunluğunu sağlamak için proses suyu arıtma yöntemleri hızla gelişmektedir 3.

Organik bileşiklerin neden olduğu kirliliği gidermek için günümüzde mikroorganizmaların kullanıldığı biyoremediasyon teknolojileri teşvik edilmektedir 1. Alkanlar, ham petrolde molekül başına 5 ila 40 karbon atomu içeren, en bol bulunan hidrokarbon ailesidir 7, 21. Birçok bakterinin, uç metil grubunun ardışık oksidasyonu yoluyla önce alkoller, ardından aldehitler ve son olarak yağ asitleri oluşturarak çeşitli uzunluktaki alkanları degrade ettiği bilinmektedir 8. Bu iGEM projesi kapsamında, farklı organizmalardan birkaç enzim eksprese edilip karakterize edilmiş ve BioBrick standardı ile Standart Biyolojik Parçalar Kaydı (Registry of Standard Biological Parts) aracılığıyla erişime sunulmuştur.

Gordonia sp. TF6'nın iyi çalışılmış alkan hidroksilaz sistemi; alkB2 (alkan 1-monooksijenaz), rubA3, rubA4 (iki rubredoksin) ve RubB (rubredoksin redüktaz) olmak üzere en az dört bileşen kullanarak C5-C13 alkanlarının ve C5-C8 sikloalkanların ilk oksidasyon basamağını kolaylaştırır 8, 21. Uzun zincirli alkanların (C15'ten C36'ya kadar) oksidasyonunun, Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2'den gelen bir flavoprotein alkan monooksijenaz olan ladA tarafından gerçekleştirildiği bildirilmiştir 7, 15, 18, 22. LadA, oksidasyon için atomik oksijeni kullanan flavin mononükleotid (FMN) ile katalitik bir kompleks oluşturur. Bu durum, alkanların karşılık gelen birincil alkanollere dönüşümüyle sonuçlanır. Alkoller, alkol ve aldehit dehidrojenazlar tarafından daha sonra yağ asitlerine okside edilir ve bu yağ asitleri kolayca β-oksidasyon yoluna girer 7, 21. Termofilik bakteri Geobacillus thermoleovorans B23'den gelen çinko bağımsız bir alkol dehidrojenaz, kofaktör olarak NAD+ kullanarak orta zincirli alkanolleri ilgili alkanallere okside eder 10. Aynı bakteriden gelen aldehit dehidrojenaz, orta zincirli oksidasyondaki NAD+-bağımlı son basamağı katalize edebilmektedir 11.

İndüksiyon maliyetlerini düşürmek ve bakteriyel sistemin optimal proliferasyonunu sürdürmek amacıyla, E.coli'den gelen pCaiF promotörü karakterize edilmiştir. Bu promotör, hidrokarbon degradasyon yolu bileşenlerinin ekspresyonunu düzenleyebilmekte olup glikoz seviyelerine bağlı olan cAMP-Crp seviyeleri tarafından regüle edilir 6. Ortamdaki yüksek hücre dışı glikoz konsantrasyonlarında, PTS aracılı glikoz transportunun bir yan etkisi olarak adenilil siklazın inhibisyonu yoluyla hücresel cAMP (siklik Adenozin Monofosfat) seviyesi düşük seyretmiştir. Buna karşın, kısıtlama (düşük glikoz konsantrasyonları) sırasında cAMP seviyesi artmış ve Crp, cAMP'ye bağlanarak pCaiF'ye bağlanan ve aşağı akış bileşenlerinin transkripsiyonunu aktive eden cAMP-Crp kompleksini oluşturmuştur 6, 14.

Yabani tip E. coli yalnızca orta düzeydeki hidrokarbon konsantrasyonlarını tolere edebilmektedir. Araç setini tamamlamak için hidrokarbon toleransı konusunun ele alınması gerekmiştir. Birkaç organik çözücüye toleranslı bakterinin, su-çözücü iki fazlı sistemlerde hayatta kalabildiği bilinmektedir 12. Toleransı artırdığı bilinen moleküler bileşenler, proteinlerin doğru katlanmasını kolaylaştıran şaperonlardır. Pyrococcus horikoshii OT3'ten gelen ve phPFDα ile phPFDβ proteinlerinden oluşan prefoldin sisteminin, hidrokarbon toleransını artırdığı gösterilmiştir 17.

Alkan dönüşüm araç kiti, Standart Biyolojik Parçalar Kayıt Defteri'nde 9 belgelenen BioBrick prensibi takip edilerek oluşturulmuştur. BioBrick'ler, her iki yanında 4 önceden tanımlanmış restriksiyon bölgesi bulunan spesifik bir fonksiyonel insert içeren plazmidlerdir. BioBrick insertleri esnek bir şekilde genişletilebildiğinden, yeni fonksiyonlara sahip biyolojik sistemlerin oluşturulmasına olanak tanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. BioBrick Meclisi

  1. Standart Biyolojik parçaları Sicilinden BioBricks iGEM merkez tarafından sağlanmaktadır. Mevcut BioBricks yeni bir BioBrick oluşturmak için, alıcı kısmın verici parça aşağı konumlandırılması için enzimler EcoRI ve SpeI ile verici BioBrick (en fazla 1.0 ug) sindirimi. Alıcı kısmının yukan verici parça konumlandırılması için Xbal ve PstI ile Digest. Donör omurgasında kesen bir üçüncü uygun restriksiyon enzimi ekleyin. Satıcı (nihai konsantrasyon 1 x) 'ye göre, uygun bir tampon ile 20-25 ml'lik bir toplam hacim içinde sindirimler gerçekleştirin. Restriksiyon enzimleri için 5 adet / mg DNA kullanın.
  2. EcoRI ve Xbal ya da SpeI ve PstI ile ya da alıcı BioBrick özet.
  3. 37. az bir saat (en az) için sindirimler inkübe ° C. Kısıtlama ısı endonükleazları Inactivate, 80 inkübasyon süre 10 dakika ve santrifüj ° C.
  4. Sindirilmiş BioBrick Arterbirlikte parçaları (verici ve alıcı). Xbal ve SpeI uyumlu DNA uçları oluşturur yana, bir karma site 4 standart kısıtlama siteleri ile çevrili yeni bir 'birleşik' BioBrick sonuçlanan herhangi bir restriksiyon enzimi ile kesilmiş olamaz oluşturulur. Ligasyon karışımı, bir son DNA konsantrasyonu, tercihen ~ 100 ng / ml 'den. T4 ligasyon tampon (nihai konsantrasyon 1 x) ve T4 ligaz (1 ünite / ug DNA) birlikte 10-15 ml'lik toplam hacim içinde ligasyon reaksiyonu gerçekleştirin.
  5. En azından 3 saat için 16 ° C 'de ligasyon karışımı inkübe edin.
  6. Ligasyon karışımı yaklaşık yarısı dönüşüm reaksiyonu gerçekleştirin.
  7. Sıralama ile doğru olmak BioBrick onaylayın.
  8. Sentezlenen DNA 'sından yeni BioBrick inşa etmek için, E. optimum ifade için sentez genleri için değiştirmek JCat web sitesi aracının (vasıtasıyla coli http://www.jcat.de/ ). B gereklerine uygun olarak daha fazla değişiklik yapın ioBrick standart. Bu standardizasyon her BioBrick bir önek öncesinde ve sonek ardından ilgi DNA dizisi oluşur anlamına gelir. Önek ve sonek kalan plazmid sırayla bulunmadığına önceden tanımlanmış kısıtlama siteleri içeren dizileri vardır. Bunlar standart kısıtlama siteleri değiştokuşu ve 9 esnek BioBrick ekler uzatmak mümkün kılar. Önek ve sonek aşağıdaki dizileri var:
Isim Sıra Yorumlamak
Önek 5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3'
5 'GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3' Aşağıdaki parçası kodlama sırası veya "ATG" ile başlayan herhangi bir bölümü ise
Sonek 5 'TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3'
In Vivo ove_title "> 2. Alkan Dönüşüm Dinlenme Hücre Deneyi,

Bu tahlil, Fujii ve diğ. (2004) tarafından tarif edilen yönteme göre yapıldı.

  1. Kültür E. Alkan Hidroksilaz sistemi (eksprese coli hücreleri BBa_K398014 bir boş vektör (taşıma) ve hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 5 ml LB ortam içinde).
  2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.3 bir OD (optik yoğunluk) ulaşana kadar inkübe edilir.
  3. 4,000 rpm'de 10 dakika boyunca santrifüje ve 5 ml 0.1 M fosfat tampon maddesi (pH 7.4) içinde tekrar süspansiyon pelet.
  4. 4,000 rpm'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüje ve artık E2 edilebilir tuzları ve% 0.66 hacim / hacim gliserol (nitrojen-ihtiva eden yetersizliklerin 5 ml 0.1 M fosfat tampon içinde tekrar süspansiyon pelett orta).
  5. Hücre bulanıklık (OD 600) ölçün.
  6. 25 ml kapalı bir kap cam şişeler ve herhangi bir hücre kontrol (E2 tuzları +% 0.66 hacim / hacim gliserol) içinde 6 ml hücre-alikotları karışım hazırlayın.
  7. Her şişeye alkan 100 nmol ekleyin.
  8. 24 saat (daha yüksek oranlar elde edildiği takdirde kısaltmak) için 37 ° C 'de karışımlarını.
  9. Inkübasyondan sonra OD 600 ölçün.
  10. Etil asetat ile kültür ortamı içinde hidrokarbon ayıklamak ve gaz kromatografisi (protokol 3'e bakınız) ile, hücre kültürü içinde hidrokarbon konsantrasyonu belirlenir.
  11. Her balona toplam biyokütle bugünkü (kuru ağırlık OD 600 dönüştürmek) tarafından dönüştürülmüş alkan toplam miktarı bölerek biyokütle birim bozulması hesaplayın. Deney süresi sonucu bölerek birim zamanda birim biyokütle başına degradasyon aktivitesinin verir. Ortalama üç ayrı çalışır alınır.

3. Alkan Dönüşüm Enzim Testi, Inİn Vitro

Bu tahlil, Li ve diğ. (2008) tarafından tarif edilen metoda göre esasen yapıldı.

  1. Kültür E. Lada gen (eksprese coli hücreleri BBa_K398017 ) ve boş vektör (taşıyan hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 50 mL LB ortam içinde).
  2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.6 bir optik yoğunluğa ulaşıncaya kadar inkübe edilir.
  3. 4000 rpm (4 ° C) de 10 dakika santrifüjlenir ve 50 mM Tris tamponu, 5 ml içinde pelet tekrar süspansiyon.
  4. 4 bir çıkış kontrolü ile% 40 görev devresi sonikasyon (Hücre bölücü, LA Biyosistem) hücreler, süresi boyunca buz üzerinde çözüm tutmak.
  5. 4 ve d az 4000 rpm'de 5 dakika için elde edilen karışım santrifüjlenirörneğin, C hücre enkaz kaldırmak için. Taze bir flakon süpernatant aktarın.
  6. Bradford tahlili ile hücre özlerinin toplam protein konsantrasyonu belirlenir. Not: Arka plan artış ve / veya protein kaybını önlemek için cam şişe kullanın.
  7. % 0.1 v / v alkan ve 50 mM Tris-HCl tampon içeren 100 ml'lik bir karışım hazırlayın.
  8. 5 dakika boyunca 100 ° C'de karışım ısıtılır. Not: Sadece yüksek kaynama noktasına sahip orta-uzun zincirli alkanlar için bu adımı gerçekleştirin. (Örneğin C 16: 287 ° C).
  9. Alkan optimal bir çözünürlük elde etmek için, 1 dak hala sıcak iken homojen, viskoz karışım elde edilinceye kadar için sonikasyon.
  10. 1 mM NADH, 1 mM FMN, 1 mM MgSO4 ve 0.01 h / h Triton X-100 ilave edin.
  11. 25 ml kapalı kap şişeleri içinde 6 ml alikotları hazırlayın.
  12. Hücre ekstresi yeterli miktarda (Bradford deneyleri, 5 mg protein / l son konsantrasyon bağlıdır) ekleyin. No-proteini kontrol hazırlayın.
  13. Optimal e 60 ° C (inkübe24 saat süre ile) aktivitesi nzymatic.
  14. Etil asetat ile kültür ortamı içinde hidrokarbon ayıklamak ve gaz kromatografisi (protokol 3'e bakınız) ile, hücre kültürü içinde hidrokarbon konsantrasyonu belirlenir.
  15. Toplam protein tarafından dönüştürülmüş alkan toplam miktarı bölerek biyokütle birim bozulması hesaplayın Her balona (Bradford kalibrasyon eğrisi ile) eklendi. Ayrıca deneme süresi bölünerek birim zamanda hücresel protein birim degradasyon aktivitesinin verir. Ortalama üç ayrı çalışır alınır.

4. Etil Asetat Hidrokarbon Ekstraksiyon ve Konsantrasyon Ölçümleri

  1. Alkanların 6 ml deney için 2.5 ml çözelti, etil asetat (apolar çözücü) ilave edilerek sulu bir çözelti elde edilir. Dahili bir standart% 0.1 'lik bir konsantrasyonda (v / v) de çözücü ilave edilir. Standart (örn. siklo-dekan) ilgi doruklarına beklenen aralığına bağlı olarak değişmektedir.
  2. Opsiyonel: Add TritonSulu karışım, X-100 ve uygun bir iki faz sistemi elde etmek için 4000 rpm'de 10 dakika için numune santrifüjlenir.
  3. Girdap iki faz ayrı kadar 5 saniye (1,500 rpm) ile, oda sıcaklığında inkübe edin karışımı.
  4. Organik katman (üst) arasında bir maksimum miktarda kaldırma ve susuz magnezyum sülfat ile çözücü kurutun.
  5. Filtrasyon (0.2 mikron) tarafından MgSO4 çıkarın ve -20 ° C'de ölçümleri için gaz kromatografisi şişeleri içine süzülen veya mağaza aktarmak
  6. CP-SIL 5CB kolon (uzunluk = 5 kg) kullanılarak gaz kromatografisi ile konsantrasyonunun belirlenmesi. (1:10, 230 ° C) bölünmüş modda numune 10 ml enjekte edilir. 1 ml / dk (helyum) ile kolon gaz akış ayarlayın. Aşağıdaki fırın sıcaklık programı kullanılmıştır:
    Oran Sıcaklık [° C] Zaman [dk]
    0 50 7.5
    50 90 1.0
    50 110 2.0
    50 130 2.0
    50 145 2.0
    50 160 2.0
    50 170 2.0
    50 185 2.0
    50 210 2.0
    50 250 2.0
    50 320 2.0
  7. Zirveleri entegre ve iç standart ile ilgili olarak konsantrasyonları düzeltin.

5. Alkol / Aldehit Dehidrogenaz Aktivitesi Testi

Bu tahlil, Kato ve diğerleri tarafından tarif edilen metoda göre esasen yapıldı.(2010).

  1. Kültür E. ADH (eksprese coli hücreleri BBa_K398018 ) ya da ALDH ( BBa_K398030 ) geni ve bir boş vektör (taşıyan hücreler BBa_J13002 gece boyunca uygun antibiyotikler ile 50 mL LB ortam içinde).
  2. Taze LB 50 ml (antibiyotik) ile gece boyunca kültür içine 500 ul aktarın ve hücre bulanıklık 600 nm'de 0.6 bir optik yoğunluğa ulaşıncaya kadar inkübe edilir.
  3. 4 ° C'de 4,000 rpm'de 10 dakika santrifüjlenir ve 50 mM Tris tamponu, 5 ml içinde pelet tekrar süspansiyon.
  4. 4 bir çıkış kontrolü (sonication sırasında buz üzerinde çözüm tutmak) ile% 40 görev devresi hücre çözümü sonikasyon.
  5. ° C hücre tortularını çıkarmak üzere 4 az 4000 rpm'de 5 dakika için elde edilen karışım santrifüjleyin.
  6. Göre belirlenir(: Protein bağlama önlemek için bir cam şişe kullanın Not) Bradford yöntemi ile hücre ekstreleri tal protein konsantrasyonu.
  7. 180 ul 57 mM glisin tampon her bir kuyu içinde NAD (nihai konsantrasyon 1 mM, pH 9.5) ihtiva eden 96 oyuklu bir plaka yerleştirin.
  8. Kuyular için test edilecek olan alkol (aldehit) 5 ul ekle. Not: bir sıvı olması testin başlamasından önce ısı uzun zincirli alkoller. Her bir alkol (aldehit) alt tabaka olmadan bir kontrol (negatif kontrol) ilave edilmelidir. Buna ek olarak, hücre özütü olmaksızın substrat tampon ve bir karışımını içeren bir boş hazırlanır.
  9. Ön ısıtma 37 'de 15 dakika için plaka okuyucu (Tecan Macellan v7.0) ve plaka ° C sisteminin denge sağlamak için.
  10. Hücre ekstresi yeterli miktarda (Bradford deneyleri, 5 mg protein / l son konsantrasyon bağlıdır) ekleyin. No-proteini kontrol hazırlayın.
  11. 340 nm dalga boyunda 37 1 saat için her 2-3 dakikada ° C
  12. OD (340 nm) eğiminden NADH üretim hızını hesaplayın. Dikkate ışık yolu uzunluğu ve 6220 M -1 cm -1 NADH sönüm katsayısı atın. Protein toplam miktarına göre NADH üretim hızı bölme hücre özütü olarak dehidrogenaz reaksiyonu (U / mg tam hücre protein) aktivitesinin eklendi. Ortalama ve üç bağımsız çalışır gelen standart sapmayı hesaplayın.

6. pCaiF Karakterizasyonu

  1. Kültür E. pCaiF-GFP construct (ifade coli hücreleri BBa_K398331 ) ve yalnız organizatörü (taşıyan hücreler BBa_K398326 uygun antibiyotik gecede 5 ml LB orta gecede).
  2. 5 ml M9 gece boyunca kültürün 50 ul ile 10 g / l glukoz ve antibiyotik içeren inoküle ve gece boyunca büyümeye.
  3. Gecede akıbet alt kültürünün 50 ul taze M9 with10 g / l ve inkübe 5 ml içine hücre bulanıklık 600 nm'de 0.2 optik yoğunluk ulaşana kadar.
  4. Her bir kuyudaki test için karbon kaynağı, istenen miktarda içeren taze M9 ortam 100 ul ile bir 96 kuyulu plakanın yerleştirin. İstatistiksel değerlendirme için üç nüsha deneyler gerçekleştirin ve ilgili negatif kontroller (yabani tip E. coli K12) ekleyin.
  5. Sıvısı içeren kuyucuklara gece boyunca kültür 5 ul ekle.
  6. Büyüme eğrisi (OD 600) ve bir plaka okuyucu kullanarak GFP floresan (485 nm eksitasyon ve emisyon 520) 37 18 saat süreyle her 10 dakikada ° C sabit sallama ile ölçün.
  7. Büyüme hızı ve ilgili ölçümlerden özel GFP miktarı hesaplanır ve kontrol karşılaştırın. Ortalama, en az üç bağımsız deneyin standart sapma hesaplanır.

7. Tolerans Testi

  1. KültürE. coli PhPFDα ve β gen (eksprese BBa_K398406 5 ml LB ortamı ve uygun antibiyotikler de ertesi sabaha kadar). E. Lada geni (eksprese coli BBa_K398017 ) negatif kontrol olarak kullanılmıştır.
  2. Taze 5 LB ml (antibiyotik) ve inkübe içine gecede akıbet alt kültürünün 10 ul hücre bulanıklık 600 nm az 0,4 ile 0,3 arasındaki bir optik yoğunluk ulaşana kadar.
  3. Bir 0,1 OD 600 ulaşılıncaya kadar taze besiyeri ile kültürleri seyreltin.
  4. Uygun antibiyotik ve üç kopya halinde toksik bileşik (örneğin, 0, 4, 8, n-heksan ve% 10) uygun bir şekilde nihai konsantrasyon ihtiva eden 180 ul M9 ortam ile bir 96 oyuklu plaka yerleştirin. Alkan-su karışımları iki fazlı sistemlerde yol açabilecek Çünkü (örneğin d plaka üzerinde uygun kontrollerin olması esastırifferent suşları ile ilgili boş deneyler).
  5. Kuyulara kültürün 20 ul (kontrol) ilave edilir.
  6. Sabit sallama bir plaka okuyucu 37 24 saat boyunca her 10 dakikada ° C kullanarak biyokütle konsantrasyonu (OD 600) ölçün.
  7. Farklı bir ajan konsantrasyonları için ilgili ölçümlerden büyüme oranları hesaplayın ve negatif kontrol ile karşılaştırıldığında. Ortalama ve en az üç bağımsız ishal standart sapmayı hesaplayın.

8. Homolog Etkileşim Haritalama

  1. Uygulama HIM STRING veritabanı (akademik kullanım için ücretsiz) 20 çalıştıran bir PostgreSQL sunucu üzerinde protein sorguları gerçekleştirmek için geliştirilmiştir. Homolog etkileşimi haritalama uygulaması STRING veritabanı kullanarak orijinal konak organizma etkileşen proteinleri tanımlar. Söz konusu etkileşim gen dizileri hedef organizma içinde homolog genlerin bulmak için bir patlama arama kullanılır. Cytoscape 4 haritalama sonucu görselleştirmek için kullanılır. : HIM yazılım aracı indirilebilir https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping.
  2. Bir eşleme gerçekleştirmek için, (1) BioBrick kimliği girin ve uygulama otomatik olarak Standart Biyolojik parçaları 9, veya uygulama (2) enter (macun) dizisi verilerin kayıt defterinden parçası dizisi veri indirecektir.
  3. Girilen amino asit dizisi için STRING proteinin kimliğini bulmak için STRING Veritabanı web sitesini kullanın.
  4. Yüksek bir homolojiye sahip bir protein BLAST kullanılarak tespit edilir. Daha sonra uygulama konak organizma içinde homologları (örn. E. coli) için kaynak organizma ve arama içinde bilinen her etkileşimli protein listeler.
  5. Metin veya Cytoscape için oluşabilecek olası etkileşimi listesini verin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Alkan dönüşümü

Alkanlardan ilgili yağ asitlerine kadar gerçekleşen üç oksidasyon basamağının aktivitesi, dinlenme halindeki hücre deneyleri ve enzim aktivitesi ölçümleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar, yolak reaksiyonlarını takip edecek şekilde sunulmuştur: (1) alkan hidroksilaz, (2) alkol dehidrogenaz ve (3) aldehit dehidrogenaz.
İlk adım için, orta ve uzun zincirli alkanlar için farklı plazmitler oluşturulmuştur. Plazmit

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

BioBrick prensibi alkan bozulması için bir şase oluşturmak için kullanılan ve araç setinin tek bileşenleri için ilkesinin bir kanıtı elde edildi. Bazı deneyler, in vivo ve alkan alçaltıcı enzimler yolu in vitro aktivite ölçmek için önerilmiştir. Sunulan çalışmalar başarılı bir konak organizma içinde E. enzim aktiviteleri ile ifade belirlemek için kullanılabilecek bir dizi yöntem göstermektedir Uygun BioBricks uygulanmasından sonra coli. Üstelik, BioBrick prensip alkan bozulması için g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu video-makale yapılan deneyler uluslararası Genetik Makinesi rekabete 9 için geliştirilmiştir. Yazarlar için iGEM ekip üyeleri Luke Bergwerff, Pieter van TM Boheemen, Jelmer Cnossen, Hugo F. Cueto Rojas ve Ramon van der Valk teşekkür etmek istiyorum araştırma yardımı. Biz yararlı tartışmalar ve bu araştırma barındırma için Han de Winde, Stefan de Kok ve Esengül Yıldırım ederim. Bu çalışma Biyoteknoloji TU Delft Üniversitesi, Delft Biyoinformatik laboratuar, Bionanoscience TU Delft Bölümü, Oil Sands Liderlik İnisiyatifi (OSLI), damızlık studentenuitzendbureau, Hollanda Genomik Girişimi, Kluyver Merkezi, Nederlandse Biotechnologische Vereniging (Stichting Biyoteknoloji Nederland) tarafından desteklenmiştir DSM, Geneart, Greiner Bio-one ve Genencor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
E. coli K12New England BiolabsC2523H
OktanFluka74822
HekzadekanFluka52209
oktanol-1Fluka95446
dodekanol-1Sigma-Aldrich126799
HeksanSigma-Aldrich296090
NADHSigma-AldrichN4505
FMNSigma-AldrichF2253
MgSO4J.T. Baker Casno7487 889
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
T4 ligazNew England BiolabsM0202L
Gaz kromatografı
Hücre parçalayıcıLA BiosystemsCD-019
SpektrofotometreAmersham Pharmaciaspec 2000
Plaka okuyucuTecan Group Ltd.Magellan v7.0
İnkübatör Innova, 44
BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-alkB2-BBa_J61100-rubA3-BBa_J61100-rubA4- BBa_J61100-rubBDelft Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji bölümü veya Standart Biyolojik Parçalar KaydıBBa_K398014Alkan Hidroksilaz Sistemi
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-ladA Delft Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji bölümü veya Standart Biyolojik Parçalar Kayıt DefteriBBa_K398027ladA Protein Üreteci
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-ADH Delft Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji bölümü veya Standart Biyolojik Parçalar Kayıt DefteriBBa_K398018ADH jeneratörü
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-ALDH Delft Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji Bölümü veya Standart Biyolojik Parçalar KaydıBBa_K398030ALDH jeneratörü
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398326: pCaiF Delft Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji Bölümü veya Standart Biyolojik Parçalar Kayıt DefteriBBa_K398326pCaiF promotörü
Direnç: Kloramphenicol
BioBrickTM K398331: pCaiF-BBa_B0032-BBa_I13401Delft Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji bölümü veya Standart Biyolojik Parçalar Kayıt DefteriBBa_K398331pCaiF ölçüm cihazı
Direnç: Kloramfenikol
BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-phPFDα-BBa_J61107- Delft Teknoloji Üniversitesi Biyoteknoloji Bölümü veya Standart Biyolojik Parçalar Kayıt DefteriBBa_K398406Çözücü toleransı kümesi
Direnç: Kloramfenikol

Kaynaklar

  1. Allen, E. W. Process water treatment in Canada's oil sands industry: I: Target pollutants and treatment objectives. J. Environ. Eng. Sci. 7, 123-138 (2008).
  2. Alon, U. An Introduction to Systems Biology: Design Principles of Biological Circuits. , CRC Press. (2007).
  3. Center, O. P. Understanding Oil Spills and Oil Spill Response. , (1999).
  4. Cytoscape. An Open Source Platform for Complex Network Analysis and Visualization [Internet]. , Available from: http://www.cytoscape.org (2012).
  5. Non-Invasive Biomass Monitor with Wide Linear Range [Internet]. , Available from: http://www.buglab.com/docs/OnLineODMeasurement.pdf (2012).
  6. Eichler, K., Buchet, A., Lemke, R., Kleber, H. P., Mandrand-Berthelot, M. A. Identification and characterization of the caiF gene encoding a potential transcriptional activator of carnitine metabolism in Escherichia coli. J. Bacteriol. 178, 1248-1257 (1995).
  7. Feng, L., Wang, W., Cheng, J., Ren, Y., Zhao, G., Gao, C., Tang, Y., Liu, X., Han, W., Peng, X., et al. Genome and proteome of long-chain alkane degrading Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 isolated from a deep-subsurface oil reservoir. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (13), 5602-5607 (2007).
  8. Fujii, T., Narikawa, T., Takeda, K., Kato, J. Biotransformation of various alkanes using the Escherichia coli expressing an alkane hydroxylase system from Gordonia sp. TF6. Biosci. Biotechnol. Biochem. 68 (10), 2171-2177 (2004).
  9. iGEM. Registry of Standard Biological Parts [Internet]. , Available from: http://partsregistry.org/Main_Page (2012).
  10. Kato, T., Miyanaga, A., Haruki, M., Imanaka, T., Morikawa, M., Gene Kanaya, S. cloning of an alcohol dehydrogenase from thermophilic alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23. J. Biosci. Bioeng. 91 (1), 100-102 (2001).
  11. Kato, T., Miyanaga, A., Kanaya, S., Morikawa, M. Gene cloning and characterization of an aldehyde dehydrogenase from long-chain alkane-degrading Geobacillus thermoleovorans B23. Extremophiles. 14, 33-39 (2010).
  12. Kieboom, J., De Bont, J. aM. Bacterial Stress Responses. , ASM Press. Washington, D.C. (2000).
  13. Kotte, O., Zaugg, J. B., Heinemann, M. Bacterial adaptation through distributed sensing of metabolic fluxes. Mol Syst Biol. 6, 355(2010).
  14. Kremling, A., Bettenbrock, K., Gilles, E. D. Analysis of global control of Escherichia coli carbohydrate uptake. BMC Syst. Biol. 1, (2007).
  15. Li, L., Liu, X., Yang, W., Xu, F., Wang, W., Feng, L., Bartlam, M., Wang, L., Rao, Z. Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase. J. Mol. Biol. 376 (2), 453-465 (2008).
  16. Lin, H. Y., Mathiszik, B., Xu, B., Enfors, S. O., Neubauer, P. Determination of the maximum specific uptake capacities for glucose and oxygen in glucose-limited fed-batch cultivations of Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. 73 (5), 347-357 (2001).
  17. Okochi, M., Kanie, K., Kurimoto, M., Yohda, M., Honda, H. Overexpression of prefoldin from the hyperthermophilic archaeum Pyrococcus horikoshii OT3 endowed Escherichia coli with organic solvent tolerance. Appl. Microbiol. Biotechnol. 79 (3), 443-449 (2008).
  18. Rehm, H. J., Reiff, I. Mechanisms and occurrence of microbial oxidation of long-chain alkanes. Adv. Biochem. Eng. / Biotechnol. 19, 175-215 (1981).
  19. Rojo, F. Degradation of alkanes by bacteria. Environ. Microbiol. 11 (10), 2477-2490 (2009).
  20. STRING 9.0 Known and Predicted Protein-Protein Interactions [Internet]. , Available from: http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl (2012).
  21. Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes. Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).
  22. Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes. Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Alkan DegradasyonuEscherichia coliBioBricks SistemiGen Ekspresyon D zenlemesiSolvent ToleransDinlenmi H cre DeneyleriSubstratla D zenlenen Promot rHidrokarbon ToleransSentetik Biyoloji
Sulu Ortamlarda Hidrokarbon Dönüşüm Enable A Toolkit
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.