Yöntem makalesi

Amiloid prekürsör protein intrasellüler Domain saflaştırılması ve toplama

DOI:

10.3791/4204

⸱

28 Ağustos 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Texas Medical Branch , 2Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

APP hücre içi etki alanı (AICD) büyük ölçekli arıtma için bir yöntem tarif edilmektedir. Ayrıca teşvik etmek için yöntemler tarifedilmiştir In vitro AICD agregasyonu ve görselleştirme. Açıklanan yöntemler / biyokimyasal yapı AICD karakterizasyonu ve agregasyonu üzerinde moleküler şaperonlar etkileri için yararlıdır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Amiloid prekürsör protein (APP) Alzheimer hastalığı (AH) patogenezi ile ilişkili bir tip I transmembran proteindir. APP büyük ekstrasellüler domain ve APP hücre içi etki alanı (AICD) olarak adlandırılan kısa bir sitosolik etki ile karakterize edilir. Salgı yolu ile olgunlaşma sırasında, APP α, β, ve γ-secretases 1 olarak adlandırılan proteaz tarafından bölünebilir. Ve γ-β secretases ile APP ardışık proteolitik bölünme bir küçük peptid proteolitik olarak adlandırıldı, Aβ, amiloidojenik ve senil plaklar çekirdek bileşenin üretimine yol açar. AICD sekretaz işlendikten sonra da membran kurtarılmasının ve Fe65 ve Tip60 olan etkileşimleri sayesinde, birden fazla hedef genlerin 2,3 transkripsiyon regülasyonu katılmaya çekirdeğine doğru olabilir. AICD içeren protein-protein etkileşimleri ticareti, işlenmesi, ve sanal-APP ve C-termin hücresel fonksiyonları etkileyebilirark parçaları. Biz son zamanlarda AICD AD-karıştığı moleküler şaperon ubiquilin-1 4 tarafından inhibe edilir vitro agrega ve bu süreç olduğunu göstermiştir. Fe65 7 bağlı olduğunda bu bulgularla tutarlı olarak, AICD hidrofobik etki ortaya çıkarmıştır ve kendinden vitro 5,6 olarak bozulup, ancak kararlı ikincil yapı alır. Biz ubiquilin-1 in vitro ve 4 sağlam hücreleri agregasyonu engelleyen AICD uygunsuz arası ve molekül içi etkileşimleri engeller önerdi. Çalışmaların çoğu AD patogenezinde APP rolü üzerinde odaklanırken, bu süreçte AICD rolü net değildir. AICD ekspresyonu sinyal yollarının 9 modüle etmek için, apoptoz 8 indüklemek için, ve 10 sinyal kalsiyum düzenleme gösterilmiştir. Bir transgenik fare modelinde AICD ve Fe65 Over ifade patolojisi 11 gibi Alzheimer indükler ve son zamanlarda AICD sutyen tespit edildiUygun antijen geri kazanım teknikleri 12 kullanırken batı blot tarafından özütündeki. AICD yapısal, biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmaları kolaylaştırmak için, biz çok saf AICD protein Birleştirilerek büyük miktarlarda üretmek için bir prosedür geliştirmiştir. Daha ileri atomik kuvvet mikroskopi ile analiz AICD ve in vitro termal agregasyonu indüklenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Açıklanan yöntemler, biyokimyasal biyo-fiziksel, ve yapısal AICD karakterizasyonu ve AICD agregasyonu üzerinde moleküler şaperonlar etkileri için yararlıdır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rekombinant APP intrasellüler Domain (AICD) İfadesi

  1. Dönüşümü E. coli vektörü pGEX-4T-1 (GE Healthcare) klonlanmış insan AICD (artıkları APP 649-695, nöronal izoform numaralandırma) ile BL21 süzün. Bu vektör (GST), glutation-S-transferaz, bir füzyon proteininin C-terminal parçası olarak AICD ifade edecektir. Bu vektör de GST kısmının çıkarılmasını kolaylaştırmak için bir trombin bölünme sekansı kodlar. PGEX-4T-1'e AICD klonlama Detaylar önceki yayında 4 bulunabilir.
  2. Tek bir koloniden, ampisilin (100 ug / ml) LB et suyu, 10 ml inoküle, ve güçlü sallama ile 37 ° C de bir gece boyunca inkübe edilir.
  3. Ertesi sabah, gece....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolü biz, yapısal biyofiziksel ve biyokimyasal analizler için son derece saf AICD elde etmek için bir prosedürü var. Bu işlem karmaşık kromatografi ekipman gerektiren ve bu nedenle birçok laboratuar erişilebilir değil. Diğer gruplar / biyokimyasal yapısal analizler için GST-AICD 17-19 dahil AICD 5-7,16 saflaştırılmış var. Önceki protokol dezavantajları zayıf AICD 16, çözünürlük, ideal bir saflık 17 den daha az, ve boyut dışlama 16 için gereksinim vardır ya d.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar cDNA APP Dr Hui Zheng (Baylor College of Medicine) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH hibe R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), Biyomedikal Araştırma John Sealy Memorial Endowment Fund (AFO), ve Jean C. ve William D. Willis Nöroloji Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi (ESS). JMB Translasyonel Araştırmacı Programı, bir bilgin ve Texas Medical Branch Claude E. Pepper Eski Amerikalıların Bağımsızlık Merkezi Of Üniversitesi üyesi (NIH Grants sırasıyla UL1RR029876 ve P30-AG-024832, tarafından desteklenen) 'dir.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
pGEX-4T-1 GE Healthcare 28-9545-49
Trombin GE Healthcare 27-0846-01
Ampisilin Fisher Scientific BP1760
Bradford protein tayini reaktifi Bio-Rad 500-0002
Coomassie mavisi Bio-Rad 161-0786
IPTG (izopropil-beta-D thiogalactopyranoside) Sigma-Aldrich I6758
Glutatyon-agaroz Sigma-Aldrich G4510
p-aminobenzamidine-agaroz Sigma-Aldrich A7155
Komple proteaz inhibitörü kokteyl Roche 11836170001
Slide-A-Lyzer diyaliz kasetleri Thermo Scientific 66380
Kromatografi kolonları Evergreen Bilimsel 208-3367-050
Emülgatör Avestin, Inc EmulsiFlex-C3 Tavsiye
Eppendorf Thermomixer Eppendorf 022670107
Mika Diskler Ted Pella 50-12
AFM konsollar Bruker MSNL-10
WSxM yazılım Nanotec N / A Free indir

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
  2. Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Protein Safla t rmaTrombin KesimiGST F zyonuTermal AgregasyonAtomik Kuvvet MikroskobuProtein AgregasyonuMolek ler aperonWestern Blotlama

İlgili makaleler