Canlı Hücre Floresan Mikroskopi kullanma Bakteriyel Toksin İsteyerek Yanıtların Görselleştirme

Özet

Rekombinant gelen kolesterol bağlayıcı toksin Streptolizin O arındırıcı Yöntemleri E. coli ve görüntüleme tarif edilmektedir. Toksin Lokalize teslimat toksin biyoloji romanı yönlerini açığa hedeflenen hücrelerde hızlı ve karmaşık değişikliklere sebep olur.

Özet

Bakteriyel toksinler hücresel içeriği ve dış ortamdan malzemelerin akını sızıntı izin gözenekleri oluşturan, zarlarında kolesterol bağlamak. Hücre ya aktif zarı tamir işlemleri gerektiren bu hakaret, kurtarmak, ya da başka bir toksine maruz kalma ve hücre tip ¹ miktarına bağlı olarak ölebilir. Buna ek olarak, bu toksinlerin pro-inflamatuvar sitokinlerin ² bir dizi üretmek makrofajlar dahil immün hücrelerin aktivasyonu yoluyla enfekte barındıran güçlü inflamatuar yanıtı indükler. Pek çok Gram pozitif bakteriler, büyük ölçüde karakterize olmamış mekanizmalar yoluyla virülans katkı gösterilmiştir kolesterol bağlayıcı toksinler üretirler.

Bu toksinlere maruz hücrelerin plazma membranında Morfolojik değişiklikler intrinsik hücresel savunma düşündüren, ekstrasellüler boşluğa döken olabilir kolesterol bakımından zengin yüzey çıkıntıları, onların haciz dahilmekanizması ^3,4. Bu işlem, metabolik etkinlik yokluğunda tüm hücrelerde meydana gelir, ve kimyasal tespit sonra ⁴ EM kullanılarak görüntülenebilir. Böyle toksine maruz kalma yanıt olarak inflamasyon aracılık makrofaj gibi immün hücrelerde indüklenen membran veziküller IL-1 ailesi sitokinler içermesi önerilmektedir ve toksin atma ve bu pro-inflamatuar sitokinler ^5,6,7 yaymak için hem de sorumlu olabilir. Hem ⁸ kaspaz-1 bağımlı süreçlerin gibi IL-1β salınımı ve hücre ölümü belirli bir türü arasında bir bağlantı, adlandırdığı pyroptosis ileri sürülmüştür. Membran vezikül toksin bağlayıcı, dökülme, sitokin salınımı, ve potansiyel olarak hücre ölümü içeren bu makrofaj yanıtı, karmaşıklığı çözmek için, biz de dahil olmak üzere, toksin-hücre etkileşimleri gerçek zamanlı görselleştirme için izin etiketleme teknikleri ve floresans mikroskobu yöntemleri geliştirmişlerdir fonksiyon bozukluğu ve ölüm ölçümleri (Şekil 1). Kullanmakcanlı hücre görüntüleme diğer teknikleri sınırlamaları nedeniyle gereklidir. Flow sitometri bireysel hücrelerin yüksek çözünürlüklü, gerçek zamanlı görselleştirme sunmaz ise Biyokimyasal yaklaşımlar, bireysel hücrelerin meydana etkilerini çözemez. Burada açıklanan yöntemlerle hücrelerde kompleks fenotip değişiklikleri içeren başka bir uyarıya bağlı yanıt kinetik analizi için uygulanabilir.

Protokol

1. Streptolizin O Saflaştırılması (SLO)

1. 0.5 L LB et suyu içine plazmid pBADgIII-SLOhis ⁹ içeren BL21 GOLD hücre, 20 ml gecelik kültürü aşılamak ve 500 ul 50 mg / ml ampisilin ilave edin. 37 ° C'de 225 rpm'de kültür çalkalanır OD ₆₀₀ kadar = 0.6, genelde 1.5 saat ~. 10,000 5 dk xg az 1 ml bakteri (T ₀ kabul) santrifüjleyin, 140 ul 1x SDS numune tamponu / 1 OD pelet çözülür ve protein saflık analizi için kesme DNA sonikasyon.
2. Kültür için 5 ml% 20 arabinoz ilavesi ile bakterilerin neden, 3 saat boyunca oda sıcaklığında 225 rpm de çalkalanır. , Bakteri 1 ml santrifüj toplayın ve yukarıda belirtildiği gibi safl....

Sonuçlar

Tipik olarak 10 ⁷ -10 ⁸ U / ml SLO 4 mg / ml 'lik bir protein konsantrasyonuna ile elde edilebilir. Hücre parçalama için gerekli toksin miktarı hücre türüne göre değişir, ancak genellikle 125-500 U / ml SLO (Şekil 2B) olduğunu. Diğerleri (özellikle T hücre hatları) daha duyarlı olsa makrofajlar gibi Hücre tipleri (4000 U / ml) daha dirençli olabilir. Bu duyarlılık, ticari olarak temin SLO karşılık gelir. Toksin aktivitesi toksin her parti veya çözülme ile çok hemolitik deneyler.......

Tartışma

Teknikleri bakteriyel toksinler bağışıklık hücrelerinin yanıtların incelenmesine olanak burada açıklanan. En kritik adım toksin kullanım ve dozaj olduğunu. Toksin aktivitesi hatta kırılganlık dolayı aynı hazırlanması farklı alikotları arasında, son derece değişken olabilir. Bu ya bir referans hücre hattı veya RBCs karşı toksin her kısım test veya toksin gradyanlar kullanarak gerektirir. Toksin gradyanlar gibi mikropipet tarafından teslim, gerçek zamanlı olarak uyulması gereken toksin kaynaklı faaliyetlerin tam spektrum .......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Ni-NTA agaroz	Qiagen	30210
polimiksin-agaroz	Sigma	P1411-5ML
Zeba desalt Spin col	Balıkçı	PI-89891
koyun RBCs	Balıkçı	50-415-688
pBADgIII-SLO	N / A	N / A	ref 9'a bakınız
Cy5 monoreactive boya	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Yaşam Teknolojileri	F1221
Calcein AM / Ethidium homodimer	Yaşam Teknolojileri	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
kollajen kaplı cam alt tabak	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
Femto-ucu II	Balıkçı	E5242957000
Microloader	Balıkçı	E5242956003
dekstran Alexa 555	Yaşam Teknolojileri	D34679
InjectMan NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Belirli reaktifler ve equipm Tablo 1. Liste ve kaynakent gerekli. Şirket ve katalog numarası ile birlikte bu protokolde kullanılan özel ekipman ve reaktifler, listelenir.
			Tampon Kompozisyon İkinci Adım Yıkama / Lyse 50 mM NaH 2 PO 4 300 mM NaCl 10 mM imidazol, pH 8.0 1.4 Tris / tuz 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Seyreltme Tampon 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazol 1.8 RBC deney tamponu % 0.3 BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 tampon R / B RPMI hücre kültür ortamı 2 mM CaCl2 % 0.5 BSA 3.1
			Bu protokolde kullanılan tamponların Tablo 2. Listesi. Ikinci tamponlar, bileşimlerine ve bu protokol kullanılmıştır girdiği ilk adım listelenmiştir.