Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Granülosit-bağımlı otoantikor indüklenen Cilt Kabarcıklanma

10.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/4250

⸱

12 Ekim 2012

 ,  , 
1Department of Dermatology, University of Freiburg , 2Kepler High School Freiburg, 3Centre for Biological Signalling Studies (BIOSS), University of Freiburg

Bu makalede

Özet

Kolajen VII 200 amino asit (aa 757-967) bir streç karşı IgG antikorları saflaştırılmış, bugünkü iş tarif hayvan modelinde kabarma fenotipi yanı sıra insan için karakteristik histolojik ve immunopatolojik özellikleri üreten farelere sürekli enjekte edilir epidermolizis bülloza (EBA) 1.

Özet

Otoimmün fenomenler sağlıklı bireylerde ortaya, ama öz-hoşgörü başarısız olduğunda, otoimmün yanıtı spesifik bir patoloji neden olabilir. Göre Witebsky sitesi, otoimmün bir hastalık tanısında kullanılan kriterlerden biri önermeleri otoantikorların pasif transferi ile deney hayvanlarında hastalık üreme olduğunu. Epidermolizis için bülloza (EBA), deri ve mukoza bir prototipi organ-spesifik otoimmün hastalık, çeşitli deneysel modeller yakın zamanda kuruldu. Kolajen VII 200 amino asit (aa 757-967) bir streç karşı IgG antikorları saflaştırılmış, bugünkü iş tarif hayvan modelinde kabarma fenotipi yanı sıra insan için karakteristik histolojik ve immunopatolojik özellikleri üreten farelere sürekli enjekte edilir İTÇ 1. Tam teşekküllü bir yaygın hastalık genellikle ilk enjeksiyondan sonra 5-6 gün görülen ve hastalığın yaygınlığını yönetilen c dozu ile ilişkilidir edilirollagen VII-spesifik IgG. Deneysel EBA doku hasarı (kabarcık oluşumu) -4 doku bağlı otoantikorlar 2 ile granülosit alımı ve aktivasyon bağlıdır. Örnek efferent otoimmün tepki sadece T hücre-bağımsız bir faz üretir Bu nedenle, bu model, otoimmün doku hasarına neden granülosit-bağımlı enflamatuvar yolunun diseksiyon sağlar. Ayrıca, değeri in vivo otoantikorların blister uyaran potansiyelini gösteren ve İTÇ 1,3, -6 yılında blister oluşumu mekanizması araştıran çok sayıda çalışma tarafından belirlenmektedir. Son olarak, bu model oldukça otoantikor kaynaklı hastalıklarda yeni bir anti-inflamatuar tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır. Genel olarak, İTÇ pasif transfer hayvan modeli, erişilebilir ve öğretici hastalık modeli ve araştırmacılar İTÇ patogenezi sadece analiz etmek değil, temel biyolojik ve klinik cevap yardımcı olacakesansiyel otoimmünite sorular.

Protokol

1. Patojenik antikorun hazırlanması

Not: antikorlar gece boyunca 0.1 M glisin pH 2.5-3 (elüsyon tampon) (ON) saklanan olmamak gibi Saflaştırılması ve antikor konsantrasyonu, aynı gün yapılmalıdır.

IgG Affinity saflaştırılması: Bağışıklık tavşan serumu 25 ml kullanın:

  1. 4. ON tavşan serumu çözülme ° C, 20 ° C de 1xPBS (tampon çalıştıran) ile 1:1 Karışım, 10 dakika boyunca 1260 x g de santrifüjlenir İsteğe bağlı olarak, filtre kağıdı ile filtre adım serum yağ olması durumunda santrifüj sonrası dahil olabilir.
  2. Bu arada, G matrisi 1XPBS (tampon) çalışan 10 yatak hacmi (yatak hacmi = matriks hacmi) ile sütun doldurulur proteini yıkayın.
  3. Seyreltildi ve sütuna uygulanır serum filtre edilmiş ve oda sıcaklığında (RT) de sallanan platform üzerinde 1 saat inkübe edilir.
  4. Collect akan (FT) 50 ml Flakon tüp. Bunu atmayın konsantrasyona kadarve saflaştırılmış IgG titreleri bilinmektedir.
  5. 1XPBS 5 yatak hacmi ile matris yıkayın ve arada Elüsyonlanan IgG fraksiyonu toplamak için 50 ml Falcon tüpleri hazırlayın. Pipet 1 ml pH nötralize edici tamponu: her bir tüp içinde 1 M Tris pH 10 (aksi takdirde elde edilecek arındırıldı ve miktarına bağlı olarak 1:20 TRIS tampon oranı).
  6. Sütun 0.1 M glisin pH 2.5-3 ve 50 ml fraksiyon (ler) toplamak: 100-150 ml elüsyon tamponu uygulanır. , Tüp 2-3x çevirin pH ölçümü ve pH 7.2-7.4 ulaşana kadar nötralize tampon eklemek.
  7. IgG ile arındırıldı ve birkaç damla toplayın ve etalon 280 nm'de OD ölçmek olarak elüsyon tamponu kullanılarak. OD <0.1 durağı koleksiyonculuğu ise.
  8. Protein G matrisi Regenerate ve üreticinin yönergelerini izleyerek saklayın.

Amicon tüpleri ile ultrafiltrasyon ile Konsantrasyon:

  1. 15-20 dakika santrifüj edilerek 1XPBS ile Amicon Ultra (15 ml / 30KDa) ultrafiltrasyon tüpler Yıkama4 ° C'de 3.220 x g'da Amicon gelen FT atın.
  2. 25-30 3.220 xg'de dk ve 4 için yıkandı, IgG fraksiyonu ve santrifüj 15 ml Amicons doldurun ° C; santrifüjleme zamanı hep eluat protein içeriğine bağlıdır.
  3. FT atın ve sol hiçbir Elüsyonlanan Kesir kadar ultrafiltrasyon tekrarlayın.
  4. Santrifüjle 1XPBS 25-30 dk, yoğun, iki kez konsantre IgG yıkayın.
  5. 1XPBS 1,500-2,000 arasında ul nihai hacim içinde Amicon filtreden "yapışkan", sarımsı bir çözelti antikor toplayın.
  6. Bir spektrofotometre Nanodrop kullanılarak IgG hazırlık Tedbir konsantrasyonu:
    Kons. (Mg / ml) = A (280 nm) x seyreltme faktörü / 1,4
  7. Üreticinin yönergelerini takip Amicons yıkayın ve saklayın.

2. Fareler içine Kollajen VII-spesifik IgG Enjeksiyon

Gerçek deneysel prosedür başlamadan önce, emin olun deneysel proprotokolünü yazılır ve tüm malzemeler deney için hazır edilir.

  1. Hastalığın puanlama, ELISA'lar, immünofloresan (IF) analizi ve miyeloperoksidaz (MPO) testi 4 veri sayfalarına hazırlayın.
  2. Kan ve organlar, cryomolds yanı sıra histolojik işleme ve kasetler gömmek için tüpler etiketleyin.
  3. Antikor çözeltileri taze hazırlanmış ya da stoklarından çözülmüş ve (IF mikroskopi ve / veya ELISA ile titre) kendi reaktivite bakımından karakterize edilmelidir. Steril filtre edilmiş antikor solüsyon enjeksiyon için gerekli doz ul 250-1000 arasında değişen bir şekilde PBS ile seyreltilmelidir. Eğer tüm deneme gerçekleştirmek için yeterli IgG sahip olduğunuzdan emin olun.
  4. Hazırlayın taze antikoagülan: Heparin 20 U / ml ve 8.7 mg / ml ketamin / anestezi için 1.3 mg / ml xylazine karışımı. Farelerde hazırlanan% 3.7 formaldehit ile tüpler etiketli ödün zaman.
  5. (Neşter, makas, ince noktası ve curv cerrahi aletler sterilizeed forcipes) ve şırıngalar (insülin şırıngaları, 1 ve 2 ml şırınga), iğneler, dijital kamera ve ekstra hafıza kartı hazırlayın.

Not: ketamin / xylazine veya izofluran uyuşturulur fareler üzerindeki tüm prosedürleri gerçekleştirin fareler hızlı bir şekilde kurtarmak gibi İzofluran, günlük cilt kontrolleri için tercih edilen anestezi seçenektir.. Ancak, resim, 87 mg / kg ketamin ve 13 mg / kg xylazine çekerken genellikle cilt altına enjekte edilir. Ötenazi için ketamin / xylazine doz 130 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg xylazine yükselmiştir.

  1. Genel sağlık durumu, deri ve kürk görünümü için zaten işaretlenmiş hayvanlar kontrol, onları tartmak ve (her zaman aynı kulak sopa) onların kulak kalınlığını ölçmek.
  2. Gözlenen değerler ve klinik değerlendirme levha değişiklikleri kaydedin.
  3. Antikoagülan aynı hacimde içeren bir şırınga içinde, kuyruk veni 20-30 ul (2-3 damla), kan toplamak.
  4. Kürk Dezenfekte ve% 80 etanol kullanılarak cilt.
  5. . Subkutan insülin şırınga kullanarak arkasına antikor çözüm enjekte (bazı sitelerde (örneğin, kulaklar) için sadece küçük miktarlarda (10-50 ul) enjekte edilmesi mümkün bulunmaktadır.)

Enjeksiyonlar, ikinci günde 4 kez tekrar edilmelidir. Balb / c ve yaklaşık olarak 20 g vücut ağırlığı C57BL6 fareler 3-4 günde 750 mcg / g vücut ağırlığı / enjeksiyon otoantikor için 400-500 ilk uygulamadan sonra hastalık geliştirme başlar.

Deney çalışması bittikten sonra:

  1. 130 mg / kg ve ketamin / xylazine subkutan 20 mg / kg enjekte ederek derin narkoz altında fareler koyun, posterior vena kava onları exsanguinate ve kalbini sökecek.
  2. Deri gibi organ / doku örnekleri toplayın: kuyruk, kulak, kan ve özofagus ve önceden etiketlenmiş ve PBS veya% 3,7 formaldehit dolu tüplerin koydum.

Dönen zamanlaboratuvar:

  1. 1.200 xg, ayrı plazma RT 10 dak kan santrifüj, düzgün etiketli tüplere plazma aktarmak ve onları uygun şekilde saklayın.
  2. Cilde düzgün cryomolds, etiket kullanarak Optimal Kesme Sıcaklık orta biyopsisi ve -80 saklayın Embed ° C.
  3. Etiketli gömme kalıplara histoloji içindir doku örnekleri yerleştirin ve parafine gömme kadar% 3,7 formaldehit içinde saklayın.

3. Hastalık Şiddeti Klinik Değerlendirme

Fare deri ve mukoza lezyonları için günlük muayene edilmeli ve bulguların uygun formları kullanarak kayıt edilmelidir. Erken ötanazi için kriterler 5 bir hastalık skoru (Tablo 1) sayma, daha o 20 vücut yüzeyinin% ve üç gün üst üste toplam vücut ağırlığının% 5-10 kilo kaybı etkileyen deri lezyonları olduğunu.

  1. Karnı üzerinde fare yerleştirin. Sağ, yani baş bölgesi ile başlayınkulak ve kabarcıklar, erozyonlar, iç kabuk üzerinde hem de dış tarafında kontrol edin. Sol kulak ile aynı şekilde devam edin.
  2. Sağ ve sol gözler alopesi, eritem belirtileri için kontrol, erozyonlar ve / veya kabuk vardır.
  3. Alın ve burun alan burun, dudak ve ağız mukoza ventral kısmı ile devam eden, önümüzdeki aracılığıyla fırçalanır.
  4. Yukarı hareketli, pençe itibaren sağ ön bacak inceleyin; sol ön bacağa geçin. Sağ ve sol arka ayakları ile aynı prosedür.
  5. Kavisli bir ince nokta forseps ile boyun ve sırt alanda kürk ile fırçalayın.
  6. Sırt üstü çevirin ve fare karın bölümü ile birlikte uzuvların ventral tarafı önceden olduğu gibi aynı şekilde kontrol edin.
  7. Kuyruk kontrol edin.
  8. Farelerde hastalığı geliştirmek vücudun ilgili fotoğraflarını çekin. Dikkat resim kalitesi ve miktarına dikkat edilmelidir.
  9. Klinik hastalık puanları hesaplayın.

4. Cilt ve Plazma Örneklerinin Analizi

  1. , Mağaza ve / hazırlayın veya planına göre toplanan tüm dokuları işlemek.
  2. Dondurulmuş doku kesitlerinde Cut IF tavşan antikorları ve fare kompleman sistem bileşenlerinin tespiti.
  3. Dondurulmuş doku ve / veya organ ekstre farklı enzim ve protein içeriği (MPO tahlil) analiz edin.
  4. Bölüm parafine gömülü dokuda ve doku hasarı ölçüde görselleştirmek için H & E ile leke.
  5. ELISA, immunoblotting tarafından plazma analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Klinik, histolojik ve immunopatolojik düzeyde insan İTÇ benzeyen farelerde tam şişmiş bir hastalık spesifik antijen antikor sonuçları, pasif transfer. Kabarcıklar, kabuklar, erozyonlar ve alopesi kulakları, burunları, pençeleri, bacaklar, sırt ve farelerin göz etrafında gelişir. Hastalığın ilk klinik bulguların muhtemelen kulak ve / veya kafa alanı görünecektir. Belirli tavşan IgG ve fare kompleman C3 çökelmesi IF perilezyonel deri cryosections içinde dermal epidermal bileşkede doğrudan tarafından tespit edilir. Lezyond...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Deney hayvanlarının içine otoantikorların pasif transfer onların patojenite 7, -12 göstermek için önemli bir yaklaşımdır. Bu yöntemle elde edilen hayvan modelleri üzerinde, otoimmünite 13 için dolaylı kanıt olmanın yanı sıra, patojenik mekanizmasının efferent faz inceleme sağlar. Epidermolizis bülloza (EBA) ve kabarma antikorun neden granülosit-bağımlı cilt pasif transfer modeli otoimmün dermatozlarda doku hasarının mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Biliyorsunuz kolajen VII karşı otoimmü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Yazarlar Freiburg Üniversitesi (CS) Tıp Fakültesi Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 ve BIOS'lar hibeleri ile destek için minnettarım.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
rekombinant antijen Mürin kolajen VII rekombinant biçimleri için kodlayan plasmidin karşılık gelen yazar temin edilebilir.
immun tavşan serumu www.eurogentec.com Biz antijen 200 mikrogram, 2 haftalık aralıklarla 3 kez ile immünize Beyaz Yeni Zelanda tavşan vardı. Bu amaçla Eurogentec SA, Belçika hizmetleri kullandık.
Protein A agaroz Roche Uygulamalı Bilimler 11243233001
Balb / c fareleri Charles River Laboratories
Ekim bileşik, Tissue-Tek Sakura Finetek 4583 OCT, optimum kesim sıcaklık
Cryomold standart Sakura Finetek 4557 25 mm × 20 mm × 5 mm
Cryomold ara Sakura Finetek 4566 15 mm × 15 mm × 5 mm
Uni-Link-Einbettkassette R. Langenbrinck 09-0503 Histoloji işleme ve gömme kasetleri
Spezial-Tatowierfarbe Schwarz H. Hauptnerund & Richard Herberholz GmbH & Co KG 71492000 yapıştırma dövme
Tatowierzange TZ1 EBECO E. Becker & Co GmbH Cihaz dövme
Heparin Carl Roth GmbH & Co 7692.1
Formaldehit% 37 Carl Roth GmbH & Co 7386
Ketamin hidroklorür Sigma-Aldrich Chemie GmbH K2753-1G
Ksilazin hidroklorür Sigma-Aldrich Chemie GmbH X1251-1G
steril PBS Biochrom L182-50
dijital fotoğraf makinesi Nikon Coolpix 5400
Şırınga filtre ünitesi 0.45 mikron tahrik Millipore
Kaliper Mitutoyo 7309 1667338 Farnell (distribütör)
hastalığı puanlama sac Örneğin enclosed

Kaynaklar

  1. Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen. J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).
  2. Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 225, 401-413 (2011).
  3. Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes. Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).
  4. Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage. J. Pathol. 212, 56-65 (2007).
  5. Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).
  6. Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).
  7. Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis. J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).
  8. Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme. Science. 286, 1732-1735 (1999).
  9. Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice. PLoS One. 7, e31066(2012).
  10. Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180. J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).
  11. Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease. N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).
  12. Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse. Science. 190, 397-399 (1975).
  13. Rose, N. R., Bona, C. Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited. Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).
  14. Sitaru, C. Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita. Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).
  15. Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin. Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).
  16. Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice. Immunol. Lett. , (2012).
  17. Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita. J. Pathol. 224, 234-244 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Edinsel B lloz EpidermolizKolajen VII AntikorlarPasif Transfer ModeliGran losit Ba ml B l olu umumm nofloresan AnalizSubepidermal B l Olu umuFare Modeli nd ksiyonuKlinik Hastal k SkorlamasHistolojik Analiz
Granülosit-bağımlı otoantikor indüklenen Cilt Kabarcıklanma
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.