Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Summary

Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem sunmak In vivo Bir yabani-tip veya T hücre reseptörü transgenik arka plan üzerinde genetik manipüle fare kullanarak.

Abstract

Sağlıklı bir bağışıklık sistemi kendi antijenlerine tolerans kalırken T hücrelerinin yabancı antijenleri yanıt gerektirir. T hücre reseptör (TCR) α ve β lokusların Rastgele düzenlenmesi öz ve yabancı hem antijen özgüllüğü engin çeşitliliği ile T hücre repertuarı oluşturur. Timusta gelişimi sırasında repertuar seçimi güvenli ve kullanışlı T hücreleri üretmek için önemlidir. Timik seçiminde Kusur otoimmün ve immün bozuklukları ^1-4 gelişmesine katkıda bulunur.

T hücre progenitörler CD4 veya CD8 co-reseptörleri ifade etmezler çift negatif (DN) timositleri olarak timus girin. ΑβTCR hem eş-reseptör ekspresyonu çift pozitif (DP) aşamada gerçekleşir. Öz-peptid-MHC (pMHC) timus hücreleri tarafından sunulan ile αβTCR Etkileşimi DP timosit kaderini belirler. Yüksek afinite etkileşimleri olumsuz seçimi ve ortadan kalk yolkendinden reaktif timositlerin tion. CD4 veya kendinden MHC ⁵ tarafından sunulan yabancı antijenleri tanıma yeteneğine CD8 tek pozitif (SP) T hücrelerinin pozitif seçimi ve gelişimi Düşük afinite etkileşimleri sonucu.

Pozitif Seçimi olgun T hücrelerinin üretimi gözlemleyerek bir poliklonal (yabani-tip) TCR repertuarı ile farelerde incelenebilir. Bununla birlikte, küçük antijen-spesifik popülasyonlarının silme içerir negatif seçim çalışma için ideal değildir. Birçok model sistemler negatif seçim çalışma ama fizyolojik olaylar ⁶ özetlemek için yeteneklerini değiştirmek için kullanılan edilmiştir. Eksojen antijen uygulamasından timositlerde ^7-9 non-spesifik silme yol açabilir Örneğin, timositlerde in vitro uyarımı olarak, iç içe işlemine dahil olan timik ortam yoksundur. Şu anda, in vivo negatif seleksiyon eğitim için en iyi araçları bir transgresyon ifade fareler vardırself-antijen endojen için ENIC TCR özgü. Bununla birlikte, birçok klasik TCR transjenik modelleri prematüre negatif seçim ile sonuçlanan, DN aşamada transgenik TCRα zincirinin erken ifade ile karakterize edilir. Bizim laboratuvar olarak ¹⁰ yabani-tip farelerden oluşan negatif seleksiyon SP geçiş DP sırasında meydana sağlayan, transgenik HY TCRα şartlı DP aşamada ifade edildiği HY ^cd4 model geliştirdi.

Burada, HY ^cd4 fare modelinde timik pozitif ve negatif seçim incelemek için bir akış sitometri tabanlı protokol açıklar. HY ^CD4 farelerde, negatif seleksiyon çok fizyolojik olmakla birlikte, bu yöntemlerin diğer TCR transjenik modelleri ile de uygulanabilir. Biz de herhangi bir genetik manipüle fare için geçerli bir poliklonal repertuar olumlu seçimi analiz için genel stratejiler sunacak.

Protocol

Deneysel protokol genel bir şema için Şekil 1 'e bakınız.

1. Teşrih

1. 60 x 15 mm Petri kabı içine yerleştirin steril çelik örgü ekran. Bir birim doku örneği başına gereklidir.
2. Her bir tabak için Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 5 ml ilave edilir. Buz üzerinde yemekleri tutun.
3. CO ₂ ile farelerin Euthanize.
4. Diseksiyon yüzey Güvenli fare yukarı bakacak ventral tarafta. Sterilizasyon için% 70 etanol ve kürk aşağı keçeleşmiş sağlamak için Sprey fare.
5. Cerrahi makas kullanarak, sadece genital Yukarıdaki karın derisinde bir ventral kesi yaparak diseksiyon baş....

Results

Fizyolojik TCR transgenik modeller ve WT farelerde, pozitif seleksiyon antijen karşılaşma sonrasında DP ^donuk aşamaya geçmeden önce DP ^parlak aşamada başlar. DP ^donuk timositleri ardından CD4SP veya CD8SP timositleri (Şekil 2B) olmadan önce bir geçiş CD4 ⁺ CD8 ^lo sahne girin. Olgun SP timositleri yüksek TCR ekspresyonu ve CD24 (Şekil 2C) kaybı ile karakterize edilir. Profil CD69 veya CD5 tarafından TCRβ inceleyerek, pozitif seleksiy.......

Discussion

Burada sunulan protokol olmayan TCR transjenik ve TCR transgenic farelerde pozitif ve negatif seçim incelemek için kullanılabilir. Bu protokol, yüzey antijenlerinin boyama açıklanmaktadır. Moleküler mekanizmalarının daha fazla analiz için, genellikle hücre içi boyama yapmak için gereklidir. Biz transkripsiyon faktörleri için en intraselüler proteinler ve BD Biosciences Foxp3 Boyama Seti BD Biosciences Cytofix / Cytoperm Kiti kullanın. Biz genellikle hemen boyama sonra örnekleri kazanır. Bununla birlikte, örnekler 4 az% .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
HyClone Hank'in dengeli tuz çözeltisi	Thermo Scientific	SH30030.02
Metal örgü ekranlar	Cedarlane	CX-0080-E-01
Petri kapları (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	877221
Enjektörler (3 ml)	BD Biosciences	309657
Konik boru (15 ml)	Sarstedt	62.554.205
Mikroskop	Zeiss - Primo Yıldız	415500-00XX-000
Hemasitometre	HausserBilimsel	3110
96-kuyulu plakalı	Sarstedt	82.1582.001
Kanallı pipet	Fisherbrand	21-377-829
Fetüs buzağı serumu	PAA	A15-701
Fosfat tamponlu salin	Fisher Scientific	SH3025802
Sodyum azid	BT Baker Chemical Co	V015-05
FCR engelleme reaktif			Klon 2.4G2
Anti-fare HY TCR	eBioscience	XX-9930-YY *	Klon T3.70
Anti-fare CD4	eBioscience	XX-0042-YY *	Klon RM4-5
AYüzgeç-fare CD8α	eBioscience	XX-0081-YY *	Klon 53-6,7
Anti-fare CD24	eBioscience	XX-0242-YY *	Klon M1/69
Anti-fare TCRβ	eBioscience	XX-5961-YY *	Klon H57-597
Anti-fare CD69 biotinlenmiş	eBioscience	13-0691-YY *	Klon H1.2F3
Anti-fare CD5 biotinlenmiş	eBioscience	13-0051-YY *	Klon 53-7,3
Streptavidin	eBioscience	XX-4217-YY *
Akış sitometresi	BD Biosciences - FACS Canto	338962
FACS tüpler	BD Biosciences	352052
Flow sitometri analiz yazılımı	TreeStar - Flowjo	FlowJo v7 / 9
HyClone RPMI - 1640 orta	Thermo Scientific	SH30027.01
			Florokrom ve YY Şişe boyutuna göre değişir tarafından * XX değişir.