Bu makalede ve beraberindeki video bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşımı kullanarak, fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bizim protokol sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir fare modelinde Bağırsak Doku Mühendisliği
Bu makalede
Özet
Özet
Doku mühendisliği ince bağırsak (TESI) başarıyla 40 gün içinde ameliyat öncesi ağırlıklarına dönmek sonuçlanan masif ince barsak rezeksiyonu sonrası Lewis fareleri kurtarmak için kullanılır olmuştur. İnsanlarda 1, masif ince barsak rezeksiyonu kısa barsak sendromu, fonksiyonel malabsorbtif neden olabilir önemli morbidite, mortalite ve parenteral beslenme bağımlılığı, karaciğer yetmezliği ve siroz ve multivisceral organ nakli ihtiyacı. 2 Bu yazıda da dahil olmak üzere sağlık giderleri bahşeder devlet, bir fare modelinde doku mühendisliği bağırsak oluşturmak için bizim protokol tanımlamak ve belgelemek çok hücreli organoid üniteleri-on-iskele yaklaşım. Organoid adet mukozal ve mezenkimal hem elementleri içeren bağırsak türetilen çokhücreli agrega, 3 intestinal kök hücre niş korur aralarında ilişki vardır. Süregelen ve gelecekteki araştırmalarda 4, içine bizim tekniği geçişiFare bu türün mevcut transgenik araçları kullanarak TESI oluşumu sırasında söz süreçlerin incelenmesi için izin verecektir. immünkompromize fare suşları 5 durumu da bize insan intestinal doku tekniği uygulamak ve bir insan TESI oluşumunu optimize etmek için izin verir insanlar içine onun geçiş öncesi fare ksenogreft. Bizim metodumuz iyi üretim uygulamaları (GMP) reaktifleri ve zaten insan hastalarda kullanım için onaylanmıştır ve bu nedenle decellularized hayvansal dokular güvenmemeniz yaklaşımlar üzerinde önemli bir avantaj sunuyor oylandı malzemeler kullanmaktadır. Bu yöntemin nihai hedefi kısa barsak sendromu için bir rejeneratif tıp tedavi stratejisi olarak insanlar onun çevirisidir.
Protokol
1. Organoid Üniteleri Hazırlık
- Fare diseksiyon (makas ve forseps) için uygun Araçlar otoklav ile sterilize edilmelidir.
- Insanca yerel IACUC protokollere göre donör fare ötenazi. Hayvan geçmeden önce ölü olduğundan emin olun.
- Periton boşluğuna erişmek için bir orta hat kesi olun. Pozlama geliştirmek için gerektiği gibi cilt flepleri yansıtılabilir.
- Ince bağırsak canı çıksın ve Treitz ligamanı hemen distalinde bölün. Keskin ve yumuşak künt diseksiyon kullanarak mezenterden ince bağırsak ayırın. Ileoçekal bileşke belirlemek ve bu proksimal ince barsak 5 mm bölün.
- Makas kullanılarak, (Invitrogen, anti-anti) 10 ml 4 ° C, steril Hanks 'tamponlu salin (HBSS, Invitrogen, Carlsbad, CA) / 1X-antifungal antibiyotik olan bir Petri tabağına antimezenterik sınır boyunca uzunlamasına çözelti bağırsak açın. Ile açılmış bağırsak dışkı TemizleYumuşak ajitasyon sonra, 10 ml 4 ° C, steril HBSS / 1X anti-anti ile bir 15 ml santrifüj tüpüne açılmış bağırsak aktarın.
- 4 10 ml açılmış bağırsak üç kez yıkayın ° C arasında, bir test tüpü içinde anti-anti steril HBSS / 1X. Her yıkama 30 sn için 15 ml tüp hafif sallama ile gerçekleştirilebilir. Çalkaladıktan sonra, bağırsak doku tüpün altına düşer. Mezenkimal debris yüzen madde, atın. Bir pipet yardımıyla dikkatlice yıkanması çözüm çıkarın.
- 4 10 ml bir Petri kabındaki yıkanmış bağırsak Kıyma ° C, steril HBSS / makas kullanılarak en az 1 mm kare parçalara 1X anti-anti. Otomatik bir pipet yardımıyla kıyma malzeme toplamak ve bir test tüpüne yerleştirin.
- 8 dakika boyunca 500 rpm'de tüp santrifüjleyin. Yağ ve mezenşimi içeren süpernatant, atın.
- Steril HBSS / 1X anti-anti artı 0.125 mg / ml dispase (Invitrogen) ve 800 birim / m ile 10 ml kıyılmış ve yıkanmış malzeme, Digestl kollajenaz tip 1 (Worthington, Lakewood NJ). Sindirim çözelti, 40 ml hazırlamak için, dispase, kollajenaz 142 mg 5 mg tartmak, ve 40 ml bir hacme kadar steril HBSS kadar ekleyin. Her defasında taze organoid birimleri hazırlanan bu çözüm hazırlayın ve kullanmak için 4 ° C kadar hazır tutun. Adım 1.8 'den direkt olarak pelet sindirim solüsyonu eklenir.
- 20 dk için 37 ° C 'de sindirim çözelti ile kıyılmış ve yıkanmış malzeme içeren test tüpü inkübe edin.
- Test tüpü ayrıca alma ve 10 ml lik bir pipet ile tritürasyon ile sindirilmiş doku bozar. Düzgün bir görüntü elde edilinceye kadar 20 ila 50 kez arasında tekrarlayın.
- 800 rpm'de 5 dakika süreyle test tüpü santrifüjleyin. Tek hücre içeren süpernatant, atın.
- 4 ° C, steril Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM, Invitrogen) artı% 10 v / v ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu (HI-FBS, Invitrogen) 10 ml sindirim reaksiyonu durdurun. Pelle süspanset ve tüp sallayın.
- 800 rpm'de 5 dakika süreyle test tüpü santrifüjleyin. Son birkaç damla kadar otomatik bir pipet yardımıyla dikkatlice Süpernatantı. Pelet resuspending önlemek için son birkaç damla için tek kullanımlık plastik pipet kullanın.
2. Poliglikolik Asit İskele yüklenmesi
- Gibi Ref tarif; nonwoven poliglikolik asit (porozite>% 95, Concordia Elyaf, Coventry RI 2 mm sac kalınlığı, 60 mg cm-3 yığın yoğunluğu) gelen Form 2-mm uzunluğunda, 5 mm dış çaplı silindirik iskelelerinin. 4.
- Distile su içinde% 70 etanol ile hazırlanmış makasla Öneri atılabilir 1.000 mikrolitre pipeti distal 2 mm kesin.
- 4 kuyu kültür plaka içine iskele yerleştirin. Birinci lümen içine ve daha sonra dış yüzey üzerine, 1.000 mikrolitre pipeti ile iskele üzerine organoid birimleri yerleştirin. Lümeninin kaplama sağlamak için bir forseps kullanın. Bozabilir veya polimer silindir şeklinde açık bozmayın.
3. Makine Fare içine İmplantasyonu
- Donör varsa aynı arka plan üzerine bir singenik ana farenizi kullanın. Aksi takdirde, bir immün obez olmayan diyabetik (Jackson Laboratuvarları, Sacramento CA) hayvan / ağır kombine immün yetmezliği veya NOD / SCID kullanır.
- Izofluran ile genel anestezi øndükle. , Hazırlık Tıraş ve fare karın asmak.
- Periton boşluğuna giriş kazanmak için 5 mm'lik bir orta hat kesi olun. Belirleyin ve dikkatlice omentum bağırsaklarını. Omentum üzerine yüklenen polimer yerleştirin ve doku ile sarın. Omentum yırtmayın.
- 5-0 monocryl sütür ile omentuma polimer sabitleyin. Yavaşça kendi anatomik pozisyonuna sarılmış polimer ile omentum değiştirin.
- 4-0 vikril sütür kullanarak kat insizyon kapatın. Kas kapatma çalıştırın ve kesi altında abdominal organları kesmemeye dikkat edin. Cilt için suturlarla kullanın.
- Kesi bitişik bir subkutan kabarıklık olarak steril su içinde 2 mg / kg ketoprofen (Ketofen, Fort Dodge Hayvan Sağlığı) ile postoperatif analjezi Yönet. Hayvanlar günlük olarak değerlendirilmelidir ve hayvan ağrı veya acı belirtileri gösteren ise, ketoprofen, ek bir doz ameliyat sonrası 2. günde tatbik edilebilir. Ameliyat sonrası üçüncü gününde, hayvan tam ağrı veya sıkıntı olmaksızın iyileşti edilmelidir. Ağrı veya sıkıntı post operatif 3. gün devam ederse, bu anormal kabul edilir ve IACUC ve hayvan bakım tesisi protokoller çerçevesinde ele alınmalıdır.
- Iyileşmek için fare ve doku mühendisliği bağırsak dört hafta boyunca büyümeye izin verin. Kemirgen chow (Lab Diyet 5001, PMI Beslenme, St Louis MO) ve 5 ml (Hi-Tech Pharmacol, Amityville NY) 1:100 dilüsyon başına Septra 200 mg / 40 mg ile su hayvan ad libitum erişimi verin.
4. Hasat
- Humanely dört hafta implantasyonu sonrası ana hayvan ötenazi.
- Orijinal kesi yeniden açın ve cilt yansıtan periton boşluğuna ulaşımı kolaylaştırmak için sefalad.
- Kas tabakası açın ve doku bir küre olarak doku mühendisliği yapı tanımlar.
- Keskin diseksiyon kullanarak intraabdominal organlar gelen yapı yapıştıkları aşağı atın.
- Montaj sonra parafin için formalin yapı Fix, ya da real-time PCR veya protein izolasyonu gibi biyokimyasal testler için taze doku kullanın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 burada belgelenen protokolü için genel bir şema göstermektedir. Bu protokolün sonuç aynı yapı görüntüleyen bir lümen, mukoza, submukoza ve muskularis. Şekil 2A çevreleyen bir başlangıç polimer iskele. Şekil 2B karşılaştırıldığında tipik bir dünya gösterir ile doku mühendisliği murin bağırsağın bir dünya veya küresel bir yapıdır keskin onun lümen ortaya bivalved. Şekil 3 inkübasyondan 4 hafta sonra tipik başarılı yapı bir Hematoksilen / eozin b...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz bir organoid üniteleri-on-iskele yaklaşım kullanarak fare doku mühendisliği bağırsak üretmek için bir protokol mevcut. En kritik adımlar organoid birimlerin hazırlanması olanlardır. Bakım yeterince temiz ve mekanik doku işleme alınmalıdır, ancak sindirim gerçekleştirildikten sonra eşit bakım (adım 1.11) organoid birimleri overdigest ya overtriturate için değil alınmalıdır. Eğer bu yapılırsa, organoid birimleri adım 1.12 süpernatant içinde kaybolmuş olabilir tek hücreler, azaltılmış, ve doku mühendisliği bağırsak üre...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Tracy C. Grikscheit, Erik R. Barthel ve Frédéric G. Sala California Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM), hibe numaraları RN2-00946-1 (TCG) ve TG2-01168 (ERB, FSG) tarafından desteklenmektedir. Allison L. Speer Üniversitesi Cerrahlar Ethicon bilgin bir Derneği'dir. Yashuhiro Torashima Bir Çocuk Hastanesi Los Angeles Saban Enstitüsü Araştırma Kariyer Geliştirme Bursu tarafından finanse edilmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| HBSS | Gibco | 114170-112 | |
| Antibiyotik-Antimikotik 100X | Invitrogen | 15240-062 | |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | |
| Kollajenaz Tip 1 | Worthington | LS004194 | |
| DMEM Yüksek Glikoz 1X | Gibco | 11995-065 | |
| Isı inaktif FBS | Invitrogen | 16140-071 | |
| Biofelt 100% PGA | Concordia Tıp | FELT01-1005 | Referans olarak polimer hazırlanması için.4 |
| Poli-L-laktik asit | Durect | B6002-1 | Referans olarak polimer hazırlanması için. 4 |
| I Kollajen, sıçan kuyruğu yazın | Sigma-Aldrich | C3867-1VL | Referans olarak polimer hazırlanması için. 4 |
| Ketoprofen 100 mg / ml | Fort Dodge Hayvan Sağlığı | 71-KETOI-100-50 | |
| LabDiet 5001 kemirgen chow | LabDiet | 5001 | |
| 5 ml, USP Septra başına 200 mg / 40 mg | Hi-Tech Pharmacol | 50383-824-16 | |
| İzofluran, USP | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-507-06 |
Kaynaklar
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., Ochoa, E. R., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240, 748-754 (2004).
- Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Sem. Ped. Surg. 19, 3-9 (2010).
- Evans, G. S., Flint, N., Somers, A. S., et al. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures. J. Cell Sci. 101, 219-231 (1992).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., et al. A multicellular approach forms a significant amount of tissue-engineered small intestine in the mouse. Tiss. Eng. Part A. 17, 1841-1850 (2011).
- Speer, A. L., Sala, F. G., Matthews, J. A., Grikscheit, T. C. Murine tissue-engineered stomach demonstrates epithelial differentiation. J. Surg. Res. 171, 6-14 (2011).
- Haxhija, E. Q., Yang, H., Spencer, A. U., et al. Intestinal epithelial cell proliferation is dependent on the site of massive small bowel resection. Pediatr. Surg. Int. 23, 379-390 (2007).
- Zhao, L., Cheng, Z., Dhall, D., et al. A novel corrective pullthrough surgery in a mouse model of Hirschsprung's disease. J. Pediatr. Surg. 44, 759-766 (2009).
- Petrosyan, M., Guner, Y. S., Williams, M., et al. Current concepts regarding the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Ped. Surg. Int. 25, 309-318 (2009).
- Shew, S. B. Surgical concerns in malrotation and midgut volvulus. Ped. Radiol. 39, S167-S171 (2009).
- Sampietro, G. M., Corsi, F., Maconi, G., et al. Prospective study of long-term results and prognostic factors after conservative surgery for small bowel Crohn's disease. Clin. Gastroenterol. Hepatol. 7, 183-191 (2009).
- Klempnauer, J., Grothues, F., Bektas, H., Pichlmayr, R. Long-term results after surgery for acute mesenteric ischemia. Surgery. , 121-239 (1997).
- Fitzgibbons, S. C., Jones, B. A., Hull, M. A., et al. Relationship between biopsy-proven parenteral nutrition-associated liver fibrosis and biochemical cholestasis in children with short bowel syndrome. J. Ped. Surg. 45, 95-99 (2010).
- Spencer, A. U., Kovacevich, D., McKinney-Barnett, M., et al. Pediatric short bowel syndrome: the cost of comprehensive care. Am. J. Clin. Nutr. 88, 1552-1559 (2008).
- Kato, T., Tzakis, A. G., Selvaggi, G., et al. Intestinal and multivisceral transplantation in children. Ann. Surg. 243, 756-766 (2006).
- Reyes, J., Bueno, J., Kocoshis, S., et al. Current status of intestinal transplantation in children. J. Ped. Surg. 33, 243-254 (1998).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
