Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

Emma Monte; Haodong Chen; Maria Kolmakova; Michelle Parvatiyar; Thomas M. Vondriska; Sarah Franklin

doi:10.3791/4294

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hastalığında Kromatin Proteomlar Kantitatif Analiz

12.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4294

⸱

28 Aralık 2012

Emma Monte¹ , Haodong Chen¹ , Maria Kolmakova¹ , Michelle Parvatiyar¹ , Thomas M. Vondriska¹^,²^,³ , Sarah Franklin¹^,⁴

¹Department of Anesthesiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ²Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at UCLA, ³Department of Physiology, David Geffen School of Medicine at UCLA, ⁴Department of Internal Medicine, Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah

Bu makalede

Özet

Kütle spektrometresi gelişmeler dokuların bir dizi protein ifade ve modifikasyon yüksek verimlilik analizi sağladı. Subselüler fraksiyonasyon ve hastalık modelleri, spektrometresi ve biyoinformatik biyolojik sistemlerde yeni özellikleri ortaya çıkarabilir nicel kitle ile birlikte. Burada açıklanan yöntem, kalp hastalığı arasında bir ortamda kromatin ilişkili proteinlerin analiz eder ve diğer kolayca uygulanabilir In vivo Insan hastalık modelleri.

Özet

Çekirdeğin içinde olan fonksiyonlar en yakından gen regülasyonu ile bağlantılı proteomlarda bulunur. Erişkin memeli kardiyomiyosit çekirdeklerinin nükleuslu hücrelerin oranı yüksek, ¹ DNA ağırlıklı heterokromatik durumu nedeniyle benzersizdir ve geliştirme sırasında interfaz kalıcı bir devlet yetişkin çekirdekleri işler kardiyomiyosit-olmayan bölünmesi doğası. ² Transkripsiyonal düzenleme ve Hastalığın sıra bu proteinlerin hastalığı sırasında meydana transkripsiyonel programları değişiklikleri kontrol nasıl bu organ, ^3-5 okudu ama ne nispeten keşfedilmemiş kalır DNA paketlenmesi ve ifade sorumlu nükleer proteinler oynadığı rol ve oylandı. ⁶ geliştirilen yılında dünya, kalp hastalığı erkekler hem de kadınlar için ölüm bir numaralı nedenidir. nükleer proteinleri bu hastalığın ilerlemesini düzenleyen işbirliği nasıl ⁷ Insight güncel tedavi o ilerleyen için kritikeçenekler.

Kütle spektrometresi bu hastalıkla nasıl bu proteinlerin bolluğu değişiklikler için nükleer proteom ve göreli kantifikasyon tarafsız bir açıklama sağlayan bu soruların iletilebileceği ideal bir araçtır. Son zamanlara kadar memeli nükleer protein kompleksleri, ^8-13 için çeşitli proteomik çalışmalar varken ¹⁴ kardiyak nükleer proteom inceleyen sadece bir çalışma olmuştur ve oldukça nükleer alt bölmeleri düzeyinde proteom keşfetmek yerine, tüm çekirdek olarak kabul . Büyük bir kısmı ^15, bu iş sıkıntısı kardiyak çekirdeklerin tecrit zorluk kaynaklanmaktadır. Kardiyak çekirdekler miyosit daralma değiştiren kendi genel şekli. ¹⁶ Ayrıca, kardiyomiyositlerde hacmi ¹⁷ ile% 40 mitokondri olduğu ölçüde, onlar endoplazmik retikulum birden uzantıları aracılığıyla bağlı bir katı ve yoğun aktin-miyozin aygıtı içinde ortaya çıktığı Necessitadiğer organeller dışında çekirdeğin zenginleştirme tes. Burada biyolojik ilgili bölmeye kardiyak nükleer zenginleştirme ve daha fazla fraksiyonasyon için bir protokol açıklar. Ayrıca, metabolik etiketleme mümkün değildir çeşitli hayvan modelleri ve organ sistemleri in vivo deneyler için mükellef bu fraksiyonların-teknikleri etiketi ücretsiz kantitatif kütle spektroskopisi diseksiyon için detaylı yöntemleri.

Protokol

Deneysel akışı yedi önemli adımlar (Şekil 1). Kütle spektrometresi üzerinde çalıştırmak olacaktır örnekler içeren herhangi bir iş için, deneyci bir laboratuvar önlüğü, eldiven ve saç filesi giymek ve toz ve keratin kişisel dökülme kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için özen göstermelisiniz.

1. Kalp Homojenizasyon ve Nükleer İzolasyon

Fare kalpleri homojenize edilir ve bir bozulmamış çekirdekler pelet (Şekil 2) izole edilir.

, Yetişkin fare Kurban tüketim kalp, buz gibi soğuk PBS içinde yıkayın ve 2 ml içeren (biz Fisher Wheaton Doku Öğütücü, # 08-414-13A tercih, ancak diğer yöntemler eşit derecede iyi çalışır olabilir) cam Dounce buz üzerinde homojenize lizis tamponu (10 mM Tris, pH 7.5, 15 mM NaCI ve% 0.15 v / v Nonidet P-40 [NP-40], deiyonize su içinde artı (diferansiyel olarak çekirdek içeren organel üzerinde hücre zarı lysis oluşumunu hipotonik bir çözeltisi) proteaz ve fosfataz inhibitor karışım: 10 mM sodyum butirat, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl fluorür [PMSF], 0.2 mM ₃ VO _4, 0.1 mM NaF, 1 Roche proteaz pellet/10 ml, Na - lizis tamponu -20 ° C'de bir hafta kadar saklanabilir ). (Not: Biz kütle spektrometresi veri olarak, PBS ile kalpleri serpmek için gerekli bulmak ve analiz ağırlıklı kardiyomiyosit kan kontaminasyonu aksine kökenli [p-değeri 3.8E-22] [p değeri 5.0 olarak proteinleri tespit GO yok E-2].)
100 mikron süzgecinden lizat dökün ve 1.5 ml santrifüj tüp yoluyla akışını toplamak. Belirtilmediği sürece, bu noktada, örnek buz üzerinde tutulmalıdır.
4 ° C'de 5 dakika boyunca 4000 rpm'de santrifüje
Süpernatantı. (Bu sitozolüne ve -80 saklanmalıdır ° C. parçalanan mitokondri içerir.) Yeniden süspanse pelet triturating tarafından 200 ul lizis tamponu. (Bu ham Nükleer pellet olduğunu.)
Sakaroz buff 1 ml 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpüne DolguER (% 24 sakaroz ağırlık / hacim, 10 mM Tris, pH 7.5, proteaz ve / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde 15 mM NaCl - sakaroz tampon kullanımının gününde taze yapılmış olmalıdır). 4 ° C'de 10 dakika süreyle 5000 rpm'de santrifüj ve sakaroz ped üzerine yavaşça tabaka yeniden süspanse topak
Üstüne ince bir film olarak sakaroz tampon (membran içeren) çıkarın. 200 ul buz gibi soğuk PBS / EDTA (1 mM EDTA ile 1 x PBS) ile geriye kalan topak durulayın. (Bu çekirdekler pelet ve blot batı veya elektron mikroskobu kullanımı için çözündüğünü veya sabit olabilir [adımları 4.1 ve 4.2 'ye bakınız] zenginleştirme ölçmek için.)

2. Çekirdek plazması ve Deterjan-ekstrakte kromatin Fraksiyonasyon

Ham topak gevşek çekirdekleri DNA ile ilişkili proteinler ihtiva eden bir çekirdek plazması ve deterjan ile ekstre kromatin fraksiyon ayrılır.

200 ul deterjan ekstraksiyon tamponu (2 adım 1.6 pelet Karışım0 mM HEPES pH 7.6, 7.5 _mM MgCI2. 0.2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M üre,% 1 proteaz / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde NP-40 - deterjan ekstraksiyon tampon çözeltisi) -20 ° C'de bir hafta için saklanır.
Vortex örnek 2 kez, 10 sn her. Buz 10 dakika yerleştirin.
4 ° C'de 5 dakika boyunca 13,000 rpm'de santrifüje
Süpernatantı. (Bu çekirdek plazması ve -80 ° C'de muhafaza edilmelidir). Buz gibi soğuk PBS / EDTA ile pelet durulayın. (Bu kromatin pelet olduğunu.)
Tris, SDS, EDTA tampon azından bir hafta için hafızada saklanması - 300 ul Tris, SDS, EDTA tampon maddesi (50 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, proteaz / fosfataz inhibitörü ile karışım deiyonize su içinde% 1 SDS içinde pelet Karışım -20 ° C).
10 sn her DNA kırmak için 3-6 kez sonikasyon. Sonications arasındaki buz üzerinde örnek tutun.
4 ° C'de 5 dakika boyunca 13,000 rpm'de santrifüje Süpernatant tutun. (Süpernatant deterjan-Ayıklanan kromatin protein fractio olduğunun ve -80 ° C) sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Geri kalan topak az olmalıdır, ve atılabilir.
% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM),% 1 insülin kültür ardından enzimatik sindirimi ile doğumdan hemen sonra yavruların sıçan bir gün neonatal fare ventriküler miyositlerde izolat yerine bütün izole edilmiş kalp miyositleri kullanılıyorsa transferrine sodyum selenit (ITS), ve% 1 penisilin. 24 saat sonra, serum serbest medya (yukarıdaki gibi aynı, ama FBS eksik) transfer. Hasat lizis tamponu hücreleri (1.1 listelenen), ve adım 1.3 nükleer fraksiyon başlar.

3. Asit-ekstraksiyon Fraksiyonu - DNA-bağlı protein Zenginleştirme

Histon gibi sıkıca DNA'ya bağlı proteinler için ayrı bir fraksiyon zenginleştirir.

Adımları 1,1-2,4 tekrarlayın.
0,4 N sülfürik asit 400 ul kromatin pelet Karışım. Kümeleri kaldırmak için Vortex.
30 dk ya da overn için 4 ° C sıcaklıkta inkübeight dönerken.
4, 10 dakika için 16,000 x g'de santrifüjleyin ° C Nükleer tortularını çıkarmak üzere.
Taze bir tüp supernatant aktarın.
Trikloroasetik asit 132 ul süpernatanına açılan akıllıca ekleyin. Birkaç kez Invert. 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
4 ° C'de 10 dakika süreyle 16,000 x g'de santrifüjleyin
Süpernatantı atın. Yavaşça buz aseton ile pelet durulayın. (Bu histon pelet olduğunu.)
4 ° C'de 10 dakika süreyle 16,000 x g'de santrifüjleyin
Yıkama tekrarlayın, 3,8-3,9 adımları.
Hava kuru pelet.
Tris, SDS, EDTA tamponu ve 100 ul içinde pellet yeniden süspanse edin. 1 M Tris ilave edilerek pH 8 ayarlayın. (PH ayarlı olmayan bir 1 M Tris stoğu kullanın.)
15 dakika süreyle su banyosunda sonikasyon. Su banyosu, buz ekleyerek aşırı ısınmayı önleyin. (Bu asit-Ayıklanan fraksiyonu ve -80 ° C'de muhafaza edilmelidir)

4. Saflık Fiyatları

Western blot ve elektron mikroskobuçekirdekleri ve diğer organellerin tükenmesi başarılı zenginleştirme onaylayın. Aşağıdaki kalite kontrol testleri için tüm tipik sonuçlarını görmek için, bizim önceki yayın bakın. ¹⁸

Western blot analizi gerçekleştirin. Histon H2A veya nucleoporin P62 (zenginleştirme doğrulamak için nükleer işaretleri gibi) ve adenin nükleotid taşıyıcı, bip ve tubulin (mitokondriyal bir işaretleyici, endoplazmik retikulum işaretleyici ve sırasıyla saflığını doğrulamak için sitoskeletal belirteç olarak) her fraksiyonu içeren Prob membran. Histon H3 veya fibrillarin (deterjan ve asit-Ayıklanan kromatin ve bozulmamış çekirdeği) ve SNRP70 veya E2F (çekirdek plazması) için çekirdekler, prob başarılı subfractionation doğrulamak için. Retinoblastom veya hipoksi indüklenebilir faktör-1 (asit-Ayıklanan fraksiyonu üzerinde deterjan-ekstre kromatin zenginleştirilmiş) için prob. HeLa hücre lizat ve bütün kalbi lizat Ek kontrol örnekleri de aynı jel çalıştırmak olabilir: Tris, SDS, ED ekleyerek HeLa hücre lizat kumandayı hazırlayınKültür çanak ve örnek toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanarak TA tamponu. Sonikasyon ve adımları 2,6-2,7 olarak örnek santrifüj. 2 ml tampon (20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA,% 1 Triton X-100, 2.5 mM sodyum pirofosfat, deiyonize su içinde 1 mM gliserofosfat olarak kalp homojenleştirici tarafından bütün kalp lisatı kontrol hazırlanması Proteaz ve fosfataz inhibitörü karışımı ile). Sonikasyon ve adımları 2,6-2,7 olarak santrifüj. SDS-PAGE protein örneklerinin hazırlanması için adım 5'e bakınız.
Elektron Mikroskopi:% 2 gluteraldehit içeren lizis tamponu adım 1.6 çekirdekler pelletini tekrar ve 4 örnek düzeltmek ° C Osmik asit örnekleri durulayın, kurutmak ve epoksi reçine gömün. Bir Reichert ULTRACUT ultramicrotome kullanılarak 70 nm dilimleri kesin. JEOL 100CX Transmisyon Elektron Mikroskobu kullanılarak uranil asetat ve kurşun ve görüntü örnekleri Leke. Görüntülü malzemenin toplam alana karşı sağlam çekirdeklerin alanı ölçerek zenginleştirme ölçmek. Biz çekirdeklerin% 60-80 bulabilirsinizsağlam olması. ^14.

Çekirdekler zenginleştirici karşı arındırıcı için önemli hususlar. Bu protokol hastalık sırasında genel gen düzenleme süreçlerine eğitim amacıyla kardiyak kromatin proteomik analizler için geliştirilmiştir. Bütün-proteom kütle spektrometresi deneyler tasarlama önemli bir bileşeni dinamik aralık ve düşük bolluk proteinleri tanımlamak ve karakterize etmek edememek konudur. Çekirdeklerin daha subfractionation yaptığı gibi nükleer proteom için zenginleştiren, nükleer ve kromatin özgü biyolojisi hakkında bilgi sağlama temel amacı ek olarak, bu düşük bolluk proteinleri tespit ihtimali artar. Tartışıldığı gibi Bununla birlikte, yetişkin kardiyomiyosit nükleer membran bağlanmış bir yoğun sitoskeletal bileşeni vardır. Biz tamamen bu diğer hücresel bileşenler çekirdekler saflaştırılmış olduğunu inanmıyorum. Ancak, çekirdeklerin sadece zenginleştirerek, biz elde vared analiz türlerini etkinleştirmek için kabul edilebilir eşik nitelendirdi.

Özellikle, bizim ham çekirdekler pelet saflığını değerlendirmek için EM kullanılmaktadır ve bozulmamış kabaca% 10 mitokondri çekirdeklerinin ve dinlenme enkaz olmak fraksiyonu% 60-80 bulduk. Ayrıca, sağlam çekirdeklerin nüfus önceki çalışmamızda, tanıdığımız birçok kas lifçikleriyle bu protokolün bazı proteinler (calsarcin-1) zenginleştirilmiş (Batı ile ölçülen tübülin ve aktin dahil), gerçek bir biyolojik nüfus önererek zenginleştirilmiş değil ise kardiyak çekirdeklerin bu proteinler. ^19.

Buna ek olarak, bu gen ontoloji göre, bu proteinlerin tahmin rolleri, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonunda mevcut olduğu bulunmuştur proteinleri karşılaştırılmaktadır. Önemlisi, bu gen ontoloji analiz hesabı farklı proteinlerin göreceli bolluk (bizim Western blot verileri gibi) dikkate almaz değil, tespit edilen tüm proteinleri (zenginleştirmek sayareşit olarak ed veya değil) ortak yollar ve hücresel bölümlerin belirlenmesi. Bu yolların ve hücresel bölümlerin analizi bizim daha önceki yayınlarda bulunabilir. ^18,20 En önemlisi, asit-Çıkartılan kromatin fraksiyonu içinde zenginleştirme başarısı bize erişkin fare histon miyosit 54 varyantlarının varlığı, ¹⁸ tespit izin birçoğu belirlenmesi için bir benzersiz peptid dayanıyordu ve bu zenginleştirme protokol toplam kardiyomiyosit proteom muazzam karmaşıklığı verilen olmadan böylece olasılıkla saptanabilir olmazdı. Bu, kardiyak atom çekirdeklerinden gelen tespit 1.048 proteinleri, n = 56 (% 5.3) nükleozom parçası (ilgi çekirdek bir bileşeni) olarak analiz GO açıklamalı edildi. Bütün kalp bakarak başka bir çalışmada, sadece 11 proteinler (% 0.18) nükleozom ²¹ parçası olmak için açıklamalı almış olup, 6.180 proteinler tanımlanmıştır. Bu, daha ileri meaningfu için protokol gücünü tariflly nükleer proteinler için zenginleştirmektedir.

5. Protein Jel ve Enzimatik Protein Digest

Proteinler kütle spektrometresi üzerinde çalıştırmak için sindirilmiş tek boyutlu SDS-PAGE ve tripsin ile ayrılır.

Buz üzerinde örnekleri çözülme ve bicinchoninic asit (BCA) protein deneyi kullanılarak her numune için protein konsantrasyonu belirlenir.
Tek boyutlu SDS-PAGE için -20 ° C 'de 10 dakika ve saklamak için 5x Laemmli tampon, kaynatma ile, bilinen bir konsantrasyon için örnekler seyreltilir. İki-boyutlu jeller için -20 ° C 'de üre ekstraksiyon tamponu ve depo ile, bilinen bir konsantrasyon için örnekler seyreltilir.
Her kulvarda protein eşit miktarda yükleme seçim jel çalıştırın. Protein Western blotting (adımda olduğu gibi 4.1 'de kontrol grubu) ya da şeritler kütle spektrometri analizi için kesilmiş olabilir için kullanılmak üzere bir nitroselüloz zarına transfer edilebilir; aşağıdaki adımları bkz.
Temiz bir kaba aktarmak için deiyonize su kullanılarak cihazdan jel çıkarın.Oriole jel leke ve ışık engellemek için alüminyum folyo ile sarın konteyner örtün. Jel en az 90 dakika süreyle bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında inkübe izin verin.
UV ışığı, ve bantlar görüntü üzerinde kesilecek işareti kullanarak Görüntü Oriole lekeli jel (Şekil 3). Biz toplam proteom ölçüm çalışmaları için yaklaşık 25 2 mm bantlar halinde her kulvarın kesti.
Temiz bir yüzeye jel yerleştirin. Mühürlü tutulmuştur veya keratin kontaminasyonu engellemek için etanol ile püskürtülür sadece malzeme kullanın. Her band Kes, ve daha fazla 3 eşit parçaya dilimleyin. Kendi etiketli 1,5 ml tüp içine birlikte her grubun her üç parçalarını yerleştirin. Jel adet birkaç ay boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
Enzimatik sindirim için jel fişler hazırlayın. Özet jel parçalar 37 ° C'da gece boyunca tripsin kullanarak. Detaylı jel örneği protokolü için bizim önceki yayın bkz. ^22. Sen tripsin yerine kimotripsin ile düşük molekül ağırlıklı bantları sindirebilir,histon kuyruklarının tripsin kapsamlı bölünme ortadan kaldırmak için.

6. Kütle Spektrometresi ve Veri Analizi

Örnekleri LC üzerinde ayrılır ve MS / MS ile analiz edilmiştir. Spektrumu protein tespiti için bir protein veri tabanı karşısında aranır.

LC / MS / MS ile her bir örnek 10 ul çalıştırın. Biz 75 mikron ters faz kolon ile nano-akış Eskigent LC kullanın. Protein ve peptidlerin bir dizi için optimize LC işletilen kullanın. Mobil faz bir doğrusal gradyan çalıştırmak A (% 0.1 formik asit,% 2 su içinde asetonitril [ACN]), mobil faz B (% 0.1 formik asit, ACN içinde% 20 su):% 5 mobil fazB 50-60 dakika % B, daha sonra en az% 50, B% 95 B, 15 dakika% 95 ve sabit b, son olarak 10 dakika 200 nl / dak 'lık bir akış hızı kullanın. Bir veri bağımlı modunda kütle spektrometresi verileri edinin. Biz iyi 6 en bol ebeveyn iyonları parçaladı bir Thermo Orbitrap kullanın.
Tekrar en az üç biyolojik için çalışır ve iki teknik çoğaltır. (Recommended)
Bir arama algoritması (örneğin SEQUEST veya MASCOT gibi) aracılığı ile tercih Uniprot veritabanı karşı spektrumları aramak için; (kamuya açık seçenekleri Prowl dahil, X Tandem, SpectraST! Piyasada mevcut seçenekleri BioWorks ve Xcalibur dahil) yazılımını kullanın.
Sistein carbamidomethylation ve metionin oksidasyonu, örnek işleme sırasında oluşturulan iki genel değişiklikler için izin vermek için arama parametrelerini değiştirerek düşünün.
Ters veritabanı arama kullanarak bir yalancı pozitiflik oranı hesaplayınız.
Bir eşik güven maçlar sadece kabul etmek için protein kimlik filtreleyin. Biz başlatmak için aşağıdaki parametreleri de tavsiye: Xcorr> 3 (+2),> 4 (+3),> 5 (+4); deltaCN> 0.1, uzlaşma skoru ≥ 20, ebeveyn iyon kütle toleransı 2 Da, kütle toleransı ürün iyon 0.5 Da, en az 2 benzersiz başına protein peptitleri ve en fazla 3 bölünmelere kaçırdı.

7. Etiket serbest Kantifikasyonu

Deteetiketsiz miktarının (Şekil 4) kullanılarak protein nispi bolluk rmine.

Yazılım programları bir dizi sayımı (Prof. Yates grubu), ²³ Elucidator (Microsoft), ²⁴ elek (Thermo Scientific), ²⁵ İskele (Proteome Software) dahil olmak üzere, kütle spektrometrisi verileri etiketsiz miktarının belirlenmesi için yayım ya da ticari olarak temin edilebilir. ²⁶ Bu programlar, bozulmamış peptidler ya da iki ya da daha fazla durum arasında nispi bir protein miktarları ile peptid sıralama olayların sayısı, kütle spektrometrik sinyalin korelasyon amaçlamaktadır.
Her bir program benzer bir analiz boru hattı içeriyor olsa da, bazı programları veri gerçekleştirilebilir spesifik analiz tipleri ile sınırlıdır. Başlangıçta, farklı ishal veri hizalanır, sinyal yoğunluğu normalize edilir ve peptid zirveleri analizi için seçilir.
En yaygın iki yöntem spektral sayma veya LC-MS pik alanı esas miktar vardır. Bollukoranları farklı gruplar arasında peptit bereket değişiklikleri belirlemek için hesaplanır.
Bu programlar protein tanımlama miktar bilgileri ilişkilendirmek için proteomik arama algoritmaları (Maskot, Sequest, X! Tandem) ile arabirim olabilir.
Hem biyolojik (farklı deney örnekleri) ve teknik (kütle spektrometresi üzerinde birden çok kez aynı örnek çalışan) dahil etmek önemlidir verilerin doğruluğu ve tekrarlanabilirliği sağlamak için kitle spec veri çoğaltır.
Ve deneysel koşullar arasında peptit bolluk değişimi ANOVA ile değerlendirildi ve PCA (Şekil 5) ile çizilebilir.

Etiket serbest ölçümü için önemli noktalar. Etiketi içermeyen niceliklendirme yaparken, özel önem her numune işleme ve ayrı ayrı analiz edilmelidir tutarlı örnek hazırlama, sindirim süresi ve LC-MS/MS koşulları sağlamak için verilmelidir. Met aksine(etiketleme eksikliği onları bir arada çalışan olasılığı ortadan kaldırır çünkü) abolic etiketleme yaklaşımlar, etiket içermeyen deneylerde karşılaştırmalar böylece (numune hazırlık yani, numune analizleri tüm yönleriyle yüksek tekrarlanabilirlik gerektiren, farklı kütle spektrometresi çalışan veri yapılır LC ve MS adım) ve yüksek kütle doğruluğu kütle spektrometre kullanımı.

Numune hazırlama ve analiz bilinen bir standart olarak küçük değişiklikler dikkate almak için verilerin normalleştirilmesi yardımcı olmak için her bir örnek için ilave edilebilir. Ayrıca, çoğu yazılım programları enjeksiyon, iyonizasyon ve parçalanma farklılıkları hesaba katmak için veri toplama sonra sinyal şiddetleri arasında normalleşme (arka plan gürültü veya bilinen bol analit ayarlayarak gibi) izin verir. Hizalama algoritması peptid elüsyon profilleri farklılıkları düzeltmek yardımcı yukarıda referans olarak yazılım programları çoğu bulunmaktadır. Biyolojik ve teknik çoğaltır kullanımı olup essenBu istatistiksel analizler protein bolluk içinde gözlenen değişikliklerin tekrarlanabilirlik ve tutarlılığını doğrulamak için izin vermesi, çalışmanın bu tip uzaysal.