Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

Summary

Arasındaki karşılıkçılık incelenmesi Xenorhabdus Bakteri ve Steinernema Nematodlar, yöntemler bakteri varlığı ve nematod içindeki konumunu izlemek için geliştirilmiştir. Diğer sistemlere de uygulanabilir deneysel yaklaşım, mühendislik bakteri saydam nematod içinde floresan mikroskobu kullanarak, bakteri, yeşil floresan protein ve görselleştirme ile ifade gerektirir.

Abstract

Symbioses, iki veya daha fazla organizmaların birlikte yaşama, yaşamın tüm krallıkları boyunca yaygındır. Dünyanın en her yerde organizmaların iki olarak, nematod ve bakteri bu aralıktaki faydalıdır ^1-3 patojenik simbiyotik dernekleri geniş bir dizi oluşturur. Böyle bir dernek Xenorhabdus bakteri ve sembiyoz ⁴ bir model sistem olarak ortaya çıkmıştır Steinernema nematodlar arasındaki karşılıklı ilişkinin olduğunu. Steinernema nematod böcekler ⁵ öldürmek için onların bakteriyel symbiont kullanarak, entomopatojen vardır. Böcek bilgisayarlar arasında iletimi için, bakteri nematod en infektif juvenil evre ^6-8 bağırsak kolonize. Son zamanlarda, birkaç diğer nematod türlerinin böcekler ^9-13 öldürmek bakteri kullanmak gösterilmiştir ve araştırmalar bu sistemlerde nematodlar ve bakteriler arasındaki etkileşimleri inceleyerek başladık <> 9 sup.

Biz mikroskobu ile izlendi nematodların optik şeffaflık yararlanarak, içinde veya bir nematod konak üzerindeki bir bakteriyel symbiont görselleştirme için bir yöntem açıklanmaktadır. Bakteriler floresan mikroskobu kendi görselleştirme sağlayan bir floresan proteini ifade için tasarlanmıştır. Birçok plazmidler farklı dalga boyları (yani yeşil veya kırmızı) ve bir alıcı bakteri symbiont içine bir bağış Escherichia coli suşundan plazmidlerin konjugasyon az floresan proteinleri kodlayan genlerin bakterilerin geniş bir yelpazede için başarılı taşıdıkları mevcuttur. Açıklanan yöntemler Steinernema carpocapsae ve Xenorhabdus nematophila ¹⁴ arasındaki ilişkiyi araştırmak amacıyla geliştirilmiştir. Benzer yöntemler diğer nematod-bakteri dernekler ^{9, 15-18} araştırmak için kullanılan ve yaklaşım bu nedenle genellikle uygulanabilir edilmiştir.

Method dernek ve kolonizasyon ^{14, 16, 19} sürecinin doğasını içgörü sağlayarak, farklı gelişim aşamalarında nematodlar içinde bakteriyel varlığı ve lokalizasyonu karakterizasyonu sağlar. Mikroskopik analiz dokular ^{14, 16, 19-21} barındırmak için bir bakteri nüfusu ve yerelleştirme içinde kolonizasyon sıklığı açısından ortaya koymaktadır. Bu, örneğin sonikasyon ²² veya kolonizasyon ortalama seviyesi sağlayabilir ^23, öğütme gibi nematod popülasyonlarının içinde bakteri izlenmesi başka yöntemlere göre büyük bir avantaj, fakat, örneğin, popülasyonlarından düşük symbiont yüklerinin bir yüksek frekans ile popülasyonlar ayırt olmayabilir Yüksek symbiont yükleri düşük frekans. Kolonizasyon fenotipleri ²¹ bakteriyel mutantların tarama veya karakterize ederken frekans ve kolonize bakteri yükü farklılaştırması özellikle önemli olabilir^{, 24.} Gerçekten de, floresan mikroskobu ^{kolonizasyon, 17, 18} kusurlar için bakteriyel mutant yüksek verimli tarama teknikleri kullanılmaktadır ve sonikasyon ^{22, 25-27} ve bireysel nematod disseksiyon ^{28, 29} de dahil olmak üzere diğer yöntemler, daha az zahmetli bir iştir edilmiştir.

Protocol

1. Konjugasyon üzeri Floresan Bakteriyel Gerinim İnşaat

1. Alıcı suşu (symbiont irdelenmesine) ve donör zorlanma gecede büyümek. Verici gerilme, genellikle Escherichia coli, birleşme yoluyla DNA verici yeteneğine sahip olmalıdır ve transforme edilmesi gereken bir floresan proteini kodlayan bir gen taşır, (Tablo 2) plazmid. Plazmid bağlı olarak, bir birleşme yardımcı yük de gerekli olabilir. Eğer öyleyse, bu gerginlik de gecede yetiştirilmelidir. Donör strain ve strain yardımcı plazmid bakımı için seçmek için antibiyotik ile yetiştirilmelidir.
2. Orta kültür 1:100 oranında antibiyotik eksik besin açısından zengin büyüme ortamı ....

Discussion

Burada açıklanan protokol bir evsahibi nematodu (Şekil 1) içinde bakteri optik tespit için bir yöntem sağlar. Bu yöntem, nematod konak (Şekil 3) içinde bakteri in vivo analizi sağlayan, nematod optik şeffaflık ve floresan etiket bakterilerin yeteneği yararlanır. Özellikle, bu yaklaşım onun konak içinde bakteriyel yerelleştirme tanımlar. Bakteriyel varlığı için bir nematod popülasyonu ve puanlama sayarak, nematod popülasyonu üzerinde bakteri kolonizasyonu sıklığını (Tabl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Lipid Agar (Steril)			8 gram besin suyu, 15 gr agar, 5 gr maya ekstresi, 890 ml su, 10 ml 0.2 g / ml 'MgCI2. 6H 2 0, 96 ml mısır şurubu çözelti *, 4 ml mısır yağı * Plakalar dökerken medya Stir * Otoklav sonrası steril madde ekleyin
Mısır Şurubu Çözüm (Steril)			7 ml mısır şurubu, 89 ml su mix ve otoklav
Yumurta Çözüm			16.6 ml% 12 sodyum hipoklorit, 5 ml 5M KOH, 80 ml su
Lysogeny Broth (Steril)			5 g maya ekstresi, 10 g tripton, 5 g tuz, 1 L su mix ve otoklav
Mikrofuge'de	Balıkçı	13-100-675	Mikrofuge'de tüpleri tutan Herhangi mikrofuge'de çalışacak
Santrifüj	Beckman	366802	15 ml ve 50 ml konik tüpler tutan Büyük masa üstü santrifüj
Steril 60 mm X 15 mm Petri Dish	Balıkçı	0875713
50 ml santrifüj tüplerine	Balıkçı	05-539-6
15 ml santrifüj tüplerine	Balıkçı	05-531-6
Steril 100 mm X 20 mm Petri Dish	Balıkçı	0875711Z	Standart Petri kutularına daha derin
24-kuyulu plakalı	Greiner Bio-One	662000-06
Mikroskop			Mikroskop sizin fluorofor ile floresan yetenekleri uyumlu ihtiyacı
Paraformaldehyde	Elektron Mikroskopi Bilimleri	15710
PBS (Steril)			8 g NaCl 0.2 g KCL 1.44 g Na 2 HPO 4 0.24 g KH 2 PO 4 1 L su 7.4 ve su 1 L ve otoklav bir pH 'ye ayarlayın
Mikrofuge'de tüpler	Balıkçı	05-408-138	2 ml veya 1.5 ml tüpler
Shaker			Sıvı hafifçe hareket etmesine neden oluyor herhangi çalkalayıcı çalışır
Diaminopimelic asit	Sigma	D-1377	Gerekirse, bir konsantrasyon veya 1 mM medya takviyesi