Yöntem makalesi

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

18K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/4344

⸱

28 Şubat 2013

 ,  ,  , 
1Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Kazanç ya da kayıp fonksiyon-arabuluculuk lentivirüs kullanarak bir saç kökü yenilenme modeli Doku özgü analizi.

Özet

Saç folikülü morfolojilerinden, epitel kökenli keratinositlerin ve altta yatan mezenşimi arasındaki etkileşimi gerektiren karmaşık bir süreçtir, organ gelişimi ve doku-spesifik sinyal incelemek için cazip bir model sistemidir. Saç folikül gelişimi olmasına rağmen bu süreç için önemli faktörler genetik uysal, hızlı ve tekrarlanabilir analiz bir sorun olmaya devam etmektedir. Burada hedeflenen ekspresyonu ya da bir doku-spesifik bir şekilde lentivirüs kullanarak faktör shRNA-aracılı devirme oluşturmak için bir prosedür açıklanmaktadır. Bir saç rejenerasyon modeli 5, 6, 11 değiştirilmiş bir sürümünü kullanarak, saç folikülü morfolojilerinden yol epitelyal-mezenkimal sinyal yollarının çalışma kolaylaştırmak için sağlam kazanç veya birincil fare keratinositler ve dermal hücrelerin kaybı fonksiyon-analizi elde edebilirsiniz . Biz lentivirüs contai teslim, taze Birincil fare keratinosit ve dermal papilla hücrelerini ve bunların öncüleri içeren dermal hücreleri izole etmek nasıl tarifhücre popülasyonlarının birine shRNA ya da cDNA ya da vaziyette, ve çıplak farelerin sırt üzerinde tam olarak oluşmuş saç kökü oluşturmak için hücrelerin bir araya getirir. Bu yaklaşım, üç hafta içinde saç köklerinin üretmek için gerekli doku-spesifik faktörlerin analizine olanak ve mevcut genetik modellere hızlı ve kolay bir arkadaşı sağlar.

Protokol

1. Cilt Diseksiyon için 0 ila 2 gün Eski Yenidoğan Fare hazırlayın

  1. En az 20 dakika süreyle bir CO 2 odalarını kullanarak fare yavrular Euthanize. Kadar diseksiyonu kadar bir saat için buz üzerinde yavrular bırakın. P0-P2 fareler oldukça eski fareden hazırlanan hücreler olarak tavsiye edilir progenitör kapasitesi düşmüş düşük greft verimleri sonuçlar. % 70 etanol bir tabak (adım 1.3) ve yıkama solüsyonu üç yemekler (adım 3) hazırlayın cildin diseksiyon yapmaya hazır. Dispase Çözüm çözülme ve 4 bırakın ° C Servikal ötanazi sağlamak için CO 2 aşırı maruz kalma sonrasında yavruların yerinden.
  2. Buz ve steril bir akış kaputu transferi bir kültür çanak ötenazi yavrular yerleştirin.
  3. Kısaca steril kültür çanağı üzerine% 70 etanol ve yerde daldırarak yavrular yıkayın.

2. Fare Cilt teşrih

  1. Steril makas ile gövde tabanına her uzuv ve kuyruk kesiniz.
  2. Cu çifti arasında sıkıca vücut tutunSVEd forseps ve baş yatan fasya nüfuz etmeden bir neşter kullanılarak kuyruk dorsal cilt boyunca bir kesi yapmak.
  3. Dikkatlice uzakta fare orta hattan cilt soyma.
  4. Kavisli bir forseps uzun kenarı ile sıkıca maruz fare tutun ve fare posterior sonunda deri altında kavisli bir forseps bir çift ekleyin ve hafifçe fare ventral yarısında doğru kalça üzerine deri çekin.
  5. Dikkatle tek bir hareketle tamamen fare kapalı cilt soyma ve karkas atın.

3. Dispase Çözüm Cilt ve İnkübasyon yıkayın

  1. Dermis yüzü yıkama solüsyonunun ilk çanak cildin aşağı gelecek şekilde yerleştirin. Cilt Dağılın ve forseps ile karıştırılır. Sonraki kaplamayı diseksiyon ise yıkama solüsyonunun ilk çanak cilt bırakın.
  2. Yıkama çözeltisinde ilk çanak içinde bir sonraki parçalara deri yerleştirdikten sonra, yıkama çözeltisi, ikinci çanak için önce deri aktarın. Inci derileri tutune ikinci yıkama solüsyonu bütün derilerden toplanana kadar. Nihai yıkama derileri tüm transfer, kısaca ajitasyon.
  3. Steril bir 10 cm kültür çanak için 10 ml buz soğuk dispase ekleyin. Dispase Çözüm için cilt aktarın ve cilt Dermis tarafı aşağı dümdüz.
  4. 4 de 8-16 saat boyunca cildi Float ° C (alternatif seçenek: 1 saat 37 ° C'de).

4. Ayrı Dermis ve epidermis

  1. Yeni bir steril kültür çanak için cilt aktarın ve cilt Dermis tarafı aşağı dümdüz. Bir neşteri ile bir köşeden dermis dikkatlice basılı tutun.
  2. Forseps ile epidermis kavrayın ve yavaşça sıyırın dermis. Epidermis uzakta tek parça olarak soyma gerekir. Epidermis beyaz ve ince olacak ve dermis, kahverengimsi kalın ve jelatinimsi olmalıdır.
  3. Ayrı steril kültür kaplarına iki dokular ayırın.
    1. Bir dermal özgü gen demonte / aşırı greft yapmak için, dermis almak ve t ile çok küçük parçalar halinde doğrayınwo neşter. Epidermis atın. Enfeksiyonu (adım 7) günü, lentiviral enfekte cilt hücreleri birleştirmek için taze, işlenmemiş epidermal hücreler hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih.
    2. Epidermal özgü gen demonte / aşırı greft yapmak için, 6 içine her epidermisin dilim - 8 küçük parçalar. Dermis atın. Enfeksiyonu (adım 7) günü, lentiviral enfekte epidermal hücreleri ile birleştirmek için taze, işlenmemiş deri hücrelerini hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih.

5. Kıyılmış Doku Primer Fare Dermal Hücreleri (MDCS) ayrışır

  1. 1 saat boyunca 37 ° C 'de taze collagenase Çözelti, dermal parçalar inkübe edilerek MDCS ayrışır. Yavru fare başına kollajenaz Çözüm 10 ml kullanın.
  2. Yavaşça solüsyon içeren dermis her 10 dk karıştırın. Bir mikroskop altında ayrışma derecesini kontrol edin; sindirilmiş hücre süspansiyonu çoğunlukla tek hücre olmalıdır. Çözüm açık itibaren bulutlu değiştirmek gerekirdermal hücrelerin dermis uzaklaşılmış.
  3. Kollajenaz aktivitesini azaltmak için% 10 nihai hacmi dermis içeren Kollajenaz Çözüm FBS ekleyin.
  4. Sindirilmemiş iri küme ve bütün köklerinin kaldırmak için yeni bir 50 ml tüp içine bir 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu geçirir. 30 ml başına DMEM/10% FBS 10 ml ekleyin akan daha kollajenaz sulandırmak için.
  5. Santrifüj tüpleri daha bütün köklerinin kaldırmak için 5 dakika süreyle bir masa santrifüj 30 xg'de sindirilmiş dermis içeren.
  6. Yeni bir 50 ml tüp süpernatantı dikkatle aktarın. 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg'de santrifüj Pelet hücreleri.
  7. DMEM/10% FBS ile hücrelerin (yavru başına 1 ml) süspanse edin ve hücreleri saymak. Enfeksiyonu için Amniomax C-100 medya (adım 7) Levha hücreleri veya (adım 9) greft lentivirüs-enfekte KC ile birleştirmek. Tipik verim yavru başına 20 x 10 6 hücre olduğunu.

6. Birincil Keratinosit çözerlerKıyılmış Doku dan s (KC)

  1. 15 dakika boyunca 37 ° C 'de taze çözülmüş% 0.05 tripsin-EDTA ile epidermal parçalar inkübe edilerek KC ayrışır. Pup fare başına Tripsin-EDTA 7 ml kullanımı.
  2. Epidermis her 5 dk içeren yavaşça girdap çözüm.
  3. Tripsin aktivitesini azaltmak için tripsin-EDTA içeren epidermis Nötralleştirme Çözüm eşit hacmi ekleyin.
  4. 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg'de santrifüj Pelet hücreleri. Kalan sindirilmemiş dokusu üstünde yüzer olmalıdır.
  5. Dikkatlice sindirilmemiş doku ile süpernatant çoğu kapalı dökün. Rahatsız edici hücre pelletini olmadan bir 10 ml pipet ile kalan Süpernatantı. PBS ile hücre pelletini tekrar. Durumda KCS tamamen pelet değil, süpernatant çoğu kapalı dökün ve en hücrelerin peletlenmiş kadar santrifüj tekrarlayın.
  6. Kalan doku veya kümeleri kaldırmak için yeni bir tüpe 70 mikron hücre süzgecinden hücre süspansiyonu süzün.
  7. Santrifüj Pelet hücreleri5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg.
  8. CnT-07 ortamı ya da PBS (PUP başına 1 ml) ve sayım hücrelerde yeniden süspanse hücreler. Enfeksiyonu için kaplama hücreleri (adım 7) CnT-07 kullanın (adım 9) greft lentivirüs-enfekte MDCS ile birleştirmek PBS kullanın. Tipik verim yavru başına 3-10 x 10 6 hücre olduğunu.

7. ShRNA veya cDNA içerenler Lentivirus ile Primer Hücre Infect

Enfeksiyon gününde (adım 9) aşılama günü virüsle enfekte olan hücreleri birleştirmek için taze, işlenmemiş primer KCS veya MDCS hazırlamak için fare derileri başka bir set teşrih.

    1. MDCS için plaka 4 x 10 37 AmnioMAX-C100 medya ve inkübe ile 10-cm plaka başına 6 MDCS ° C,% 50 hücre yoğunluğu ertesi gün enfeksiyon için +% 5 CO 2. MDCS genellikle 3-4 plakaları bir aşı üretmek için kullanılır, ve plakalar 10-12 toplam bir deneyde, üç greft üretmek için ihtiyaç vardır. Alternatif olarak, MDCS eklemek izin ve f yayıldıya da 37 az 2 saat, en az ° C ±% 5 CO2 ve enfeksiyon hücre kaplama aynı gün yerine getirir. MDCS fibroblast benzeri morfolojiye sahip olacaktır.
    2. KC için, plaka 12 x 10 37 CnT-07 medya ve inkübe ile 10-cm plaka başına 6 KC ° C ertesi gün enfeksiyon için +% 5 CO 2. Alternatif olarak, KC 37 az 2 saat en az takın ve yaymak izin ° C +% 5 CO 2 ve aynı gün enfeksiyonu gerçekleştirin. KC Genellikle 3-4 tabak bir greft oluşturmak için kullanılır. 10-12 plakaları toplam bir deney için üç greft üretmek için ihtiyaç vardır. KCS arnavut morfolojisi sahip olacaktır.
  2. 37, 8 ug / ml Polybrene Çözelti ° C ±% 5 CO2 ile 5-10 dakika için hücreler Preincubate.
  3. Değişim medya ve lentivirüs eklemek + 8 mg / ml Polybrene Çözüm. Lentiviral titresi inşa kullanılan ve enfeksiyon öncesi tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir.
  4. 32, 1 saat boyunca bir masa üstü santrifüjü 200 x g'de santrifüjleyin ° plakaları; Lentivirüs ile hücreleri enfekte etme C.
  5. Lentivirüs içeren ortamları çıkarın ve taze medya ekleyin. KC için, taze medya geri eklemeden önce bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. Genellikle enfekte hücreleri kurtarmak 37 gecede ° C +% 5 CO 2. Alternatif olarak, 37 iyileşme en az iki saat izin ° C aşı için hücreler tripsinize önce +% 5 CO2. Temsilcisi Sonuçlar bölümünde açıklandığı gibi enfeksiyon verimliliğini kontrol etmek için kültür bulaşmış hücrelerin küçük bir kısmı için devam edin.

8. Aşılama için Enfekte Hücreler hazırlayın

  1. 4-6 arasındaki adımları kullanarak cilt taze primer MDCS veya KCS ayırın. Buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Hücreleri saymak.
    1. Dermal spesifik gen devirme / ekspresyonu için aşı, 8 dk için 37 ° C sıcaklıkta% 0.05 tripsin-EDTA ile plakalar enfekte MDCS ayrışır.
    2. Epidermal özgü gen demonte / aşırı greft için plakalar USI enfekte KC ayırmak37 ng% 0.125 Tripsin-EDTA ° C de 15 dakika.
  3. DMEM +% 10 FBS (MDCS) veya Nötralleştirme Çözüm (KC) kullanarak tripsin aktivitesini nötralize. 50 ml'lik bir tüpe hücreler tripsinize aktarın.
  4. 5 dakika için bir masaüstü santrifüj 200 xg'de santrifüj Pelet hücreleri.
  5. Buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Hücreleri saymak.
  6. Taze hazırlanmış işlenmemiş mevkidaşı ile hücre tipi virüsle enfekte olan hücreleri birleştirin. Bir greft için, 4 ° C'de buz soğuk steril PBS ve pelet bir masaüstü santrifüj hücre bulamaç 7-10 x 10 6 KCS ile 7-10 x 10 6 MDCS birleştirmek 50 -100 ul buz soğuk steril PBS içinde süspanse edin hücreleri. Nu / nu fare odaları hazır olana kadar buz üzerinde hücreleri tutun.

9. Nu / nu Fare Back üzerine Yara Yatak ve Fix Odası Oluştur

Greftleme bir gün önce% 70 etanol içinde iliklerine tarafından otoklav ve steril silikon odaları ile cerrahi aletleri sterilize edin. 70% etha değiştirinodaları kullanmadan önce steril PBS ile nol.

  1. Anestetize nu / nu fare (7-12 haftalık dişi) intraperitoneal (100 μl/10 g vücut ağırlığı) ya da başka bir tercih edilen yöntemi yolu ile ketamin (8 mg / ml) / ksilazin (1.6 mg / ml) kullanarak. Göz yağlayıcı. Farenin altındaki Sıra ısıtma pedi.
  2. Iyot ile çıplak fare geri deriyi dezenfekte ve alkol bezlerden ile temizleyin.
  3. 1-3 topikal kesi site% 0.25 bupivakain düşer ekleyin. Forseps ile boyun tabanındaki çıplak fare geri cilt sıkıştırın.
  4. Steril makasla sıkışmak deride küçük dairesel delik (çapı ~ 1 cm) kesin.
  5. Yara yatağı üzerine steril odasına yerleştirin ve cilt çevreleyen odaya kenarlarını kaplayacak.
  6. Şekil 2A gösterildiği gibi kamara kenarlarında dikiş (kamara başına 6 dikiş) ile yerine Güvenli odası.
  7. odaları hazır, yavaşça girdap hücre çamur ve 1 ml enjektöre bağlanmış 23 gauge iğne içine çekmek. Hücre bulamaç yavaşça alt yoğunlaşmış iseiğne içine çizmeden önce 1 ml pipet ucu ile tekrar süspansiyon haline getirin.
  8. Delinme iğne ile oda ve yavaş yara üzerine hücreleri damla.
  9. Temiz, otoklavlanmış kafesleri içine yerleştirin fareler. House 2 kafes başına fareler ve içme suyu için antibiyotik ve Tylenol (3 mg / ml) ekleyin. Bizim tecrübelerimize göre, kafes başına iki dişi farelerde olumsuz odasına travma, greft, veya hayvan sağlamamıştır.
  10. Yarım kafesinin altında ısınma pedi yerleştirin ve anestezi kapalı giyer kadar fareler gözlemlemek.

10. 7-9 gün sonra Odası kaldır

  1. Adım 9.1 'de olduğu gibi odacıklı nu / nu fare anestetize. Göz yağlayıcı.
  2. Iyot odasının etrafında deriyi dezenfekte ve alkol bezlerden ile temizleyin.
  3. Dikkatlice dikiş kesip odasından çıkarın.
  4. Yavaşça fare odası çıkarın. Odaya yeni deri grefti sopa, forseps kullanarak odasından odasının parçası ve yavaşça ayrı greft kaldırırsanız. Odanın çıkarılması sırasında greft basılı tutun. Greft loo gerekirŞekil 2B gibi k mat ve opak.
  5. Yeri (2 ilmek) içine açık yara ve dikiş üzerine antibiyotik ince bir film ile bir yapışmaz pad uygulayın.
  6. Ped güvenli ve yara korumak için fare etrafında bandaj sarın. Yerine bandaj dikin.
  7. Silikon odaları sabunla ovarak temizlenmeli ve iyice deiyonize su ile durulanır. % 70 gecede etanol, hava kuru ve mağaza odaları bekletin.

11. Saç Büyüme için Fare inceleyin

  1. Odasının kaldırılması 3 gün sonra bandaj ve pedi çıkarın. Greft kuru ve kahverengi renkte opak olmalıdır.
  2. Saç büyümesi için periyodik farelerde kontrol edin. Saç greft sonra 16 gün de göstermeye başlamalıdır.

Prosedür Anahat

1. Gün (2-3 saat): yenidoğan yavrular Kurban deri kaldırmak ve 4 ° C gecede dispase üzerine bırakın.

2. Gün (2-3 saat): derinin primer hücreler izole veönerilen hücre yoğunluğu plaka.

3. Gün (3-4 saat): lentivirüs sahip hücreler Infect. Yenidoğan yavruların başka bir dizi deri çıkarın ve 4 ° C gecede dispase üzerine bırakın.

4. Gün (6-8 saat): derinin primer hücreler izole, saymak ve buz üzerinde bırakın. Tripsinizasyonla ve santrifüj ile lentivirüs-enfekte hücreleri Kurtar, saymak ve greft başına PBS 50-100 ul içine 7-10 x 10 6 dermal hücrelerin ve keratinositlerin birleştirir. Fare üzerindeki yara yatağı oluşturma, kamara takın ve yatak yara hücre karışımı uygulanır.

Alternatif Prosedürü Outlines

Alternatif yordamı anahatları dört gün üç prosedürü kısaltacaktır.

  1. Bir saat (tahmini süre 5-7 saat) için 37 ° C'de dispase fare derileri davranarak Gün 1 ve Gün 2 birleştirin.
  2. İki saat boyunca kaplama hücreleri (tahmini süre 5-7 saat) sonra lentivirüs ile hücreleri nüfuz ederek Gün 2 ve 3. Gün birleştirin.

Sonuçlar

Şekil 1 'de bir 3-haftalık rejeneratif saç aşı olarak, düzeltilir (SMO), kritik bir Shh sinyal bileşeninin dermal-özgü lentiviral shRNA portatif bir sonucu göstermektedir. Yalnız lentiviral vektör kullanarak Kontrol greftler sağlam saç büyüme (Şekil 1A) göstermektedir. Buna karşılık, saç büyüme (Şekil 1B) kaybına SMO sonuçlarının dermal özgü devirme. Hematoksilen ve eozin leke saç kontrol folikülleri ve deneysel koşullar (Şekil 1C, D) sahne resmediyor. Benzer tedaviler saç büyüme fenotipi lentiviral vektör yalnız enfeksiyonu ile pozitif kontrol dahil olmak üzere, deneyler arasındaki değişken olabilir. Bu nedenle her zaman pozitif kontrol greft greft% 30 yara izi veya greftler tamamlanmamış ek bir sonucu olarak bozulabilir bir referans olarak, her deneyde de dahil edilmelidir. Yeniden bir faktör cDNA örneğin eksprese olarak iki etken arasındaki etkileşim test durumunda,Başka bir faktör scue shRNA aracılı demonte bir zaman tezahür her deneyde kaybı fonksiyon-sonuç knockdown yalnız greft içermelidir. Bu, belirli bir gen saç folikülü rejenerasyon yolu ve nasıl iki gen etkileşim bozulacaktır nasıl belirlemek için gerekli bir dizi sağlayacaktır.

Bölmesinin (Şekil 2A) çıkarılması dikkatle yapılması gerekmektedir. Yeni kurulan greft donuk bir yüzey (Şekil 2B) ile hafif opak olmalıdır. Greft greft yara yatağa bağlı kalır emin olmak için önemlidir bu yüzden yavaşça bir tarafı kaldırarak, odasına yapışabilir. Greft üç gün sonra oldukça istikrarlı ve soyunma çıkarırken biraz zorluk sunmalıdır. Sağlam saç büyüme üç hafta (Şekil 2C) sonra uyulmalıdır. MDCS veya KCS ya da yokluğu, saç (Şekil 2B) 11 olmaksızın, geri kazanılmış bir yara bölgesinde neden olur. Birindeki hücre ölüm ya da hücre kaybınaŞekil 1B 'de gösterildiği gibi dermal-SMO devirme azaltılmış saç rejenerasyon aksine, saç içinde hücre tipleri de sonuçlanır.

Başarılı bir tahlil sağlamak için, aşılama öncesinde uygun ekspresyonu ya da devirme verim ile% 90'dan daha fazla hücrelerin viral enfeksiyon elde etmek için çok önemlidir. Aşılama işlemi sırasında kısıtlamaları nedeniyle, biz bir aşılama deney başlamadan önce sorun çekim viral enfeksiyon verimliliği, tavsiye ve her zaman kaybı veya kazancı-of-ekspresyonu doğrulamak için prosedür aşılama günü hücrelerinin küçük bir bölümünü kaydedebilirsiniz. Lentiviral titresi inşa kullanılan ve enfeksiyon 90-100% verim elde etmek için önce tespit edilmelidir bağlı olarak değişecektir. Biz lentiviral vektöründen coexpressed GFP ile viral enfeksiyon etkinliğini izlemek. Biz rutin knockdown veya aşırı ölçüde belirlemek için kantitatif PCR ve / veya Western Blot gerçekleştirin. Etiketlemek için floresan etiketleri ile çift-ekspresyon vektörleri kullanmakviral enfekte hücreler sinyal ve olgun greftler bizim yapıları eksprese eden hücrelerin sayısı perdurance bildirmek için bir yol sağlar. Bu vektör lentiviral SMO shRNA ile kombinasyon halinde pSicoR-CMV-GFP 10 bir CMV promoter ile tahrik GFP kullanır. Şekil 3, biz GFP temsilcisi saç kökü dermal papilla olarak lentivirally-ifade edilir 3 haftalık dermal özgü greft göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 1. Saç folikülü büyüme histolojik analiz. (A) boş lentiviral vektör ve işlenmemiş keratinositler ile enfekte deri hücreleri ile kontrol saç rejenerasyon greft görüntüle. (B) dermal hücrelerde lentiviral shRNA kullanılarak düzeltilir knockdown saç köklerinin dökülmesi tedavisiz keratinositler sonuçları ile birlikte. (C) Hematoksilen ve eozin boyama anagen kıl f gösterirkontrol greftlerde ollicles dermis içine doğru uzanır ve (D) düzeltilir knockdown saç folikülleri bodur ve büyük ölçüde eksik kalır. Tüm görüntüler üç hafta greftleme sonrası vardır. Ölçek çubuğu 100 mikron gösterir.

figure-results-2
Şekil 2. Birincil hücreler Aşılama. Sütüre bölmeli gövde primer dermal hücrelerin ve keratinositlerin (A) nu / nu fare. (B) Odanın kaldırılmasını yeni donuk ve karakter opak olduğu cilt oluşur ortaya çıkarır. (C) greft Tam yetiştirilen tüyleri kullanarak yaban- aşılama sonrası üç hafta az ilköğretim dermal hücrelerin ve keratinositlerin yazın. (D) keratinositler primer dermal hücrelerin eklenmesi üç hafta sonra hiçbir saç yol açar. Benzer sonuçlar dermal hücrelerin primer keratinositlerin ilavesi ile görülür.

figure-results-3
Şekil 3,. 3 hafta eski rejenere greft dermal papilla dermal papilla GFP Bakım. Konfokal görüntüler. GFP lentiviral vektöründen dermal hücre popülasyonu ifade ve dermal papilla (yeşil) saptandı. Versican (kırmızı) dermal papilla ve çekirdekleri Hoechst (mavi) ile etiket vardı demarcates. Not GFP dermal hücrelerde değil fakat çevreleyen, keratinositler içerisinde spesifik olarak ifade edilir. Ölçek çubuğu 20 mikron gösterir.

Tartışma

Saç sulandırıldıktan deneyleri de novo saç folikülünün oluşum mekanizmasını incelemek için eşsiz bir organ yenilenmesini model sağlar. Burada, biz saç folikülü oluşumu gen fonksiyonu belirlemek için kullanışlı bir modifiye kamara saç testi açıklamak. Bizim bu tahlil epidermis hücre tipleri ya da gen ekspresyonu ya da devirme elde etmek için bir teknik lentiviral ifade tanıtmak için modifiye bildirilen oda saç sulandırma tahlil 5, 6,11, esas alınmaktadır. Bizim assay doku-spesifik genetik nakavt oluşturmadan hızlı bir alternatif sunuyor. Bu test bize greft toplama lentivirüs primer hücreler bulaşmasını kadar az üç hafta içinde saç folikülü oluşumu gen fonksiyonu göstermek için izin veriyor. Tüm tahlil bir hücre tipinde 12 içine lentivirüs ile kombinasyon shRNA / cDNA teslim kullanılarak genetik etkileşimleri gidermek için uzatılabilir gibi dermal ve epidermal hücre tip arasında sinyal inceleme sağlares.

Ince kusurları gözlemlemek zor iken Bizim saç testi iyi, saç folikülü rejenerasyon güçlü kazanç veya kayıp fonksiyon-fenotipleri tespit için uygundur. Biz başarıyla saç rejenerasyon tahlil 1,12 kullanarak birkaç gen dermal özgü gen fonksiyonu göstermiştir. GFP işaretleyici dayanarak shRNA 10 ifade lentivirüs vektöründen ortak ifade, biz donör dermal hücrelerde eksprese shRNA rejenere saç greft devam ettiği gösterilmiştir. GFP pozitif hücreler rejenere saç köklerinin (Şekil 3) dermal papilla (DP) mevcuttu. Hücreleri dolayısıyla gözlenen saç folikülü fenotipi null genetik hypomorph bir dizi vardı, GFP düzeylerde ifade olarak DP hücreler olasılıkla gen demonte farklı düzeylerde oluşuyordu.

Bu tahlil için bir gelişme graftin önce yüksek shRNA eksprese eden hücreler için hızlı ve etkili bir seçim kurmak için olacaktırg kuvvetli GFP-ifade eden hücrelere arındırmak için FACS kullanılması. Alternatif bu tahlil 9 mutant ya da koşullu knockout hücre ikame etmektir. Primer dermal geçişli hücreler bir kez DP etki yavaş yavaş kaybolması gibi diğer yandan, DP hücre fonksiyonunu koruyan bir kültür sistemi çok yararlıdır. Potansiyel kültür sistemleri yapay niş veya toplama kültürlerden 2,7,8,13 türetilen biyomalzemelerin kullanımını içerir. Başka bir gelişme bu dermal-spesifik kaybı ya da taze keratinositler oluşturmak için fare yavruların bir ikinci birimler kümesi (adım 7) 'nin kullanımını azaltır gibi yüksek bir hücre geri kazanım oranı ile, güvenilir bir epidermal hücre dondurma yöntemi kazanç-of-üretmek için olacaktır fonksiyon çalışmaları.

Saç büyüme biraz daha eşitlenmiş ve follikül yönelim daha rastgele olmasına rağmen bu kamara saç testi, saç folikülü yoğunluğu ve normal fare derisine benzer kalitede üretir. Saç rejenerasyon genetik testin birkaç sınırlamalar dahil olmak üzereE lentivirüs ve hücre sayıları büyük miktarda ihtiyacı ve bu tür yama ve flep testleri 3,4,14 gibi saç sulandırma testlerinin diğer formları ile karşılaştırıldığında cerrahi yöntemler açısından yoğun çok emek. Ancak, saç büyüme tespit etmek için saç folikülleri ve zaman çizelgesinin kalitesi diğer deneyleri 4 üstündür. Bizim hedef saç rejenerasyon tahlil varolan genetik modellere hızlı ve kolay bir arkadaşı sağlar.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Bu çalışma NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) ve NIH hibe AR052785 ve AR046786 (AEO ve W.-MW) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Isim Şirket # Katalog Yorumlar
PBS Invitrogen 14190-144
HBSS Invitrogen 14170-122
DMEM Invitrogen 11995-065
% 0.25 tripsin-EDTA Invitrogen 25200-056
Cnt-07 Hücre K Tec CnT-07
AminoMAX-C100 Invitrogen 17001-074
AminoMAX-C100 Ek Invitrogen 12556-015
FBS Invitrogen 26140-079
Penisilin / Streptomisin Invitrogen 15140-122
Fungizone Invitrogen 15290-018
Gentamisin Invitrogen 15710-064
Dispase Roche 4942078001
, Kollajenaz Tip 1 Sigma C-0130
Polybrene Sigma 107689-10G
Doku kültürü çanak Fisher Scientific 08-772E
Diseksiyon Makaslar Fisher Scientific 11-999
Forseps Fisher Scientific 10-275 kavisli
Scalpal Medex Kaynağı GRF-2975 # 10 Size hayır. 10
70 mikron hücre boyama VWR 21008-952
15 ml konik santrifüj tüpüne Fisher Scientific 14-959-49d
Alkol swablar Fisher Scientific 1368063
23 gauge iğne Fisher Scientific 14-821-13F
Göz yağlayıcı CVS 8883660
Providone-lodine bezlerden Fisher Scientific NC0116841
Silikon Chambers Renner GmbH F2U, 30268
Dikişler Acuderm SUP3524
Esnek bandaj Fisher Scientific 22-363-100
Yapışmaz pansuman TELFA 1050
Malzemeler

Çözüm yıkayın

PBS
500 mg / ml Penisilin / Streptomisin
12.5 mg / ml Fungizone
100 mg / ml gentamisin

Dispase çözümü

HBSS
2.5 mg / ml nihai dispase
100 mg / ml gentamisin

Nötralizasyon medya

HBSS
% 15 (v / v) FBS

Kollajenaz çözüm

% 0.25 (w / v), kollajenaz Tip 1

ontent "> 100 ug / ml penisilin / streptomisin

2.5 mg / ml Fungizone

50 mg / ml gentamisin

Polybrene çözümü

HBSS
8 ug / mL 'lik (ağırlık / hacim) Polybrene

Kaynaklar

  1. Bershteyn, M., Atwood, S. X., Woo, W. M., Li, M., Oro, A. E. MIM and cortactin antagonism regulates ciliogenesis and hedgehog signaling. Dev Cell. 19, 270-283 (2010).
  2. Driskell, R. R., Juneja, V. R., Connelly, J. T., Kretzschmar, K., Tan, D. W., Watt, F. M. Clonal growth of dermal papilla cells in hydrogels reveals intrinsic differences between Sox2-positive and -negative cells in vitro and in vivo. J. Invest. Dermatol. 132, 1084-1093 (2012).
  3. Lee, L. F., Jiang, T. X., Garner, W., Chuong, C. M. A simplified procedure to reconstitute hair-producing skin. Tissue Eng. Part C Methods. 17, 391-400 (2011).
  4. Liang, Y., Silva, K. A., Kennedy, V., Sundberg, J. P. Comparisons of mouse models for hair follicle reconstitution. Exp. Dermatol. 20, 1011-1015 (2011).
  5. Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nat. Protoc. 3, 799-810 (2008).
  6. Lichti, U., Weinberg, W. C., Goodman, L., Ledbetter, S., Dooley, T., Morgan, D., Yuspa, S. H. In vivo regulation of murine hair growth: insights from grafting defined cell populations onto nude mice. J. Invest. Dermatol. 101, 124S-129S (1993).
  7. Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. Designing materials to direct stem-cell fate. Nature. 462, 433-441 (2009).
  8. Osada, A., Iwabuchi, T., Kishimoto, J., Hamazaki, T. S., Okochi, H. Long-term culture of mouse vibrissal dermal papilla cells and de novo hair follicle induction. Tissue Eng. 13, 975-982 (2007).
  9. Rendl, M., Polak, L., Fuchs, E. BMP signaling in dermal papilla cells is required for their hair follicle-inductive properties. Genes Dev. 22, 543-557 (2008).
  10. Ventura, A., Meissner, A., Dillon, C. P., McManus, M., Sharp, P. A., Van Parijs, L., Jaenisch, R., Jacks, T. Cre-lox-regulated conditional RNA interference from transgenes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 10380-10385 (2004).
  11. Weinberg, W. C., Goodman, L. V., George, C., Morgan, D. L., Ledbetter, S., Yuspa, S. H., Lichti, U. Reconstitution of hair follicle development in vivo: determination of follicle formation, hair growth, and hair quality by dermal cells. J. Invest. Dermatol. 100, 229-236 (1993).
  12. Woo, W. -M., Zhen, H. H., Oro, A. E. Shh maintains dermal papilla identity and hair morphogenesis via a Noggin-Shh regulatory loop. Genes Dev. 26, 1235-1246 (2012).
  13. Young, T. H., Lee, C. Y., Chiu, H. C., Hsu, C. J., Lin, S. J. Self-assembly of dermal papilla cells into inductive spheroidal microtissues on poly(ethylene-co-vinyl alcohol) membranes for hair follicle regeneration. Biomaterials. 29, 3521-3530 (2008).
  14. Zheng, Y., Du, X., Wang, W., Boucher, M., Parimoo, S., Stenn, K. Organogenesis from dissociated cells: generation of mature cycling hair follicles from skin-derived cells. J. Invest. Dermatol. 124, 867-876 (2005).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kıl Folikülü OluşumuPrimer Keratinosit İzolasyonuDermal Hücre İzolasyonuLentivirüs EnfeksiyonuDokuya Özgü NakavtKıl Rejenerasyonu ModeliNude Fare GreftiSmoothened Gen NakavtıHistolojik Boyama
Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.