A ile Üretilen Kompleksi Antibiyotik Eritromisin Featuring Mantık, Deneysel Merdivenleri ve Heterolog Doğal Ürün biyosentezi Potansiyeli<em&gt; E. coli</em

Özet

Yoluyla eritromisin A heterolog biyosentezi E. coli aşağıdaki deneysel adımları içerir. Her adımı kullanarak tedavi doğal ürünlerin üretiminde motivasyon, potansiyeli ve zorluklar bağlamında ele alınacak E. coli Bir vekil sunucu olarak.

Özet

Karmaşık doğal ürünlerin heterolog üretimi mevcut sınırlamalar ve gelecekteki olanakları yönelik olarak tasarlanmış bir yaklaşımdır. Bu, tedavi edici değere sahiptir fakat yeterince üretilmiş ya da üretim geliştirilmiş bir şeklinde yararlanacak edilemeyen bileşikler için özellikle yararlıdır. ; 2) heterolog sulandırma ve 3) ürün analizi 1) gen transferi: dahil deneysel prosedürleri üç bileşenden ayrılabilir. Her deneysel bileşen zorlukları karşılamak ve yeni ortaya çıkan bu yaklaşım ile ilişkili fırsatları öngörmeye sürekli iyileştirme altında.

Heterolog biyosentez değerli bir doğal ürün sorumlu genetik dizisinin kimliği ile başlar. Heterolog bir host bu sıra aktarma ürünün oluşumundan sorumlu biyosentetik karmaşıklığı nedeniyle karmaşıklaşır. Bir antibiyotik eritromisin iyi bir örnektir. Yirmi gen ()> 50 kb toplam nihai biyosentezi için gereklidir. Buna ek olarak, bu genlerin üç boyutlu olarak megasynthases, çoklu alan enzimlerin her biri ~ 300 kDa kodlamaktadır. Bu genetik materyal olarak tasarlanmış ve E. transfer edilmelidir Sulandırılan biyosentezi için coli. PCR izolasyon, operon yapı, çok-cystronic plazmidler, ve elektro-transformasyon kullanımına E. eritromisin A genetik küme aktarılması olarak tarif edilecektir coli.

Sonra transfer, E. coli hücre nihai biyosentezi desteklemesi gerekir. Bu süreç aynı zamanda E. arasındaki önemli farklılıklar verilir meydan okuduğunu coli ve karmaşık doğal ürün oluşumundan sorumlu en özgün ana. Hücre biyosentezi desteklemek için gerekli ortamlar sağlarlar ve koordineli aktif enzimleri üretmek için aktarılan genetik kümede ifade etmelidir. Eritromisin A, E. halinde coli hücre iki öncüleri (pr sağlamak üzere tasarlanmış olması gerekiyorduopionyl-CoA ve (2S)-metilmalonil-CoA) biyosentezi için gereklidir. Buna ek olarak, gen sekans değişiklikleri, plazmit kopya sayısı, chaperonin birlikte ekspresyonu, post-translasyonel enzimatik modifikasyon ve işlem sıcaklığının aynı zamanda nihai eritromisin A oluşumuna izin vermek için gerekli idi.

Son olarak, başarılı üretim değerlendirilmelidir. Eritromisin bir olgu için, iki yöntem sunacak. İlk sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) üretim onaylamak ve ölçümüdür. Eritromisin A biyoaktivitesi de antibiyotik aktivite Bacillus subtilis karşı test edildiği bir biyo-analizi kullanımı yoluyla teyit edilecektir. E. eritromisin kurmak değerlendirme deneyleri A biyosentezi üretimi artırmak veya çeşitlendirmek için gelecek mühendislik çalışmaları için ve bu yaklaşımı kullanarak yeni kompleks doğal bileşiklerin üretimi için sahne coli ve ayarlayın.

Giriş

Eritromisin A Gram pozitif toprak bakterisi Saccharopolyspora Eritre tarafından üretilen bir poliketid antibiyotik ve mevcut üretim aşamalı geleneksel mutagenez ve tarama protokolleri on yıllar boyunca ve daha yakın proses optimizasyonu düzenleri ^1-6 yoluyla ~ 10 g / L için geliştirilmiştir. Mutagenezi ve tarama stratejileri kültür ve / zorluklar sonucu veya genetik olarak yerli üretim ana manipüle ve çünkü hazır antibiyotik etkinlik veya seçimle yardım etmek için geliştirilmiş büyüme fenotipleri antibiyotik doğal ürün geliştirme yaygındır. Eritromisin A, S. durumunda, Eritre üretim ve yeni türevleri biyosentezini engellemektedir....

Protokol

Aşağıdaki metin eritromisin A antibiyotik için spesifik olan, ancak adımları heterolog biyosentezi için aday olan diğer doğal ürünler için genel olarak uygulanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır.

1. Eritromisin A Genetik Küme Transferi

1. Tasarım PCR primerleri S. içindeki eritromisin A kümesi ile ilişkili genlerin tüm yükseltmek için Eritre kromozom. Bu adım olan genetik dizileri tespit edilmiş olan doğal ürün adaylar özgüdür. Alternatif olarak, gerekli genlerin yeni sentezlenen genlerin yeni E. içinde optimum kodon kullanım için tasarlanmış olacağını avantajı ile (birkaç ticari satıcı seçenekleri aras....

Sonuçlar

Bu yaklaşımın istenilen sonucu E. tamamen biyoaktif doğal ürünün üretim konak heterolog coli. Bu, en iyi üretim (Şekil 6) ve (Şekil 7) nihai aktivitesini teyit etmek için kullanılan antibakteriyel biyoassay onaylamak ve ölçmek için kullanılan LC-MS sonuçlar ile temsil edilir. Heterolog biyosentezinin genel düzenlemesinde, bu sonuç, başarı tanımlar. Bir kez başarılı, araştırma çabalarının ardından optimizasyonu (hem hücresel hem de süreç ölçeklerde) ve moleküler mühendi.......

Tartışma

2) biyosentetik sulandırma, ve 3) ürün analizi 1) Genetik aktarım: heterolog biyosentezinde Kritik adımlar sürecinde üç usul noktaların her birinde rastlanır. Herhangi bir aşamada bir sorun heterolog biyosentezi kurulması nihai hedefi rayından olacak. Bu kesinlikle başarılı analizine olanak gerekli olduğundan Belki de sürecin en zor yanı, sulandırılmış biyosentezi kuruyor. Ancak, sulandırma nihai biyosentezi sorumlu genetik materyalin dikkatli bir tasarım ve transferi bağlıdır. Aynı şekilde, kurulan hassas analitik yönt.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
PCR makinesi	Eppendorf	Mastercycler kişisel
Dimetil sülfoksit (DMSO)	Balıkçı	BP231
Elektroporatör	BioRad	Micropulser
IPTG	Balıkçı	BP1620
Sodyum propiyonat	Sigma	P1880
L-arabinoz	Sigma	A3256
Soğutmalı Çalkalayıcı	Thermo Scientific	Maxq 4000
Mikrofuge'de	Eppendorf	5415D Santrifüj
pGro7	Takara	Chaperone Plazmid Set (3340)
pET21, pET28, pCDF-Duet-1	Merck Kimyasallar	69742-3, 69.864, 71.340
LC-MS	Applied Biosystems	3200 Q-Trap
Etil asetat	Sigma	270989
Metanol	Sigma	322415
Vakum santrifüj	Eppendorf	Yoğunlaştırıcı 5301
Rotary Evaporatör	Buchi	R-200