Fare Kalpten İlköğretim Melanocyte gibi Hücreleri Ayırma

Özet

Bu protokolde, w e atriyal aritmi farelerde tetikler katkıda farelerin ve insanların kalplerinde (aynı zamanda kardiyak melanosit olarak da bilinir) melanosit benzeri hücrelerin yeni bir nüfus tespit.

Özet

Biz farelerde atriyal aritmi tetikler katkıda farelerin ve insanların kalplerinde (aynı zamanda kardiyak melanosit olarak da bilinir) melanosit benzeri hücrelerin yeni bir nüfus tespit. Kardiyak melanosit elektriksel ve biyolojik özelliklerinin incelenmesi için biz yenidoğan kemirgen kardiyomiyositlerin yalıtmak için tasarlanmış olanlar türetilen fare kalpleri onları izole etmek için bir prosedür geliştirmiştir. Daha geniş olduğunda, yamalı kenetleme ve biyokimyasal çalışmalar için uygun sağlıklı kalp melanosit elde etmek amacıyla, ilk olarak izole edilmesi ve deri melanositleri izole etmek için tasarlanmış olanlar göre kalp melanosit kaplama için zarif bir prosedür geliştirilmiştir. Rafine işlemi bu incelemede gösterdi ve saf bir nüfus olarak veya kardiyomiyositlerin ile kaplı olabilir sağlıklı melanosit benzeri hücrelerin daha fazla sayıda üretir.

Giriş

Biz son zamanlarda melanin sentezi enzimleri ifade ve morfolojik deri melanosit benzer farelerin ve insanların kalbinde yeni bir hücre popülasyonu tespit. Biz bu hücrelerin kalp melanosit 'olarak adlandırılan ve atriyal aritmi genellikle insanlar köken tetikler hangi anatomik yerlerde bulunurlar bulundu. Biz de kalp melanosit DCT germline silinmesi ile farelerde atriyal aritmi katkıda bulundu. Kardiyak melanosit seyrek hepsi atriyal hücrelerin en az% 0.1 içerirler fare atriyum boyunca dağıtılır. Kardiyak melanosit elektriksel ve biyolojik özelliklerinin incelenmesi için biz Cre-uyarılabilir melanosit spesifik işaretlerini kullanarak fare kalp onları izole etmek için bir prosedür geliştirmiştir. Bizim ilk işlemi yenidoğan kemirgen kardiyomiyositlerin ve yama kelepçe kayıtları veya PCR analizi için uygun hücrelerin vermiştir çok az sayıda izole etmek için kullanılan geliştirildi. Ancak, iyileşmek geliştirmek içininci ve elektrofizyolojik analiz veya biyokimyasal çalışmalar daha derinlemesine kardiyak melanosit, canlılığı, biz deri melanosit yalıtmak için tasarlanmış olanlar bir rafine prosedür geliştirmiştir. Bu derlemede anlatılan ve gösterilen prosedür saf nüfus olarak veya kardiyomiyositlerin ile kaplı olabilir sağlıklı kalp melanosit üretme avantajına sahiptir.

Protokol

1. Gerekli Çözümler ve Ekipmanları hazırlanması

1. İlk olarak, 15 dakika boyunca onları otoklav ile cerrahi aletler (düz şekli forseps, kavisli şekli forseps, düz şekli makas ve kavisli şekli makas) sterilize. 121 ° C 'de. Doku kadar kıyma için kullanılacak bir set kalplerini ve diğer set dışarı Anatomi için kullanılan araçların, 2 set hazırlayın.
2. Steril, filtrelenmiş su 900 ml MCDB153 kültür ortamı 1 paket çözülür ve toz çözününceye kadar yavaş yavaş karıştırılır. 1.2 gr sodyum bikarbonat ya da 15.7 mL sodyum bikarbonat solüsyonu, orta nihai her bir litre hacim için hazırlanmış ve çözünene kadar karıştırınız olması [ağ / hac% 7.5] ekleyin. Daha sonra, doku kültürü kaputu (biyo-güvenlik kabini) steril koşullar altında bir 0.2 mikron filtre içinden şişe iyi ortamı dökün, 1 N HCI veya 1 N NaOH eklenerek 7.2 'da pH ayarlayın. Sonra medya toplamak ve 4 ° C'de saklayın.
3. Takviyeleri hazırlanınkültür ortamı (Malzeme Listesi) ekleyin. Ek ortam hücreleri kaplama için gerekli olan hemen önce ortama ilave edilmelidir.
4. % 10 FBS artı antibiyotik (penisilin ve streptomisin) ile DPBS hazırlayın.
5. DPBS artı antibiyotik (penisilin ve streptomisin), 100 ml, sonra, 0.25 g tripsin (USB sığır pankreası, aktivite> 2500 USP birim / mg, son derece saf) eklenmesi ile% 0.25 tripsin solüsyonu hazırlanır.
6. Bu yordamı tamamlamak için gerekli diğer gerekli ekipmanı Stereomikroskopta, Petri yemekler (10 cm), 50 ml konik tüpler, 40-mikron hücre süzgeçler, DPBS artı antibiyotik, 60-mm kültür yemekleri ve 35-mm kültür yemekler bulunmaktadır.

2. Yenidoğan Fare Yavrularının dan Hearts Yalıtımlı

1. İlk olarak, P2 bebek sıçan yavrularına P0 elde edilir (N = 6-8). EYFP alel veya etiketlemek için Z / EG alel: Bu R26R biri için heterozigot erkeklerde ile Dct-CRE homozigot kadın damızlık tarafından oluşturulan yavrular kullanılması tavsiye edilirmelanosit-benzeri hücreler. Hem R26R: EYFP ve Z / EG farenin Jackson Laboratories (stok numaraları sırasıyla 006.148 ve 003.920) mevcuttur.
2. Sonra, yenidoğan fare yavrular euthanize alkollü bir bezle sandıkları silin ve ardından DPBS ile 10 cm Petri kabındaki yavrular yerleştirin.
3. Göğüs üzerindeki deriyi kesin ve sterilize forseps ve makas ile sternum ve sonra steromikroskopla dikkatle kutuyu açın. Yenidoğan fare yavrularının kalpleri ekli kulakçıklardan ile tüm kalp kaldırmak için emin olmak için dikkatli olmak bu yüzden çok küçük.
4. DPBS'de kalpleri yıkayın ve yeni bir 10-cm Petri aktarabilirsiniz.

3. enzimatik sindirme

1. Bir doku kültürü kaputu (biyogüvenlik kabini) için kesilip kalpleri ile Petri çanak getirmek ve daha sonra kaputu steril teknikleri kullanarak aşağıdaki adımları izleyin.
2. İlk olarak, steril DPBS'de artı antibiyotikler kalpler üç kez yıkayın.
3. Bir (n = 6-8) kalpleri yerleştirin60-mm kültür çanak ve çanak% 0.5 tripsin çözeltisi 6-8 ml ekleyin.
4. Daha sonra, (boyut olarak 1-mm 'den az) küçük parçalar halinde kesilmiş ve kalpleri% 5 _CO2 atmosferinde 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe.
5. Kuluçka süresi tamamlandıktan sonra bir steril 50 ml konik tüp içine kardiyak doku ve çanak tripsin edilen dökün.
6. Sonra, çabuk ama yavaşça 10 ml steril pipet kullanarak, 50 ml konik tüp 30-50 kere çözümü çiğnemek.
7. Süzüntüyü toplamak için bir yeni ve temiz bir 50 ml konik tüp üzerine 40 mikron hücre süzgecinden elde edilen solüsyon filtre.
8. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde 240 x g'de 50 ml tüp santrifüj. Sonra, yavaşça süpernatant aspire ve steril DPBS 6-8 ml kalan pelletini. Bu adımı 2 kez daha tekrarlayın. Bu adım atriyal miyositleri ve kardiyak melanosit pelet ama fi aşağı getirmezfibroblastlar yana broblasts daha küçüktür ve süpernatan içinde kalır.

4. Kaplama Kardiyak Melanocyte-benzeri hücreler

1. Dikkatli bir şekilde tahliye ya da yıkama çözeltisi (DPBS) aspire ve MCDB kültür ortamı 6 ml pelet tekrar süspansiyon santrifüje edildikten sonra, üçüncü durulama sonrasında hangi katkı ilave edilmiş.
2. Şimdi, steril bir transfer pipet içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş çözelti yararlanmak ve bir 35 mm tabak hücreleri yer ya da bir 6-yuvalı plakanın bir kuyuda, ve bir 35 mm tabak 3 neonatal fareden izole edilmiş kalp hücreleri havuzda veya iyi.
3. , Bir% 5 _CO2 atmosferinde, gece boyunca 37 ° C'de inkübe yemekler birleşmeyen hücreleri ile birlikte kültür ortamı aspire ardından DPBS ile bir kez durulama plakaları. Sonra plakalar taze medya eklemek ve Ortam 2 günde değiştirin. Hücreleri yetişkin duymak izole ise yenidoğan kalpleri veya embriyonik hücreler izole edilmiş, en fazla 3 hafta boyunca kültür içinde muhafaza edilebilirts en fazla 10 gün boyunca kültür içinde muhafaza edilebilir.

Yetişkin Fare Kalpten 5. Yalıtımlı Kardiyak Melanocyte-benzeri hücreler

1. İlk olarak, olgun farelerin kalpleri çıkarın (3-4 hafta yaşında, n = 3) farelerine, 100 U heparin karın içinden tatbik edilmesini ve daha sonra bunların ötenazi sonra, bir orta hat sternotomi ile. Bu işlem için fareler euthanize pentobarbitaldir kullanılması tavsiye edilir, ancak bu ilaç her yerde mevcut değildir.
2. Sonraki, bir doku kültürü kaputu (biyogüvenlik kabini) antibiyotik içeren steril DPBS'de kesilip kalpleri yıkayın. Onlardan kalan kan kaldırmak ve daha sonra DPBS'de bir kez daha kalpleri durulama kavisli kesme forseps ile hafifçe kalpleri sıkın.
3. Kalplerinden Atriumlarm ve atriyoventriküler halkaya çıkarın (bu yapılar melanosit-benzeri hücreler içeren) ve 35-mm çanak kesilmiş doku örneklerinin yerleştirin.
4. Kavisli makas ve kuvvet kullanarak küçük parçalar halinde kalpleri kestiPS ve daha sonra çanak% 0.5 tripsin çözeltisi 6-8 ml ekleyin. Daha sonra, 45-60 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe yemekler.
5. Şimdi, adımdan sonrasını 3.6 başlayarak yukarıdaki prosedür adımları izleyin.

Sonuçlar

Bu makalede açıklanan protokol daha önce sıçangil kalp, kalp melanosit izole etmek için yayınlanmış bir oranla geliştirilmiş bir tekniktir. Bu prosedür, kardiyak melanosit-benzeri hücreleri etiketlemek için melanin sentezi, enzim spesifik Kre-rekombinaz tarafından tahrik floresan belirteçlerin kullanımına başvurmaktadır. Atriyal miyositlerden kalp melanosit ayırt morfolojik farklılıklar henüz (Şekil 1A) geliştirdik değil çünkü, taze izole edilmiş embriyonik veya neonatal hücreler çalışırken kalp melanos...

Tartışma

Kardiyak melanosit sık atriyal aritmi tetikler doğuran kalp içindeki anatomik yerlerde bulunurlar. Bu bölgeler pulmoner venler, atriyoventriküler halkasını, posterior sol atrium ve foramen ovale (Şekil 4) içerir. Bu hücreler aritmogenez oynadıkları rolü anlamak için, onları tecrit ve fizyolojisini incelemek için teknikler geliştirmek. Ancak, biz bu tekniği geliştirerek kalp melanosit sağlıklı ve daha büyük miktarlarda eksojen uyaranlara kardiyak melanosit yanıtını araştırmak için daha fazla çalışmaları ...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
MCDB 153	Sigma-Aldrich	M7403	Suda çözün
DPBS, kalsiyumsuz, magnezyumsuz	Invitrogen	14190136	Stok kons.: 1x Çalışma kons.: 1x
Penisilin-streptomisin	Invitrogen	15140163	Stok kons.: 100x Çalışma kons.: 1x
Fetal Bovine Serum	Life Technology	Sertifikalı	Çalışma kons.: 4%
TPA	Sigma-Aldrich	P1585	DMSO'da çözün Stok kons.: 3.2 μM Çalışma kons.: 32 nM
Transferrin	Sigma-Aldrich	T8158	DPBS'de çözün Stok kons.: 0.1 mg/ml Çalışma kons.: 1 μg/ml
Dibütiril siklik AMP	Sigma-Aldrich	D0627	DPBS'de çözün Stok kons.: 0.5 mM Çalışma kons.: 5 μM
İnsülin	Sigma-Aldrich	I6634	10 mM asetik asitte çözün Stok kons.: 1 mg/ml Çalışma kons.: 5 μg/ml
Bazik FGF	BD Biosciences	354060	Suda çözün Stok kons.: 4 ng/μl Çalışma kons.: 4 ng/ml