Yöntem makalesi

Diseksiyon, Kültür ve Analizi

13.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4377

⸱

23 Aralık 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, College of William and Mary

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Xenopus laevis hücre kaderinin şartname ve primer hücre kültüründe bireyin retina hücrelerinin fizyolojik fonksiyonu eğitim için ideal bir model sistem sağlar. Burada retina dokuları diseksiyon ve kalsiyum etkinliği için görüntülü ve in situ hibridizasyon ile analiz edilir primer hücre kültürlerinde üretmek için bir yöntem mevcut.

Özet

Nöral plaka ön bölgede gözdeki doğurur hangi süreci klinik ve temel hem de araştırma önemli bir odak noktası olmaya devam ediyor. Retina hastalığı anlaşılması ve tedavi edilmesi için, bariz bir tıbbi uygunluk ilave olarak, omurgalı retina gelişimi nöronal hücre tipi anlaşılmasını kararlılık ve farklılaşması için 1-16 ve önemli bir şık model sistemi olarak hizmet etmektedir. Nöral retinada basmakalıp katmanlar halinde düzenlenmiş altı ayrı hücre tipleri (gangliyon, yatay, amacrine fotoreseptör, bipolar hücreleri ve Müller glial hücreler), büyük ölçüde tüm omurgalıların 12,14-18 arasında korunduğunu bir deseni oluşur.

Sağlam gelişen embriyo retina okuyan açıkça bu kompleks organ katmanlı bir yapıya önbeyin bir çıkıntı gelişir nasıl anlaşılması için gerekli iken, fro yararlanacak pek çok soru varm varsayımsal retina hücrelerinin primer hücre kültürü 7,19-23 kullanarak yaklaşımlarının uygulanması. Örneğin, farklı aşamalarında kaldırılır ve ayrışmış dokulardan hücrelerin analiz biri farklı gelişim aşamalarında tek tek hücrelerin belirlenmesi ve karakterize edilmesi durumu ayırt etmek için izin verir, bu ise, komşu dokulara 8,19-22 ile etkileşimi yokluğunda hücrelerin kaderini ,24-33. Primer hücre kültürü de araştırmacının belirli reaktifleri ile kültür tedavi ve tek hücre düzeyinde 5,8,21,24,27-30,33-39 üzerindeki sonuçlarını analiz etmeyi sağlar. Xenopus laevis, çalışma için klasik bir model sistem erken nöral gelişim 19,27,29,31-32,40-42, retina birincil hücre kültürü 10,38,43-45 için özellikle uygun bir sistem olarak hizmet vermektedir.

Presumptive retina dokusunun hemen nöral indüksiyon 25,38,43 takiben, gelişiminin erken aşamalarında erişilebilir. Buna ek olarak, inci verilmişembriyo her hücre sarısı bir kaynağı da içerir, retina hücreleri tamponlanmış bir tuz çözeltisi, çok basit bir tanımlandığı ortamda kültüre edilebilir, böylece kuluçka veya diğer serum bazlı ürünlerin 10,24,44-45 şaşırtıcı etkileri kaldırma .

Bununla birlikte, çevre dokular ve daha sonraki işleme retina dokusunun izolasyon zordur. Burada da, tek bir hücre çözünürlükte kalsiyum etkinlik ve gen ekspresyonu için analiz edilecek birincil hücre kültürleri hazırlamak için kullanılır Xenopus laevis retina hücreleri disseksiyon ve ayrılma için bir yöntem sunmaktır. Bu yazıda sunulan konuyu kendiliğinden kalsiyum Transientlerin analiz ederken, teknik araştırma soruları ve yaklaşımlar (Şekil 1), geniş bir dizi geniş uygulanabilir.

Protokol

Tüm deneyler William and Mary College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri takip yapılmaktadır. Bu protokolde atıfta Gelişim aşamaları Nieuwkoop ve Faber 46 göredir.

1. Teşrih

  1. Hücre Kültürü Orta ve oda sıcaklığına gelmesini Kalsiyum Magnezyum Ücretsiz Medium (CMF) izin verin. Ayrıca 0,1 X Marc Modifiye Ringer (MMR) pH 7.4-7.6 gerekir.
  2. Bir hücre kültür laminer akış başlık içinde 30 dakika süre ile bir UV ışını uygulanarak aşağıdaki öğeleri sterilize edin. (Davlumbaz yerleştirmeden önce% 70 etanol ile her öğenin püskürtün.)
    • 35 mm plastik Petri kapları.
    • 60 mm plastik Petri kapları.
    • 35 mm Nunclon yüzey yemekleri.
    • 1,5 ml mikrosantrifüj tüpleri.
    • P1000 mikropipet (1.000 ul mikropipet).
    • Aerosol dayanıklı P1000 ipuçları (1.000 ul mikropipet Aerosol dayanıklı ipuçları).
    • Alkoldayanıklı kalem.
    • Forseps diseksiyon Güzel.
    • * 15 ml konik boru (sadece görüntüleme kalsiyum etkinlik için).
    • * Sadece kalsiyum aktivite görüntüleme için.
  3. Kaput UV sterilize ve çözümleri oda sıcaklığına sahip edildikten sonra, kaputun% 70 etanol ve yerde medya şişeleri ile eldiven ve medya şişeleri yıkadığınız, kaputu laminer hava akışı açın.
  4. Kaput içinde uygun etiketleme sağlanması, hücrelerin her bir plaka için P1000 mikropipet ile aşağıdaki hazırlamak.
    • Diseksiyon Levha - Bir 60 mm plastik Petri kabı 10 ml Hücre Kültürü Orta içeren.
    • Kültür Levha - Bir 35 mm Nunclon yüzey çanak 2 ml Hücre Kültürü Orta içeren. (Nunclon plastik tabaklar başka herhangi bir yapıştırıcı ile tedavi edilmez.)
    • Bir boş 1,5 ml mikrosantrifüj tüp-Eksplantasyon Ayrışma Tüp.
    • * Bir adet 15 ml konik şahintüp 15 ml Hücre Kültürü Orta içeren. Aşırı Fluo4-AM görüntüleme kalsiyum aktivitesi zaman dışarı yıkamak için.
  5. Kaput içinde, her diseksiyonu oturum için P1000 mikropipet (birden fazla retinada tek oturumda disseke edilebilir) ile aşağıdaki hazırlamak.
    • 2 ml CMF içeren bir 35 mm plastik Petri kabı - Eksplantasyon Plaka durulayın.
    • Eksplantasyon Disosiyasyon Levha - 2 ml CMF içeren bir 35 mm plastik Petri kabı.
  6. Kaput dışında aşağıdaki hazırlayın:
    • 10 ml 0,1 X MMR içeren hücre plaka başına biri 60 mm plastik Petri kabı - Plaka Holding.
    • 10 ml 0,1 X MMR içeren hücre plaka başına biri 60 mm plastik Petri kabı - Kardeş Plate.
    • Anestezisi Levha - 10 ml 0,1 X MMR + 0.5 mg / ml MS-222 (tricaine) içeren diseksiyon seans başına bir 60 mm plastik Petri kabı.
  7. Eksplantasyon Ayrılma Plakası (% 0.1 tripsin solüsyonu ile sonuçlanan), karıştırmak için girdap CMF 40 ul% 5 tripsin ekleyin ve bir kenara koyun.
  8. Aşamada 30 yaşından küçük bir embriyo diseksiyon varsa, Dissection Levha (bir 1 mg / ml kollajenaz B çözeltisi ile sonuçlanan), çözülür ve kenara girdap 10 mg Kollajenaz B ekleyin.
  9. Istenen aşamada bir embriyo seçin, steril olmayan bir transfer pipet ile Holding Tabak aktarmak ve ince forseps kullanarak vitellin membran (embriyo henüz yumurtadan değil ise) çıkartın.
  10. Transferi birkaç aynı steril olmayan bir transfer pipet ile Kardeş Plate embriyolar sahneledi.
  11. Embriyo 25 veya eski ise, steril olmayan bir transfer pipet ile anestezisi Plate embriyo transferi ve hareket ve uyaranlara yanıt durana kadar embriyo oturmasına izin aksi diseksiyon ile doğrudan devam. Bu sürebilirkadar bir dakika.
  12. Diseksiyon kapsamı (4X objektif, 10X oküler) altında diseksiyon (Şekil 2) ile devam edin.

Embriyo aşaması için 25 veya daha genç:

  1. Steril olmayan bir transfer pipet ile Diseksiyon Plate embriyo transfer.
  2. Ince forseps iki çift kullanarak, posterior ucundan başlayan ve embriyo ön kısmında çimento bezi mecraını, embriyonun ventral tarafında bir midsagittal kesim yapmak.
  3. Kesme ya da kenarından tutup sağ ve sol yayarak embriyo dikkatlice açın. Diseksiyon Tabak içine bakan sırt tarafında bir embriyo ve ventral ektoderm ile bu sonuçlar içinde endoderm ve mezoderm ortaya çıkarmak için açık yayıldı.
  4. Endoderm ve mezoderm (Şekil 2A ve 2B) kaldırarak başlayın. Bu doku ilk ve en büyük tabaka ile görünüş olarak çok "kabarık" olduğubüyük hücreler ve az belirgin organizasyonu.
  5. Bu katman çıkardıktan sonra, Somitlerin ve Notokordun görünür hale gelecektir. Daha iyi kontrast için, 10 ml Hücre Kültürü Orta ve Diseksiyon Plaka geri aktarmadan önce 2-3 dakika süreyle Nil Mavi Sülfat 1% çözelti 100 ul (suda) içeren ayrı bir 60 mm plastik Petri kabı embriyo taşıyın. Bu kolay tanımlama ve yönlendirme için ektoderm, Somitlerin ve Notokordun leke olacaktır.
  6. Embriyonun ön kısmı üzerinde yoğunlaşırken, dikkatle Notokordun ve beyin ve optik veziküller (Şekil 2C) maruz kalan mezoderm çıkarın.
  7. Beyin ve optik veziküller tamamen maruz sonra, beynin sadece posterior nöral tüp ve altta yatan ektoderm sever forseps kullanın.
  8. Ektoderm üstüne o kadar fazla bu kısmı (beyin ve optik veziküller) çevirin.
  9. Dikkatli, temel optik veziküller zarar vermemeye özen yeniden alınması(Şekil 2B) ektoderm taşıyın.
  10. Nihayet, forseps kullanarak, beyin (Şekil 2D ve 2E) gelen optik veziküller ayırın.

: Sahne 25 fazla embriyo yaşlı için

  1. Embriyo anestezisi Levha iken, forseps ile embriyonun ventral kısmı çıkarın.
  2. Daha iyi kontrast için, 10 ml 0,1 X MMR ve Diseksiyon Plaka aktarmadan önce 2-3 dakika süreyle% 1 Nile Blue Sülfat 100 ul içeren bir 60 mm plastik Petri kabı embriyo taşıyın. Bu ektoderm mavi leke olacaktır.
  3. Bir kez Diseksiyon Plate, retina (veya embriyo aşaması 26-30 için optik vezikül) (Şekil 2F ve 2G) örten ektoderm geri çekin. Nile Blue Sülfat kullanılmışsa, ektoderm mavi lekeli ama altında yatan retina dokusunun olmaz edilecektir.
  4. Fo ile dikkatlice retina veya optik vezikül kaldırrceps (Şekil 2H, 2I ve 2J). Bu forseps bir çift ile yerine embriyo tutun ve retina veya diğer optik vezikül kaldırmak için yardımcı olur.

2. Doku ve Hücre Kaplama Ayrışma

Önemli Not - dokuları aktarırken, retina veya optik vezikül herhangi bir hava-sıvı sınırları temas etmesine izin vermez; bu oluşursa olmuş akyuvarlar olacaktır.

  1. Optik vezikül veya retina diseke edildikten sonra, dikkatle Aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak p100 mikropipet ile Tabak durulayın ve 30 sn için oturup izin Eksplantasyon aktarmak.
  2. Eksplantasyon Disosiyasyon Tube Eksplantasyon Ayrılma Levhadan CMF% 0.1 tripsin 80 ul aktarın.
  3. Bir p100 mikropipet ve aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak, Eksplantasyon gelen retina veya optik vezikül aktarmak Eksplantasyon Dissociati için Plaka durulayınTube, eksplant transferi kaçınarak çözüm durulayın.
  4. Doku, oda sıcaklığında 1 saat boyunca Eksplant ayrışma Tüp içinde ayrıştırmak için izin verin. Bir retina plaka başına kullanıldı, ancak bunun çok plaka başına hücrelerin sayısını arttırmak için arzu edilirse, birden fazla levha başına kullanmak mümkün olduğunu not edin.
  5. Plaka hücreleri için, önce yavaş yavaş Eksplantasyon Ayrılma tüp solüsyon 40 ul kaldırmak ve p100 mikropipet ve aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak atın. Bir p100 set 40 ul ve aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak, Kültür Plate hücreleri (şimdi doku ayrışmış olduğunu) aktarın. Plaka üzerine hücreleri aspire zaman, yavaş yavaş, pipet ve plaka merkezinde, küçük bir alanda hücreler tutun.

Not: hücrelerinin birden fazla görüntü deney boyunca alınacak ise, Kültür Plate alt etmek için bir ızgara (Cellattice) ekleyin . Bu aynı yönlerde aynı hücrelerin görüntüleri prosedürü farklı noktalarda alınması gereken izin verecektir.

  1. Hücreler Nunclon plaka uymak için en az 1 saat süreyle rahatsız edilmeden bekletin. Bu süreden sonra, onlar çok nazikçe tedavi edilmelidir veya müstakil hale gelebilir.
  2. Hücreleri gibi, aynı sıcaklıkta yetiştirilir kardeş embriyolar izlenerek istenen aşamada Kültür hücreleri. Canlı hücreler ileri işleme için kullanılan değilseniz, onlar şu anda MEMFA solüsyonu ile tesbit edilebilir.

Önemli Not: Bizim deneylerin çoğu hücreleri kaplama 6 saat içinde sabittir. Kültür hücrelerin ömrü doku ayrılmakta aşamayı ve hücreler hala mevcut olan yumurta sarısı miktarına bağlıdır; hücrelerinden elde ederken küçük (neurula aşamaları) dan parçalanmış hücreler 5-6 gün boyunca kültür içinde sağlıklı kalır Büyük embriyolar (iribaş yüzme) aşamaları 2-3 gün kültüründe canlı kalacaktır.

3. Kalsiyum Görüntüleme 47-49

Bu protokol kalsiyum duyarlı bireysel hücrelerin kalsiyum geçici ölçmek Fluo4-AM ve konfokal mikroskopi kullanır. Fluo4-AM kullanan tüm adımlar Fluo4-AM, ışığa duyarlı olduğu için, ışıktan uzakta yapılmalıdır. Tüm yıkar eklenen veya P1000 mikropipet ve aerosol dayanıklı ipuçlarını kullanarak çıkarılmalıdır. Pipetleme yavaş yavaş ve hücreler rahatsız etmemek için levha kenarına doğru yapılması gerekir. Kültürler genellikle disseke 6 saat içinde sabit olduğundan Medya değiştirilmez. Daha uzun süreli kültürler için, her gün ortam değiştirilmesi gerekir.

  1. Fluo4-AM -20 ° C'de saklanır ve biz 5 ul alikotları saklamak öneririz. Kullanmadan önce, ışıktan uzak Fluo4-AM bir 5 ul kısım Çözülme ve doğrudan bu kısım için Pluronic F-127 2 ul ekleyin.
  2. Zaman, istenen miktarda için kültür sonrası hücreler (en azından1 saat), kültür plakasına hücre kültürü aracı maddesi 1 ml çıkarın. Nazik pipetleme tarafından karıştırılması, Fluo4-AM ve Pluronic Bu ekle.
  3. Yavaş yavaş görüntülenmek üzere hücrelerin kültür plakasının kenar geri Bu çözeltinin her aktarmak ve Fluo4-AM, emme ile 1 saat boyunca rahatsız edilmeden bu çözelti içinde hücreler bırakın.
  4. Yıkamak için hücre kültür ortamından Fluo4-AM fazlalığı, aşağıdaki yıkama serisi tamamlayın:
    • Plaka ortam 1 ml çıkarın.
    • Plaka taze hücre kültür ortamı, 3 ml (15 ml konik borudan) ekleyin.
    • İki ek yıkama sıvıları, her zaman yavaş yavaş plaka çözeltisi, 3 ml taze çıkarılması ve hücre kültür ortamı, 3 ml ekleme yapın.
  5. Hücreler hemen hücre kültür aracı maddesi içinde 4 ml olmak ve Fluo4-AM içermelidir. Fluo4-AM, enzimatik olarak hücre difüzyon üzerinden ya da herhangi bir membrana bağlı bölme içine önlenmesi, hücre içinde bir kere kesildi.
  6. Kültür karışmasını işaretleyici partikülleri önlemek için kapağı tutarken görüntüleme için konfokal mikroskop sahneye plaka yüklemeden önce, yemeğin üzerine kalıcı bir kalem ile bir kırmızı dikey çizgi çizin. Dikey çizgi Petri kabı (Petri kabı değil, kapağın taban) bir tarafı aşağı çekilir. Bunun amacı, tek tek hücrelerin kesin oryantasyon ve hizalama sonraki bir noktada yeniden oluşturulmasını sağlar, öyle ki, görüş alanı ile ilgili olarak kültür plakasının yönünü göstermek içindir.
  7. Plaka hemen görüntüleme için eş odaklı mikroskop aşamasında üzerine yüklenmesi için hazır hale gelir. Konfokal mikroskop (objektif 20X) tarama bir lazer üzerinde parlak bir alan ayarları kullanarak hücrelerin gözünüzde canlandırın. Daha sonra daha kolay görüş aynı alanda bulma yapmak Cellatice lamel büyük ızgara numaralarını içeren bir görüş alanı ile, tercihen kümeleri içermiyor yoğun hücrelerin bir alan bulun yaparken si sonra görüntüleme kültürütu hibridizasyon. Görüntüleme öncesinde, kültür aracılığıyla aşağı odaklanmak ve hücre kültürü yerini ve yönünü kaydetmek için hücrelerin altındaki grid parlak bir alan görüntü çekmek. Bu, daha sonraki analiz için hücrelerin yeniden düzenlenmesi için olanak sağlar.
  8. Odak düzlemi kaldırın ve başlangıç ​​kalsiyum görüntüleme (Şekil 3A) öncesinde hücrelerin parlak bir alan görüntü yakalayabilir.
  9. Hücrelerin orta odak düzleminde sonra, plaka kalsiyum etkinlik görüntülenmesi için hazır hale gelir. Ayarlar mikroskop ve uygulamaya bağlı olarak değişecektir. Bu görüntü, aşağıdaki parametreler ile, 1, 2, ya da 12 saat boyunca bir argon 488 nm lazer kullanarak hücreleri:
    • 1 saat görüntüler:
      • Argon 488 nm lazer maksimum 30 mW güç% 4 tarar.
      • Her 4 sn (saat başına 900 taramalar) kez tarayın.
    • 2 saat görüntüler:
      • Argon 488 nm lazer maksimum 30 mW güç% 4 tarar.
      • Her kez tarayın8 sn (saat başına 450 taramalar).
    • 12 saat görüntüler:
      • Argon 488 nm lazer maksimum 30 mW güç% 2 tarar.
      • Her 48 sn (saat başına 75 taramalar) kez tarayın.

Bu parametreler, her bir zaman dilimi için 900 hareketsiz çerçeve görüntüleri bir dizi neden olur. Kalsiyum aktivite sonra bu ImageJ 50 gibi bir görüntü işleme uygulaması kullanımı ile zaman ders görüntüleri (Şekil 3B) üzerinde floresans düzeyleri analiz tarafından kaydedilebilir.

4. Hücreleri Tespit

  1. Görüntüleme takiben, hücreler plaka çözelti 3 ml kaldırma ve kültür ortamının kalan 1 ml 1 ml 2X MEMFA ekleyerek 30 dakika boyunca sabit olabilir.
  2. Tespit edildikten sonra, MEMFA kaldırmak ve 5 dk yıkama, her biri 1 ml'lik bir hacim, bir dizi olan hücreler kurutmak:
    • 1X fosfat-tamponlu salin (PBS) içinde% 25 etanol.
    • 1X PBS içinde% 50 etanol.
      • 2 O (steril deiyonize saf su) li>% 75 etanol.
    • -20 ° C'de 1 ml% 100 etanol ve plaka deposu ile son yıkama yerine

Not: Metanol ayrıca, bu yıkama için ve depolama için de kullanılabilir.

5. Floresan in situ Hibridizasyon (FISH)

Anderson Lab 52 tarafından özetlendiği gibi hücre kültürü için modifikasyonlar ile 51 tarif Kültürleri Xenopus için standart FISH protokolü kullanılarak test edilebilir. Anderson Lab protokolü Değişiklikler aşağıda listelenmiştir. Aksi belirtilmediği sürece tüm yıkar, yaklaşık 1 ml hacminde 35 mm Nunclon plakalar üzerinde gerçekleştirilmiştir. Solutions olarak Sive et al tanımlandığı gibidir. 53 aksi belirtilmediği sürece.

Önemli Not: için görüntülü hücreleri üzerinde in situ hibridizasyon yaparken floresein etiketli RNA problar kullanmayınkalsiyum aktivite. Anti-floresein antikorları rezidüel hücreleri Fluo4-AM ve kültürün tüm hücrelerde pozitif sinyal neden olabilir bağlanacaktır.

1. Gün: permeabilization ve Hibritleşme

  1. Rehidrasyon yıkama depolama için kullanılan susuz çözücü ile derecelendirildi olmalıdır. Bizim deneyler için, yıkar 1X PBS içinde etanol kadar derecelendirildi.
  2. Rehidrasyondan sonra, oda sıcaklığında 5 dakika için her bir 1X PBS içinde hücreler üç ilave kez yıkayın.
  3. Falcon bir tüp içinde asetik anhidrit ile 62.5 ul 0.1 M trietanolamin (pH 8.0), 25 ml iyice karıştırılır ve Anderson, Lab 52 protokolü olarak ele dağılana kadar hızlı bir şekilde karıştırılır. Oda sıcaklığında 10 dakika için bu karışım içinde kültür inkübe edin. Asetik anhidrid tedaviden sonra, oda sıcaklığında 5 dakika için 1X tuzlu sodyum sitrat (SSC) içinde hücreleri yıkayın.
  4. Son SSC yıkama çıkarın ve hücrelerin geçirgenliği 10 dakika için 0.2 M HCl (sdd H 2 O) ile değiştirin.
  5. 5 dk için 1X PBS içinde iki yıkar ile HCl yıkayın.
  6. 6 saat 60 ° arasında, en az bir çalkalamalı su banyosu içinde C'de ISH tampon içinde Prehybridize, ancak bu ciddi bir şekilde işaret azaldıkça bir gecede prehybridize değildir.
  7. Seyreltilmiş prob 750 ul (saflaştırılmış probundan 1:250 dilüsyon) 8-14 saat boyunca 60 ° C sıcaklıkta gecede melezleşme. 1.0-1.5 gelen prob konsantrasyon aralıkları saflaştırılmış mikrogram / ul.

2. Gün: İlişkisiz Probe ve Antikor Kuluçka giderimi

  1. Sonda çıkarın ve 60 0,2 X SSC içinde 5 dakika için kültür durulama ° C. 60 ° C'de 1 saat boyunca taze 0,2 X SSC içinde yıkayın
  2. Su banyosundan kültürleri çıkarın ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığına gelmesine izin verir.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 0,2 X SSC ile yıkayınız.
  4. % 0.1 Triton-X-100 (PBT) ile 1X PBS içinde 15 dakika süreyle yıkanır.
  5. Endojen peroksidaz inaktive için, PBT% 2 H 2 O 2 çözelti içinde 1 saat süreyle yıkayın.
  6. 1X Tris 15 dk yıkama ile durulayın% 0.1 Tween 20 (TBST) ile Tamponlu Salin.
  7. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca Maleik asit tampon (MAB) içinde% 2 engelleme Reaktif olarak engelleme. Bu engelleme yönteminde, PBT% 20 koyun serum içinde bloke önceki yöntemlere göre hassasiyeti artar olduğunu bulduk.
  8. 4 ° C'de gece boyunca bir POD-konjuge antikoru içeren bir 1:1,000 seyreltme MAB içinde% 2 engelleme Reaktif 1 ml kültürler inkübe

3. Gün: İlişkisiz Antikor çıkarılması ve Floresans Geliştirme

  1. Antikor çözeltisi çıkarın ve oda sıcaklığında 5 dakika için TBST içinde 3 kez yıkayın.
  2. Sürekli olarak yavaş bir hızda sallanan ise, oda sıcaklığında 15 dakika süreyle TBST içinde 4 kez yıkayın.
  3. 10 dk için oda sıcaklığında PBT içinde iki kere yıkayın.
  4. PBT içinde seyreltilmiş 1:200 floresein-tyramide veya 01:25 Cy3 tyramide 750 ul uygulayın. Oda sıcaklığında 5 dakika için inkübe edin ve 2.5 ul% 0,3 'H 2 eklemek O 2. Sinyal geliştirmeye olanak 40 dk için sallayın.
  5. Sallama ile oda sıcaklığında TBST içinde 15 dakika her biri için en az 4 kez yıkayın.
  6. Sinyal tam gelişmiş bir kez, 1X PBT 5 dakika yıkayın.
  7. 4 ° C'de 1 saat oda sıcaklığında ve 1X PBS içinde depolamak için 1X MEMFA olarak saptamak

6. Görüntü BALIK Sonuçlar ve Co-kayıt Kalsiyum Görüntüleme Veriler

  1. BALIK tamamlanmasından sonra, hücre kültür plakaları hangi hücrelerin belirli bir prob için pozitif bir floresan sinyalinin gösterime belirlemek için görüntülü. Kalsiyum görüntüleme sırasında çalışılan görüş kesin bir görüş alanı bulmak ve kalsiyum görüntü kareleri yönüne plaka hizalamak için Cellattice lamel kullanın.
  2. Hücrelerin merkezinde düzlemine Odak ve maksimum 1 mW güç (Şekil 3C) 15% az Helyum-Neon HeNe 543 nm lazer kullanarak tek bir yüksek çözünürlüklü görüntü almak.
  3. Kalsiyum Görüntüleme protokolü alınan görüntülerin belirlenen orijinal 900 çerçevesinde,bir görüntü işleme programı (örneğin ImageJ 50 gibi) kullanımı yoluyla ilgi bölgeleri olarak tek tek hücrelerin (ROI) belirlemek. Zaman floresans çifti değerleri (Şekil 4) temsil eden veri noktaları kümesi olarak ROI floresans verileri ayıklayın.
  4. Kalsiyum görüntüleri (Şekil 3D) tespit ROI'ler ile FISH sonuçlarına görüntü bindirmesi.
  5. Prob için negatif, prob için pozitif ya da bilinmeyen bir şekilde her bir ilgi kayıt - YG karşılık gelen hücre artık FISH görüntünün görüş alanı içinde bulunabilir olması durumunda.
  6. Farklı disseke aşamaları (Şekil 5A ve 5C) veya farklı FISH probları (Şekil 5B ve 5D) için pozitif hücreler arasındaki kalsiyum aktivite seviyelerini karşılaştırmak için istatistiksel analiz komut (olarak MATLAB veya başka programlama dili ile tasarlanmış) kullanarak Süreci ROI floresans verileri. Bizim Laboratuarda kullanılan bütün betikler istek üzerine serbestçe kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Başarılı bir şekilde parçalanmış, optik vezikülleri (aşama 25) ve retinae (aşama 35) örnekleri Şekiller 2E ve 2J gösterilmiştir. Bu protokol geliştirme çeşitli aşamalarında kullanılabilir olsa da, daha fazla deneyler için doğruluğunu sağlamak için sadece retina dokusunun elde etmek önemlidir. Dikkatle tüm aşamalarında epidermisin kaldırmak ve forseps retina dokusunun ponksiyon olmamasını sağlamak. Aşama 35 veya daha büyük ise, mercek retina üzerinde bir katman açık olarak görülebilir ve forseps kullanıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tüm omurgalılar arasında muhafaza edilir, iyi karakterize hücre tipleri ile, retinanın hücre tipi özellikleri ve farklılaşma yöneten molekül hücresel süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlamaktadır. Birincil hücre kültürü ve gen ekspresyonu, protein dinamiği, ve kalsiyum ve tek bir hücre çözünürlük düzeyde elektrik etkinlik içeren işlemler çok çeşitli araştırma için güçlü bir yöntem tanıyor. Burada varsayımsal Retina gelişimi ve primer hücre kültürü çok erken aşamalarında kolayca ulaşılabilir olduğunu Xenop...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Biz nezaketle betikleri için Dr John Hayes ederim; Dr. Eric Bradley ve konfokal mikroskopi için yardım Christopher Del Negro, Drew Hughes, proje geliştirme ve ön veriler sağlayan çalışmaları için Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, ve Liz MacMurray; istatistiksel analize yararlı önerileri için Dr Greg Smith. Bu çalışma MSS bir NIH hibe (NINDS IR15N5067566-01) ve William and Mary College Howard Hughes Tıp Enstitüsü Fen Bilgisi Eğitimi Hibe tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası
Diseksiyonlarında ve Kültürleme için
BD Falcon Kolay Tutuş Doku Kültürü Yemekleri, 35 mm Balıkçı 08-772A
Tek Polistiren Petri Yemekleri, 60 x 15 mm Balıkçı 0875713A
35 mm Nunclon Yüzey Petri kaplar (Airvent ile) Balıkçı 12-565-91
Dumont Güzel Forseps (Dumostar # 55) Balıkçı NC9341917
Cellattice Mikro-yönetilen plastik lamel, 25 mm Balıkçı 50-313-17
Etil-m-aminobenzoat metansülfonat Tuz (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamisin Sülfat Enzo Yaşam Bilimleri 380-003-G025
Gibco Tripsin (1:250) Toz Yaşam Teknolojileri 27250-018
Clostridium histolyticum gelen Kollajenaz B Roche 11088831001
Penisilin-Streptomisin Gibco 15140-122
Nile Blue Sülfat (isteğe bağlı) Pfaltz & Bauer N05550
500 ml Vakum Filtre / Depolama Şişe Sistemi, 0.22 mikron gözenek 33.2 cm 2 CN Membran Corning 430758
Kalsiyum For Imaging
Fluo-4 DMSO içinde 1 mM Çözüm, Daimi Hücre AM Yaşam Teknolojileri F-14217
Su Pluronic F-127% 10 Çözüm Yaşam Teknolojileri P-6866
LSM 510 Konfokal Mikroskop Sistemi Zeiss Model Üretilmeyen
Reaktif Engelleme Roche 11096176001
In situ hibridizasyon Floresan (FISH) için
Anti-digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP antikor Perkin-Elmer NEL747A
Cy3NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Floresein Thermo Scientific 46409
Formamid, Deiyonize Amresco 0606-950ML
Torula RNA, tip IX Sigma-Aldrich R3629
Domuz intestinal mukozadan Heparin Sodyum Tuz, Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Tablo 2. Özel reaktifleri ve ekipmanlar.

Çözüm Referans Içindekiler
Hücre Kültürü Orta Chang ve Spitzer, 2009 54 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
% 1 (v: v) Penisilin / Streptomisin
HCl ile 7.8 pH ayarlayın.
0.22 mikron CN filtre geçerek sterilize filtreleyin.
4 ° C'de depolayın
Kalsiyum-Magnezyum Ücretsiz Medium (CMF) Gu et al, 1994 42;. Gu ve Spitzer, 1995 55 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
% 1 (v: v) Penisilin / Streptomisin
HCl ile 7.8 pH ayarlayın.
0.22 mikron CN filtre geçerek sterilize filtreleyin.
4 ° C'de depolayın
Maleik Asit Tampon (MAB) Sive ve ark., 2000 53 100 mM maleik asit
150 mM NaCl (pH 7.5).
10X Marc Modifiye Ringers (MMR), Sive ve ark., 2000 53 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH NaOH ile 7.4 'e ayarlandı
0,1 X MMR da 50 mg / ml gentamisin sülfat ve pH, NaOH ile 7.4 'e ayarlanır içerir.
MEMFA Çözüm, 10X Sive ve ark., 2000 53 0.1 M MOPS (pH 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
% 3,7 formaldehit
10X bir çözelti, formaldehit olmaksızın, 4 ° C'de saklanabilir Formaldehit (% 37, standart bir stok, 1/10 hacim), taze ilave edilir.
In situ Hibridizasyon Tamponu In SivE ve diğ., 2000 53 50% Formamid
5X SSC
1 mg / ml Torula RNA
100 mg / ml heparin
1X Denhart Çözümü
% 0.1 Tween 20
% 0.1 CHAPS
10 mM EDTA.

Penisilin ve streptomisin bizim kültür ortamı olarak kullanılabilir yaparken çözümler. * Gentamisin, bir antibiyotik, bizim MMR çözüm olarak kullanılır.

Kaynaklar

  1. Horder, T. J., Spitzer, J. L. Absence of cell mobility across the retina in Xenopus laevis embryos. J. Physiol. 233, 33p-34p (1973).
  2. Hollyfield, J. G., Rayborn, M. E., Sarthy, P. V., Lam, D. M. The emergence, localization and maturation of neurotransmitter systems during development of the retina in Xenopus laevis. I. Gamma aminobutyric acid. J. Comp. Neurol. 188, 587-598 (1979).
  3. Hamm, H. E., Menaker, M. Retinal rhythms in chicks: circadian variation in melantonin and serotonin N-acetyltransferase activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77, 4998-5002 (1980).
  4. Szaro, B., Ide, C., Kaye, C., Tompkins, R. Regulation in the neural plate of Xenopus laevis demonstrated by genetic markers. J. Exp. Zool. 234, 117-129 (1985).
  5. Holliday, J., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium influx and its roles in differentiation of spinal neurons in culture. Dev. Biol. 141, 13-23 (1990).
  6. Marsh-Armstrong, N., McCaffery, P., Gilbert, W., Dowling, J. E., Drager, U. C. Retinoic acid is necessary for development of the ventral retina in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 7286-7290 (1994).
  7. Feller, M. B. The role of nAChR-mediated spontaneous retinal activity in visual system development. J. Neurobiol. 53, 556-567 (2002).
  8. Wang, S. W., Mu, X., Bowers, W. J., Klein, W. H. Retinal ganglion cell differentiation in cultured mouse retinal explants. Methods. 28, 448-456 (2002).
  9. Perkins, B. D., Nicholas, C. S., Baye, L. M., Link, B. A., Dowling, J. E. dazed gene is necessary for late cell type development and retinal cell maintenance in the zebrafish retina. Dev. Dyn. 233, 680-694 (2005).
  10. Zaghloul, N. A., Moody, S. A. Changes in Rx1 and Pax6 activity at eye field stages differentially alter the production of amacrine neurotransmitter subtypes in Xenopus. Mol. Vis. 13, 86-95 (2007).
  11. Wang, C. T., et al. GABA(A) receptor-mediated signaling alters the structure of spontaneous activity in the developing retina. J. Neurosci. 27, 9130-9140 (2007).
  12. Dullin, J. P., et al. Ptf1a triggers GABAergic neuronal cell fates in the retina. BMC Dev. Biol. 7, 110(2007).
  13. Martins, R. A., Pearson, R. A. Control of cell proliferation by neurotransmitters in the developing vertebrate retina. Brain Res. 1192, 37-60 (2008).
  14. Sanes, J. R., Zipursky, S. L. Design principles of insect and vertebrate visual systems. Neuron. 66, 15-36 (2010).
  15. Graw, J. Eye development. Curr. Top Dev. Biol. 90, 343-386 (2010).
  16. Feller, M. B., Sun, Y. H. Introduction to special issue on retinal development. Dev. Neurobiol. 71, 1131-1132 (2011).
  17. Borodinsky, L. N., et al. Activity-dependent homeostatic specification of transmitter expression in embryonic neurons. Nature. 429, 523-530 (2004).
  18. Blankenship, A. G., Feller, M. B. Mechanisms underlying spontaneous patterned activity in developing neural circuits. Nat. Rev. Neurosci. 11, 18-29 (2010).
  19. Evers, J., et al. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: analysis of early synaptic currents. J. Neurosci. 9, 1523-1539 (1989).
  20. Spitzer, N. C., Gu, X. Purposeful patterns of spontaneous calcium transients in embryonic spinal neurons. Semin. Cell Dev. Biol. 8, 13-19 (1997).
  21. Dyer, M. A., Cepko, C. L. p57(Kip2) regulates progenitor cell proliferation and amacrine interneuron development in the mouse retina. Development. 127, 3593-3605 (2000).
  22. Harris, R. E., Coulombe, M. G., Feller, M. B. Dissociated retinal neurons form periodically active synaptic circuits. J. Neurophysiol. 88, 188-195 (2002).
  23. Feller, M. B. Retinal waves drive calcium transients in undifferentiated retinal cells. Focus on "spontaneous waves in the ventricular zone of developing mammalian retina". J Neurophysiol. 91, 1940(2004).
  24. Spitzer, N. C., Lamborghini, J. E. The development of the action potential mechanism of amphibian neurons isolated in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 73, 1641-1645 (1976).
  25. Grant, P., Rubin, E., Cima, C. Ontogeny of the retina and optic nerve in Xenopus laevis. I. Stages in the early development of the retina. J. Comp. Neurol. 189, 593-613 (1980).
  26. Harris, W. A., Holt, C. E., Smith, T. A., Gallenson, N. Growth cones of developing retinal cells in vivo, on culture surfaces, and in collagen matrices. J. Neurosci. Res. 13, 101-122 (1985).
  27. Tabti, N., Poo, M. M. Study on the induction of spontaneous transmitter release at early nerve-muscle contacts in Xenopus cultures. Neurosci. Lett. 173, 21-26 (1994).
  28. Lin, W., Szaro, B. G. Neurofilaments help maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cord neurons. J. Neurosci. 15, 8331-8344 (1995).
  29. Rettig, J., et al. Alteration of Ca2+ dependence of neurotransmitter release by disruption of Ca2+ channel/syntaxin interaction. J. Neurosci. 17, 6647-6656 (1997).
  30. Firth, S. I., Feller, M. B. Dissociated GABAergic retinal interneurons exhibit spontaneous increases in intracellular calcium. Vis. Neurosci. 23, 807-814 (2006).
  31. Root, C. M., Velazquez-Ulloa, N. A., Monsalve, G. C., Minakova, E., Spitzer, N. C. Embryonically expressed GABA and glutamate drive electrical activity regulating neurotransmitter specification. J. Neurosci. 28, 4777-4784 (2008).
  32. Xiao, Q., Xu, L., Spitzer, N. C. Target-dependent regulation of neurotransmitter specification and embryonic neuronal calcium spike activity. J. Neurosci. 30, 5792-5801 (2010).
  33. Nicol, X., Hong, K. P., Spitzer, N. C. Spatial and temporal second messenger codes for growth cone turning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13776-13781 (2011).
  34. Bixby, J. L., Spitzer, N. C. The appearance and development of neurotransmitter sensitivity in Xenopus embryonic spinal neurones in vitro. J. Physiol. 353, 143-155 (1984).
  35. Hightower, L. E., Renfro, J. L. Recent applications of fish cell culture to biomedical research. J. Exp. Zool. 248, 290-302 (1988).
  36. Meyer-Franke, A., Kaplan, M. R., Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Characterization of the signaling interactions that promote the survival and growth of developing retinal ganglion cells in culture. Neuron. 15, 805-819 (1995).
  37. Feller, M. B., Delaney, K. R., Tank, D. W. Presynaptic calcium dynamics at the frog retinotectal synapse. J. Neurophysiol. 76, 381-400 (1996).
  38. Green, C. B., Liang, M. Y., Steenhard, B. M., Besharse, J. C. Ontogeny of circadian and light regulation of melatonin release in Xenopus laevis embryos. Brain Res. Dev. Brain Res. 117, 109-116 (1999).
  39. Jadhav, A. P., Mason, H. A., Cepko, C. L. Notch 1 inhibits photoreceptor production in the developing mammalian retina. Development. 133, 913-923 (2006).
  40. Sakaguchi, D. S., Murphey, R. K., Hunt, R. K., Tompkins, R. The development of retinal ganglion cells in a tetraploid strain of Xenopus laevis: a morphological study utilizing intracellular dye injection. J. Comp. Neurol. 224, 231-251 (1984).
  41. Hartenstein, V. Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord. Neuron. 3, 399-411 (1989).
  42. Gu, X., Olson, E. C., Spitzer, N. C. Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during early differentiation. J. Neurosci. 14, 6325-6335 (1994).
  43. Charnas, L. R., Szaro, B. G., Gainer, H. Identification and developmental expression of a novel low molecular weight neuronal intermediate filament protein expressed in Xenopus laevis. J. Neurosci. 12, 3010-3024 (1992).
  44. Gomez, T. M., Harrigan, D., Henley, J., Robles, E. Working with Xenopus spinal neurons in live cell culture. Methods Cell Biol. 71, 129-156 (2003).
  45. Lewis, B. B., et al. Cloning and characterization of voltage-gated calcium channel alpha1 subunits in Xenopus laevis during development. Dev. Dyn. 238, 2891-2902 (2009).
  46. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. The stages of Xenopus embryonic development. Normal Table of Xenopus laevis. , North Holland Publishing Company. (1994).
  47. Foldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview. Int. Immunopharmacol. 3, 1715-1729 (2003).
  48. Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy. J. Microsc. 228, 390-405 (2007).
  49. Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14, Unit 14 11(2008).
  50. Abaramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
  51. Davidson, L. A., Keller, R. E. Neural tube closure in Xenopus laevis involves medial migration, directed protrusive activity, cell intercalation and convergent extension. Development. 126, 4547-4556 (1999).
  52. In Situ Hybridization Protocols [Internet]. , Available from: http://wmc.rodentia.com/docs/Big_In_Situ.html (1995).
  53. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  54. Chang, L. W., Spitzer, N. C. Spontaneous calcium spike activity in embryonic spinal neurons is regulated by developmental expression of the Na+, K+-ATPase beta3 subunit. J. Neurosci. 29, 7877-7885 (2009).
  55. Gu, X., Spitzer, N. C. Distinct aspects of neuronal differentiation encoded by frequency of spontaneous Ca2+ transients. Nature. 375, 784-787 (1995).
  56. Rosenberg, S. S., Spitzer, N. C. Calcium signaling in neuronal development. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, a004259(2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Xenopus Retinal DokusuRetinal DiseksiyonRetinal H cre K lt rKalsiyum G r nt lemeKonfokal MikroskopiDoku DisosyasyonuPrimer H cre K lt rEmbriyonik Geli imN robiyoloji Y ntemleriH cre Analizi

İlgili makaleler