Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

Özet

Xenopus laevis hücre kaderinin şartname ve primer hücre kültüründe bireyin retina hücrelerinin fizyolojik fonksiyonu eğitim için ideal bir model sistem sağlar. Burada retina dokuları diseksiyon ve kalsiyum etkinliği için görüntülü ve in situ hibridizasyon ile analiz edilir primer hücre kültürlerinde üretmek için bir yöntem mevcut.

Özet

Nöral plaka ön bölgede gözdeki doğurur hangi süreci klinik ve temel hem de araştırma önemli bir odak noktası olmaya devam ediyor. Retina hastalığı anlaşılması ve tedavi edilmesi için, bariz bir tıbbi uygunluk ilave olarak, omurgalı retina gelişimi nöronal hücre tipi anlaşılmasını kararlılık ve farklılaşması için ^1-16 ve önemli bir şık model sistemi olarak hizmet etmektedir. Nöral retinada basmakalıp katmanlar halinde düzenlenmiş altı ayrı hücre tipleri (gangliyon, yatay, amacrine fotoreseptör, bipolar hücreleri ve Müller glial hücreler), büyük ölçüde tüm omurgalıların ^12,14-18 arasında korunduğunu bir deseni oluşur.

Sağlam gelişen embriyo retina okuyan açıkça bu kompleks organ katmanlı bir yapıya önbeyin bir çıkıntı gelişir nasıl anlaşılması için gerekli iken, fro yararlanacak pek çok soru varm varsayımsal retina hücrelerinin primer hücre kültürü ^7,19-23 kullanarak yaklaşımlarının uygulanması. Örneğin, farklı aşamalarında kaldırılır ve ayrışmış dokulardan hücrelerin analiz biri farklı gelişim aşamalarında tek tek hücrelerin belirlenmesi ve karakterize edilmesi durumu ayırt etmek için izin verir, bu ise, komşu dokulara ^8,19-22 ile etkileşimi yokluğunda hücrelerin kaderini ^,24-33. Primer hücre kültürü de araştırmacının belirli reaktifleri ile kültür tedavi ve tek hücre düzeyinde ^{5,8,21,24,27-30,33-39} üzerindeki sonuçlarını analiz etmeyi sağlar. Xenopus laevis, çalışma için klasik bir model sistem erken nöral gelişim ^{19,27,29,31-32,40-42,} retina birincil hücre kültürü ^10,38,43-45 için özellikle uygun bir sistem olarak hizmet vermektedir.

Presumptive retina dokusunun hemen nöral indüksiyon ^25,38,43 takiben, gelişiminin erken aşamalarında erişilebilir. Buna ek olarak, inci verilmişembriyo her hücre sarısı bir kaynağı da içerir, retina hücreleri tamponlanmış bir tuz çözeltisi, çok basit bir tanımlandığı ortamda kültüre edilebilir, böylece kuluçka veya diğer serum bazlı ürünlerin ^10,24,44-45 şaşırtıcı etkileri kaldırma .

Bununla birlikte, çevre dokular ve daha sonraki işleme retina dokusunun izolasyon zordur. Burada da, tek bir hücre çözünürlükte kalsiyum etkinlik ve gen ekspresyonu için analiz edilecek birincil hücre kültürleri hazırlamak için kullanılır Xenopus laevis retina hücreleri disseksiyon ve ayrılma için bir yöntem sunmaktır. Bu yazıda sunulan konuyu kendiliğinden kalsiyum Transientlerin analiz ederken, teknik araştırma soruları ve yaklaşımlar (Şekil 1), geniş bir dizi geniş uygulanabilir.

Protokol

Tüm deneyler William and Mary College Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan protokolleri takip yapılmaktadır. Bu protokolde atıfta Gelişim aşamaları Nieuwkoop ve Faber ⁴⁶ göredir.

1. Teşrih

1. Hücre Kültürü Orta ve oda sıcaklığına gelmesini Kalsiyum Magnezyum Ücretsiz Medium (CMF) izin verin. Ayrıca 0,1 X Marc Modifiye Ringer (MMR) pH 7.4-7.6 gerekir.
2. Bir hücre kültür laminer akış başlık içinde 30 dakika süre ile bir UV ışını uygulanarak aşağıdaki öğeleri sterilize edin. (Davlumbaz yerleştirmeden önce% 70 etanol ile her öğenin püskürtün.)
   • 35 mm plastik Petri kapları.
   • ....

Sonuçlar

Başarılı bir şekilde parçalanmış, optik vezikülleri (aşama 25) ve retinae (aşama 35) örnekleri Şekiller 2E ve 2J gösterilmiştir. Bu protokol geliştirme çeşitli aşamalarında kullanılabilir olsa da, daha fazla deneyler için doğruluğunu sağlamak için sadece retina dokusunun elde etmek önemlidir. Dikkatle tüm aşamalarında epidermisin kaldırmak ve forseps retina dokusunun ponksiyon olmamasını sağlamak. Aşama 35 veya daha büyük ise, mercek retina üzerinde bir katman açık olarak görülebilir ve forseps kullanıl.......

Tartışma

Tüm omurgalılar arasında muhafaza edilir, iyi karakterize hücre tipleri ile, retinanın hücre tipi özellikleri ve farklılaşma yöneten molekül hücresel süreçleri incelemek için yararlı bir model sağlamaktadır. Birincil hücre kültürü ve gen ekspresyonu, protein dinamiği, ve kalsiyum ve tek bir hücre çözünürlük düzeyde elektrik etkinlik içeren işlemler çok çeşitli araştırma için güçlü bir yöntem tanıyor. Burada varsayımsal Retina gelişimi ve primer hücre kültürü çok erken aşamalarında kolayca ulaşılabilir olduğunu Xenop.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
			Diseksiyonlarında ve Kültürleme için
BD Falcon Kolay Tutuş Doku Kültürü Yemekleri, 35 mm	Balıkçı	08-772A
Tek Polistiren Petri Yemekleri, 60 x 15 mm	Balıkçı	0875713A
35 mm Nunclon Yüzey Petri kaplar (Airvent ile)	Balıkçı	12-565-91
Dumont Güzel Forseps (Dumostar # 55)	Balıkçı	NC9341917
Cellattice Mikro-yönetilen plastik lamel, 25 mm	Balıkçı	50-313-17
Etil-m-aminobenzoat metansülfonat Tuz (MS-222)	MP Biomedicals, LLC	103106
Gentamisin Sülfat	Enzo Yaşam Bilimleri	380-003-G025
Gibco Tripsin (1:250) Toz	Yaşam Teknolojileri	27250-018
Clostridium histolyticum gelen Kollajenaz B	Roche	11088831001
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140-122
Nile Blue Sülfat (isteğe bağlı)	Pfaltz & Bauer	N05550
500 ml Vakum Filtre / Depolama Şişe Sistemi, 0.22 mikron gözenek 33.2 cm 2 CN Membran	Corning	430758
			Kalsiyum For Imaging
Fluo-4 DMSO içinde 1 mM Çözüm, Daimi Hücre AM	Yaşam Teknolojileri	F-14217
Su Pluronic F-127% 10 Çözüm	Yaşam Teknolojileri	P-6866
LSM 510 Konfokal Mikroskop Sistemi	Zeiss	Model Üretilmeyen
Reaktif Engelleme	Roche	11096176001
			In situ hibridizasyon Floresan (FISH) için
Anti-digoxigenin-POD, Fab Fragments	Roche	11207733910
Anti-DNP-HRP antikor	Perkin-Elmer	NEL747A
Cy3NHS ester	GE Healthcare	PA13101
NHS-Floresein	Thermo Scientific	46409
Formamid, Deiyonize	Amresco	0606-950ML
Torula RNA, tip IX	Sigma-Aldrich	R3629
Domuz intestinal mukozadan Heparin Sodyum Tuz,	Sigma-Aldrich	H3393-250KU
CHAPS	Sigma-Aldrich	C3023
			Tablo 2. Özel reaktifleri ve ekipmanlar.
			Çözüm Referans Içindekiler Hücre Kültürü Orta Chang ve Spitzer, 2009 54 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 2 mM CaCl2 1.31 mM MgSO4 4.6 mM Tris % 1 (v: v) Penisilin / Streptomisin HCl ile 7.8 pH ayarlayın. 0.22 mikron CN filtre geçerek sterilize filtreleyin. 4 ° C'de depolayın Kalsiyum-Magnezyum Ücretsiz Medium (CMF) Gu et al, 1994 42;. Gu ve Spitzer, 1995 55 116 mM NaCl 0.67 mM KCl 4.6 mM Tris 0.4 mM EDTA % 1 (v: v) Penisilin / Streptomisin HCl ile 7.8 pH ayarlayın. 0.22 mikron CN filtre geçerek sterilize filtreleyin. 4 ° C'de depolayın Maleik Asit Tampon (MAB) Sive ve ark., 2000 53 100 mM maleik asit 150 mM NaCl (pH 7.5). 10X Marc Modifiye Ringers (MMR), Sive ve ark., 2000 53 100 mM NaCl mM KCl 1 mM MgSO4 2 mM CaCl2 5 mM HEPES pH NaOH ile 7.4 'e ayarlandı 0,1 X MMR da 50 mg / ml gentamisin sülfat ve pH, NaOH ile 7.4 'e ayarlanır içerir. MEMFA Çözüm, 10X Sive ve ark., 2000 53 0.1 M MOPS (pH 7.4) 2 mM EGTA 1 mM MgSO4 % 3,7 formaldehit 10X bir çözelti, formaldehit olmaksızın, 4 ° C'de saklanabilir Formaldehit (% 37, standart bir stok, 1/10 hacim), taze ilave edilir. In situ Hibridizasyon Tamponu In SivE ve diğ., 2000 53 50% Formamid 5X SSC 1 mg / ml Torula RNA 100 mg / ml heparin 1X Denhart Çözümü % 0.1 Tween 20 % 0.1 CHAPS 10 mM EDTA. Penisilin ve streptomisin bizim kültür ortamı olarak kullanılabilir yaparken çözümler. * Gentamisin, bir antibiyotik, bizim MMR çözüm olarak kullanılır.