Yöntem makalesi

Mikroelektrod Diziler Kullanarak siRNA Bağlanan Hücre Yüksek verim, Siteye özgü Transfeksiyon (MEA)

12.8K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4415

⸱

13 Eylül 2012

 , 
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University

Bu makalede

Özet

Bir mikroelektrot dizisi (MEA) kullanarak bir yapışkan memeli hücre kültüründe siRNA karıştırılmış dizi site-spesifik transfeksiyon için madde ayrıntılar protokolü.

Özet

Ökaryotlarda ve böyle siRNA ve shRNA olarak RNAi ajanlar, sonraki gelişimi RNAi yolunun keşfi, fonksiyonel genomik ve tedavi için spesifik genler 1-8 susturmak için güçlü bir yöntem elde ettik. RNAi temelli çalışmalarda görev alan önemli bir sorun hedeflenen hücrelere RNAi ajanların teslimat. Böyle toplu elektroporasyon ve kimyasal transfeksiyon yöntemleri gibi geleneksel olmayan viral dağıtım teknikleri, genellikle teslimi üzerinde gerekli mekansal kontrol eksikliği ve 9-12 kötü transfeksiyon verimliliği göze. Bu tür katyonik lipidler, katyonik polimerler ve nanopartiküller olarak kimyasal transfeksiyon yöntemleri son gelişmeler son derece gelişmiş transfeksiyon verimliliği 13 sonuçlandı. Ancak, bu teknikler hala son derece yüksek verimli teknolojiler, tek hücre çalışmaları ve hücre-hücre etkileşimleri soruşturma minyatürize yararlanabilir teslimat üzerinde kesin mekansal kontrol sunmak için başarısız. nt "gen teslimat> En son teknolojik gelişmeler. yapışık hücrelere yüksek-throughput transfeksiyon 14-23, mikro elektroporasyon kullandığınız bir çoğunluğu sağlamıştır Microscale elektroporasyon (kadar tek hücrelere) teslimi üzerinde hassas uzay-zamansal kontrol sunuyor ve kanıtlanmıştır Ayrıca yüksek verimlilik 19, 24-26. ulaşmak için, elektroporasyon temelli yaklaşımlar kimyasal bazlı transfeksiyon yöntemleri gerekli siRNA ve DNA kompleksleri ile inkübasyon uzun bir süre (genellikle 4 saat) gerektirir ve çıplak siRNA ve DNA'nın doğrudan giriş yol açmaz hücre sitoplazması içine molekülleri. Bunun bir sonucu olarak gen ekspresyonu transfeksiyondan 27 saat sonra altı gibi erken elde edilebilir. Laboratuarımız önceden yapışık memeli hücre kültürleri 17-19 site-spesifik transfeksiyon için mikroelektrot dizilerin kullanımı (MEA) göstermiştir. MEA temelli yaklaşım, genetik yükü teslim lokalize mikro ölçekli electroporati yoluyla elde edilirhücreleri üzerinde. Seçilen elektrotlar ile elektrik sinyalinin bir uygulama uyarılan elektrot bölgesinde mevcut hücrelerin elektroporasyonu yol açar lokal elektrik alanı oluşturur. Mikro elektrotların bağımsız denetim transfeksiyon üzerinde mekansal ve zamansal kontrolü sağlar ve deneysel verim artırılması ve kültür-to-kültür değişkenliği azaltarak aynı kültürü üzerinde yapılacak birden transfeksiyon tabanlı deneyler sağlar.

Burada deneysel kurulum ve elektroporasyon kullanarak bir floresan etiketli karıştırılmış dizisi siRNA ile yapışık HeLa hücrelerinin hedef transfeksiyon için protokol açıklar. Aynı protokol de plazmit vektörlerinin transfeksiyon için de kullanılabilir. Buna ek olarak, burada tarif edilen protokol küçük değişikliklerle kolaylıkla ile memeli hücre çizgileri, çeşitli için genişletilebilir. Önceden tanımlanmış ve özel her iki elektrot desenleri ile ÇÇA'lar Ticari durumu bu teknik erişilebilir t olunTemel hücre kültürü ekipmanları ile o en fazla araştırma laboratuarları.

Protokol

1. MEA Hazırlık

  1. Daha önce 18 açıklandığı veya Çok Kanallı Sistemler olarak MEA üreticilerinden satıcılardan doğrudan satın gibi elektroporasyon deneylerde kullanılmak için ÇÇA'lar ya standart fotolitografi tekniği kullanılarak imal edilebilir (http:/www.multichannelsystems.com/) ve Alpha MED Scientific, Inc ( http://www.MED64.com) . Deneylerde kullanılan ÇÇA'lar Katıhal Elektroniği Araştırma (CSSER) Merkezi tarafından yönetilir Arizona Eyalet Üniversitesi, temiz oda tesisi in-house imal edilmiştir. Deneylerde kullanılan ÇÇA'lar iyi bir 1 cm iç çapı camın içinde 50-200 mikron gelen elektrot çapı boyutları ile 4 dizisi tarafından 8 32 indiyum kalay oksit elektrotlar vardı. Camın çok iyi MEA kullanarak polidimetilsiloksan (PDMS) üzerine bağlanmıştır.
  2. Hücre s önce otoklavda sterilize MEAeeding. Bunlar MEA bütünlüğünü tehlikeye olmayan uzun gibi% 70 etanol içinde bir nemlendirici gibi diğer sterilizasyon yöntemleri, başka yerlerde açıklandığı gibi UV tedavisi ve sıcak su arıtma de kullanılabilir.
  3. Bir laminer akış kaputu otoklavlanmış MEA aktarın ve standart steril polistiren Petri yerleştirin. Önceki MEA üzerinde hücre tohumlama için, 20 dakika boyunca UV ışığı açarak laminer akış kaputu sterilize. MEA UV ışığı akış kaputu UV ışık altında iken steril alüminyum folyo ile MEA içeren Petri kabı kapsayacak şekilde hassas ise.

2. MEA üzerinde Tohum Hücreler

  1. Tripsin / EDTA ile kaplama için 1 ml hücre ortamı içinde 100-200 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon ile onlara yapışık yükseltmek kullanılarak memeli hücrelerinde çalışan bir hücre çizgisi Hasat hücreleri. Deneylerde biz kültür NIH 3T3 fibroblast hücre hattı, HeLa hücre hattı ve MEA birincil kortikal ve hipokampal nöronlarda başarılı olmuştur.
  2. MEA üzerinde hücreleri ile ortam 20-30 ul damla yerleştirin. Inkübatör MEA ile Petri kabı aktarın. Bu hücre damla boyutu MEA tüm elektrotlar kaplayacak kadar büyük olduğundan emin olmak için önemlidir.
  3. Hücreler laminer akış kaputu inkübatör MEA ile Petri kabı aktarmak ve hafifçe de MEA önceden ısıtılmış medya 400-500 ul (37 ° C) ekleyin tohumlama sonrası 2 saat. Bu hücreler hala bağlı ve eşit MEA yüzeye yayılır sağlamak için mikroskop altında kontrol edin. Inkübatör MEA geri aktarın. Ortam ilave edilmeden önce 2 saat bekleme süresi hücreleri MEA yüzeyi ile bağlı kalmak için yeterli zaman sağlar. Çok yakında hücreleri tohumlama sonrası hücre ortam ilavesi hücreleri uzak yıkayabilirsiniz. Hücre MEA üzerinde iyi uymayan, yüzeyi hücre adezyonu artırmak için hücre bağlanma gibi faktörler aspolylysine, fibronektin ve laminin ile tedavi edilebilir. Bizim HeLa hücre deneylerde biz genellikle fibronecti ile MEA yüzey tedavi1-2 saat için n (10 ug / ml).
  4. Hücreler tohumlama sonrası 8-12 saat, herhangi bir ölü hücreleri çıkarmak için PBS ile 1-2 yıkar gerçekleştirin. Gerektiğinde Hücre orta her 24-48 saat değiştirilir. Tipik bir deneyde, hücreler transfeksiyon ekim sonrasında genellikle 24-48 saat için hazırdır. Elektroporasyon verimlilik tutarlılığı sağlamak için bu kültürü elektroporasyon önce konfluent en az% 80 kadar beklenmesi tavsiye edilir.

3. SiRNA Siteye özgü Transfeksiyon

  1. Nükleik asit çözeltisi hazırlayın. SiRNA transfeksiyon için, 200-400 ul nihai hacim elde etmek için buz gibi soğuk tampon içinde elektroporasyon, 1-2 uM siRNA elektroporasyon solüsyon hazırlanır. Bu video yazıda siRNA Alexa 488 konjuge karıştırılmış sırası ile HeLa hücrelerinin transfeksiyon göstermektedir.
  2. Inkübatör, steril laminer akış kaputu hücreleri ile MEA aktarın. MEA gelen hücre ortamı çıkarın ve PBS ile yıkama gerçekleştirin. Bundan sonra, i 200-400 ul ekleyinkuyuya ce soğuk 1 uM siRNA elektroporasyon çözüm.
  3. Hedeflenen elektrotlar (elektrikli darbe optimal parametrelerin belirlenmesi için 4. adıma bakın) için anodik kare elektrik darbeleri uygulayın. Deneylerde biz elektrik bakliyat ve MEA bağ yastıkları ile temas yapmak için bir dual-inline-paketi (DIP) 16 pin klibi oluşturmak için Pragmatik Cihazları 2414A dalga üreteci kullanılır. Dalga biçimi üreteci tek tek elektrodların seçicilik sağlamak için bir demultiplexor baskılı devre kartı yoluyla DIP klip ile bağlanabilir. Referans elektrodu, hücre ortamı içinde bir çelik katot yerleştirin. Medyada çelik referans elektrot düşerken onu MEA yüzeyi ile temas yapmaz emin olmak için son derece önemlidir. Temas ettiğinde, bu hücreleri ve MEA zarar verebilir. Bu, hücrelerin yukarıda 1 mm bir konum ile referans elektrodu düşürmek için tavsiye edilir. 1 mm bir yüksekliğe sahip bir boşluk ref yerleştirilmesi yardımcı olmak için iyi yerleştirilebilirerence elektrot. Harici bir referans elektrot kullanarak alternatif bir yaklaşım katot-anot çiftleri olarak komşu elektrotlar kullanmaktır.
  4. Hemen MEA üzerinde hedeflenen elektrotlara elektrik darbeleri uygulandıktan sonra, kuluçka için MEA geri aktarın. 5 dakikalık bir kuluçka döneminden sonra, yavaşça önceden ısıtılmış (37 ° C), hücre ortamı ile elektroporasyon tamponu% 75 değiştirin. Daha sonra, fosforlu görüntü hücrelerinin fluoresan etiketli siRNA teslim teyit etmek için yapılabilir.

4. Elektroporasyon Parametre Optimizasyonu

  1. Darbe genlik, darbe süresi ve darbe sayısı değerlerinin bir aralığı için elektroporasyon, tasarım elektroporasyon deney için optimal elektrik nabız parametreleri belirlemek için. HeLa hücreleri ile bizim deneyim, biz gözlenen mil ile başarılı elektroporasyon yol açtı 100 mikron bir elektrot boyutu için tek bir gerilimi 3 V ila 9 V genlikli darbe ve msn 1 den 10 msn sürelinimal hücre ölümü. Bu bir parametre bir seferde değiştirilebilir ve diğerlerinin sabit tutulması bizim tavsiyedir. Nabız parametrelerin her biri için elektroporasyon etkinliğini ölçmek için, olduğu gibi adımlar 4,2-4,5 açıklandığı propidyum iyodür (PI), bir hücre laktobionat, boya ki lekeleri nükleik malzeme, ve canlı deney esaslı yönteme kullanır.
  2. Adım 1 ve 2'de belirtilen yön takip eden MEA üzerinde bir hücre kültür oluşturulması.
  3. Önceki elektroporasyon bir buz gibi soğuk elektroporasyon tamponu içinde 30 ug / ml solüsyon PI 300-500 ve calcien ul PBS içinde çözelti AM 4 uM 400 ul hazırlamak için.
  4. Inkübatör laminer akış kaputu MEA aktarın. MEA gelen hücre ortamı çıkarın ve PBS ile yıkama gerçekleştirin. Bundan sonra, PI ile buz soğuk elektroporasyon tamponu 300-500 ul ekleyin.
  5. Hedeflenen elektrotlar (elektrik üretme ve uygulama için Deneylerde kullanılan ekipmana istenen darbe genliği ve süresi ile elektrik darbeleri uygulayınMEA ile mide darbe adım 3.3) anlatılmıştır. Referans elektrot için ya iyi MEA elektroporasyon tampon içine çelik elektrot düşürmek veya referans olarak komşu elektrodu kullanın. Seçici farklı elektrotlarla değişen genlik veya süreleri darbeleri uygulayarak birden fazla deneyler aynı cihaz üzerinde yapılabilir. Örneğin, bir 32 elektrot MEA üzerinde, 8 deneyler 8 grup, 4 elektrot oluşan her bir bölme ile 32 elektrotlar gerçekleştirilebilir. 8 gruplarının her biri daha sonra, bir kontrol olarak kullanılan 0,5 V artışlarla ve bir grupta, 3 V-6 V aralığında değişen genlikleri ile süresi 5 msn dikdörtgen tek bir voltaj palsı ile stimüle edilebilir.
  6. Hemen uyguladıktan sonra voltaj darbeleri 5 dakika inkübatör MEA aktarın. Daha sonra, hafifçe de MEA gelen elektroporasyon tampon% 75'i kaldırmak ve sıcak hücre ortam ile değiştirin. Inkübatör MEA geri aktarın.
  7. 2-4 saat bir kuluçka döneminden sonra4 uM 300-500 ul ile iyice MEA ortamı içinde hücre değiştirmek Calcein AM PBS çözeltisi. Başka bir 30 dakika için inkübatöre geri MEA aktarın.
  8. Calcein AM ile hücrelerin inkübasyonu takiben, PBS ile iki yıkamadan sonra PBS ile iyice MEA içinde çözelti Calcein AM değiştirin. Ve Calcein AM (Uyarma / Emisyon - 490 nm/520 nm) - PI (535 nm/617 nm Uyarma / Emisyon) için filtreler optik mikroskopla kullanarak hücrelerin floresan görüntüler elde edin. Elektroporasyon nedeniyle PI alımı, hücre kırmızı floresan ve Calcein AM yeşil floresan için canlı hücreler neden olmuştur. Görülebilir Üç olası senaryo)) canlı hücre electroporated ve canlı (kırmızı ve yeşil iki floresan olacak), 2) Hücreler 1 ama electroporated (sadece yeşil floresan olacaktır) ve 3 değil, elektroporasyon nedeniyle ölü hücreler (sadece kırmızı floresan olacaktır) . Hücre canlılığı elektrot üzerinde canlı hücrelerin toplam sayısının yüzde ve elektroporasyon eff olarak hesaplandıiciency PI / siRNA ile yüklü hücrelerin toplam sayısının yüzde olarak hesaplanmıştır.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1, PI ile HeLa hücrelerinin site-spesifik yükleme göstermektedir. Bu, elektrot üzerinde tek hücreler PI (Şekil 1B) bir alımı gösteren olduğu görülmektedir. Canlı test sonrası elektroporasyon hücreler (Şekil 1A) canlılığı değerlendirmek için kullanılmıştır yapılır. Şekil 1'de gösterildiği gibi, örneğin elektroporasyon verim ve hücre viabilitesi, sırasıyla% 81.8 ve% 96.1 'bulunmaktadır. Yüksek hücre canlılığı ve elektroporasyon verim elektroporasyon darbe parametreleri optimize edilmesi ile elde edilebilir. Optimize edilmiş bir elektroporasyon puls için floresan etiketlendi siRNA (8 V, 1 mili saniye) ile HeLa hücrelerinin Yere-özgü transfeksiyon Şekil 2 'de gösterilmiştir. 8. V, 1 milisaniye de siRNA için elektroporasyon verim ± 74.4 bulundu% 16.0 ve edildiHücre canlılığı 87.9 ±% 8.4 (ortalama olarak temsil edilen tüm veriler ortalama ± standart sapma, N = 5) olarak tespit edilmiştir.

figure-protocol-1
Şekil 200 mikron elektrot (6 V, 5 ms) hakkında HeLa hücrelerinde PI 1. Siteye özgü teslimat. A) Calcien göre canlı assay 2 saat sonrası elektroporasyon gerçekleştirilir. Canlı hücreleri yeşil floresan ile gösterilir. B) Kırmızı floresan elektrot üzerinde hücreleri tarafından PI alımını gösterir. C) A ve B beyaz oklar A bindirilmiş görüntü electroporated ve canlı hücreleri gösterir. Siyah oklar ölü hücreleri gösterir. A, B ve C 'de beyaz bir daire elektrot dış hatlarını göstermektedir.

figure-protocol-2
Şekil 2. Floresan etiketlendi scrambl ile HeLa hücrelerinin transfeksiyonusiRNA e dizisi. A) bir 100 um elektrot üzerinde HeLa hücreleri ile ilgili görüntü Alexa 488 etiketli siRNA (8 V, 1 mili saniye) ile transfekte. B) hücre çekirdeğinin Görüntü DAPI ile boyanmış. Beyaz bir daire elektrot kenarına işaretler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu video yazıda siRNA karıştırılmış dizisi ile HeLa hücrelerinin siteye özgü transfeksiyon için MEA kullanımını göstermektedir. Bu teknolojinin avantajlarından biri primer hücre hatları da dahil olmak üzere farklı hücre hatları uygulanabilmesidir. Bizim laboratuarında önce E18 gün yaşlı sıçan ve pişmiş siRNA dizileri ve plazmid GFP 18, 19 ile NIH-3T3 hücreleri primer hipokampal nöronal kültür siteye özgü transfeksiyon için bu teknolojinin kullanımını göstermiştir. Biz de HeLa hücrelerinde bulunan endojen hede...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Malzemeler

Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Hücre ortamı:
Gelişmiş MEM
L-Glutamine 200 mM
Penisilin / Streptomisin
Fetal bovin serumu 		Gibco / Invitrogen
HIMEDIA Laboratuvarlar / VWR
Lonza grup Ltd
Gibco / Invitrogen 		12492-013
95057-448
09-757F
16000-044 		Hücre ortamı bileşimi:
Peşin MEM içinde% 2 FCS,% 2 L-glutamin ve% 2 Pennstrep
Tripsin EDTA Mediatech, Inc 25-053-CL
PBS Mediatech, Inc 21-040-CV
Tagged Alexa 488 ve rodamin sequ şifrelience siRNA Qiagen, Inc 1027292
Elektroporasyon tampon BioRad Laboratuvarlar 165-2677
Dalga jeneratörü Pragmatik 2414A İstediğiniz darbe sunabilirsiniz Herhangi dalga / puls üreteci kullanılabilir.

Kaynaklar

  1. Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  2. Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).
  3. Elbashir, S. M. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
  4. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550(2002).
  5. Lee, N. S. Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).
  6. Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
  7. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
  8. Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo. Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).
  9. Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).
  10. Felgner, P. L. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).
  11. Raptis, L. H. applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide. Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).
  12. Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).
  13. Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers. International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).
  14. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411, 107-110 (2001).
  15. Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes. Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).
  16. Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer. Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).
  17. Jain, T., Muthuswamy, J. Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells. Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).
  18. Jain, T., Muthuswamy, J. Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture. Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).
  19. Jain, T., Muthuswamy, J. Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording. Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).
  20. Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays. Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).
  21. Huang, H. An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery. Lab Chip. 11, 163-172 (2010).
  22. Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).
  23. Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays. Lab Chip. 12, 939-947 (2012).
  24. Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo. Neuron. 29, 583-591 (2001).
  25. Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region. J. Neurophysiol. 93, 594(2005).
  26. Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).
  27. Boukany, P. E. Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells. Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

siRNA letimiElektroporasyon ParametreleriHeLa H creleriPropidyum yod rKalsiyum AMFloresan G r nt lemeH cre Canl l

İlgili makaleler