Yöntem makalesi

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

30.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/4418

⸱

26 Kasım 2012

 ,  , 
1Neuroglial Interactions in Cerebral Physiopathology, Center for Interdisciplinary Research in Biology, CNRS UMR 7241, INSERM U1050, Collège de France, 2Paris Diderot University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

İzole hipokampi akut beyin kesitleri, hem de astrosit ve nöronların eşzamanlı elektrofizyolojik hazırlanması Stratum radiatum Schaffer kollateral uyarımı esnasında tarif edilmektedir. Astroglial ve potasyum glutamat taşıyıcı akımlarının farmakolojik izolasyon gösterilmiştir.

Özet

Astrositler onlar entegre nerede, nöronlar üçlü sinapslar ile birlikte oluşturmak ve nöronal aktivitesini modüle. Nitekim, astrositler kendi iyon kanalları ve nörotransmitter reseptörlerinin aktivasyonu yoluyla nöronal girdilerin hissedebilir ve gliotransmitters faaliyet bağımlı salınımı ile kısmen işlem bilgileri. Ayrıca, astrositler glutamat için ana alım sistemi oluşturan, potasyum mekansal tamponlama katkıda yanı GABA izni olarak. Bu hücreler bu nedenle sürekli sinaptik etkinliği izlemek ve Synaptically-glutamat salınımının değişiklikler, GABA ve ekstraselüler potasyum seviyeleri için böylece hassas göstergeleridir. Ayrıca, Astroglial alımı faaliyet veya tamponlama kapasitesi değişiklikler nöronal fonksiyonları üzerinde ciddi etkileri olabilir ve fizyopatolojik durumlarda veya nakavt fareler karakterize ederken göz ardı olabilir. Nöronal ve astroglial faaliyetlerinin Çift kayıt nedenle değişiklikler incelemek için önemli bir yöntem olduğunuSinaptik gücü Astroglial alımı ve tamponlama kapasiteleri değişiklikleri eşlik eden ilişkilidir. Burada hipokampal dilim, nasıl stratum radiatum astrositler tespit etmek ve nasıl eşzamanlı nöronal ve astroglial elektrofizyolojik yanıtları kaydetmek için nasıl hazırlanacağını açıklar. Ayrıca, biz farmakolojik Synaptically-uyarılmış Astroglial akımlar izole etmek nasıl açıklar.

Protokol

1. Yapay Beyin Omurilik Sıvısı ve intrasellüler Çözüm hazırlanması

  1. Deney başlamadan önce, bir yama kelepçe kayıtları yanı sıra, hipokampus hazırlanması için suni serebrospinal sıvı (ACSF) için dahili çözelti hazırlamak gerekmektedir. Bir bardak gazlama cihazı (mikro filtre mum, Robu Almanya) ve doku grid (cibinlik veya naylon sıkı); Siz ayrıca cerrahi makas ve ince iris makas, iki spatula ve forseps (Güzel bilimi araçları) oluşan bir diseksiyon seti gerekir hem de yapıştırıcı (Uhu Dent). Elektrofizyoloji dilim yama kurulum yapılandırma Finkel & Bookman, 2001 1 tarafından tanımlanmıştır.
  2. Iç çözelti için, (mM olarak) çözülür: 105 K-glukonat, 30 KCl, deiyonize su içinde 10 HEPES, 0.3 EGTA (nihai hacim olarak% 70-80). 4 ° C'ye kadar soğutulur ve çözelti (mM olarak) eklenir: 4 ATP-Mg, 0.3 mM Tris-GTP ve 10 fosfokreatin. KOH ve dolgu u ile 7.4 'e pH ayarlamason hacim için deiyonize su ile s. (Osmolaritiy: ~ 280 mOsm). Bu çözüm (gözenek boyutu 0,2 mikron) filtreleyin. Aliquoted çözüm 3-4 hafta dayanır - 20 ° C Bir deney gün için, iç solüsyonu ~ 1 ml gereklidir.
  3. Aksi belirtilmediği sürece, CA1 bölgesinde hipokampusta hazırlanması ve hücre kayıtları için kullanılan ACSF, (mM cinsinden) şunları içerir: 119 NaCl, 2,5 KCl, 2.5 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1 NaH 2 PO 4, 26.2 NaHCO 3 ve 11 glikoz. Carbogen (% 95 O2 ve% 5 CO2) ile - en az 10 dakika (7.4 pH ~ 7.3) deiyonize su (Ozmolarite ~ 320 mOsm) oksijen ve bu çözelti, bu tuzlar çözülür. Her deneme için çözelti en az 1 litre hazırlayın. Özellikle dikkat hipokampus bölgesinde CA3 deney yapmak için kullanılacak hipokampal doku hazırlanması için dikkat edilmelidir. Nitekim, bu bölgede faaliyet ve sonraki nöronal ölüme epileptiform eğilimli. Böylece synapt87 NaCl, 2,5 KCl, 0.5 CaCl2, 7 MgCl2, 1 NaH 2 PO 4: içeren buz gibi soğuk sükroz içinde çözelti hipokampus Diseksiyon (mM olarak) gerçekleştirerek ik aktivitesinin büyük kesit hazırlanması sırasında azaltılması gerekir, ve bu sağlanır , 25 NaHCO 3, 10 Glikoz ve 75 Sakkaroz. Bu çözelti, düşük sodyum, düşük kalsiyum ve magnezyum yüksek konsantrasyonlarda kombinasyon kitlesel böylece spontan aktivite ve hücre ölüm en aza indirerek, presinaptik ateşleme ve serbest bırakma olasılığını yanı sıra, postsinaptik NMDA reseptör etkinliği azaltır. CA3 bölge hücre kayıtları için kullanılan hazırlandıktan sonra hippokampal dilimler polisinaptik aktivitesi en aza indirmek için 4 mM CaCl2, 4 MgSO4 içeren, modifiye ACSF ile perfüze edilir.

2. Akut Hipokampal Dilim Hazırlama

  1. Sürekli ile oksijenleme iken, ~ 300 dilimleme oda için ACSF ml 'de 4 ° C' de hazırlanması için aşağı serincarbogen. Ayrıca carbogen (Şema Şekil 1) ile oksijenli bir dilim depolanması için oda sıcaklığında (RT) de ACSF küçük bir beher hazırlayın.
  2. Kafesin içine eklenir 1 ml izofluran ile ıslatılmış küçük bir kağıt havlu ile bir başlık altında fare uyuştur.
  3. Fare derinden uyuşturulduktan sonra, kafasını kesti ve buz oksijenli ACSF ile küçük bir tabak içine doğrudan ekleyin. Küçük bir makas ile kafa derisi çıkarın ve sonraki adımlar için doku üzerine kafa aktarın. Gösterilen ve Şekil 1 'de tarif edildiği gibi, hipokampus incelemek için başlat.
  4. Buz düşük hızda (3 mikron / sn) ve 70 Hz titreşim frekansı 300-400 mikron kalınlığında enine dilimler kesin ACSF oksijenli ve bir depolama odasına aktarabilirsiniz. En az 1 saat önce kayıt için RT dilimleri dinlendirin. CA3 deney için dilimleri 34 ° C 'de 25 dakika tutulur ve oda sıcaklığında en az 30 dakika, dilimleme işlem kurtarılır.

3. Uyarılmış astroglial Akımlar ve Nöronal Saha Potansiyellerinin Çift Kayıt

Biz burada bir ekstrasellüler elektrot kullanarak afference stimülasyonu ile sinaps aktivasyonu ile indüklenen Astroglial ve nöronal yanıtlar, yani yanıtları Synaptically-uyarılmış kaydetmek nasıl açıklar.

  1. Sürekli uyarıcı yanıt izole etmek için 100 uM picrotoxin (GABA A antagonisti) içeren, oksijenli ACSF (1.5-2 ml / dk, RT) ile kayıt oda serpmek. Bir poli-L-lizin (1.5 ila 3 mg / ml) kaplanmış lamel üzerine bir dilim aktarın, iyi bir yapışma elde etmek için dilim sıvı emmek ve dilim üzerinde ASCF bir damla ilave edin. Kayıt odasına lamel yerleştirin. Picrotoxin tarafından inhibitör iletim Kuşatması, epileptiform aktivite uyarılmış olayların ölçümü bozar nöronal nüfus yani spontan, senkron pişirim, neden olabilir. Böylece, epileptiform aktivite önlemek için, bir yapmakCA1 ve CA3 bölgeler arasında düz bir kesim (sadece yüzey) Schaffer kollateral (Şekil 2a içinde gösterildiği gibi) aracılığıyla yayılma önlemek için kullanılır.
  2. Stratum radiatum astrositler kendi küçük soma boyut (~ 10 mikron) ve stellat süreci kurulca tespit edilebilir. En az 20-30 mikron dilim yüzeyinin altında bir hücre seçin. Uyaran izolasyon kutusuna bağlı ve banyo (sadece cam pipet etrafında ikinci gümüş tel sarma ile) topraklanmış gümüş tel üzerinde bir cam stimülasyon elektrod (ucu direnci MΩ ~ 1) monte edin. Schaffer kollateral bölge içine uyarım elektrot yerleştirin, uzak olarak seçilmiş astrosit 200-300 um arasında bir mesafe Şekil 2A'da gösterildiği. Amplifikatörün headstage bağlı klorlu bir gümüş tel üzerine alan kayıt elektrodu (MΩ ~ 2-5) monte edin. Her iki elektrot ACSF ile daha önce doldurulur. Harici com devre I = 0 mod, multiclamp olarak seçinmand giriş ve ~ 50 um uzağa tabaka radiatum bölgesi (Şekil 2A) içine astrosit ikinci elektrot yerleştirin. Kazanç 2 ila 10 ve 2 kHz Bessel filtre ile filtre ile yanıtları kaydedin. Beyin dilim içine Elektrik akım enjeksiyon presinaptik terminallerde çevreleyen Schaffer teminat akson ve sonraki verici sürümü aksiyon potansiyelleri tetikler bu proje postsinaptik CA1 piramidal nöronlar. Yayımlanan vericileri küçük bir negatif potansiyel olarak ekstraselüler ölçülebilir postsinaptik iyonotropik reseptörleri aracılığıyla hücre içine bir pozitif yük akışı, tetikleyecektir. Inhibitör transmisyon farmakolojik olarak bloke edilir iken bu alan eksitatör postsinaptik potansiyeller (fEPSP), aynı anda etkin bir grup nöron faaliyeti entegre. Bir fEPSP uyandırmak için bazı test darbeleri (0,1 msn süreli) uygulayın; stimülasyon elektrod bazı konumlandırılması fEPSP artırmak için yardımcı olabilir. Tipik CA1 stratum radiatum fEPSP Şekil 2B'de gösterilmiştir. Konumlandırma ve tepki dalga ile ilgili daha fazla detay Yuan ve ark bulunabilir. 2003 2. Sağlıklı bir hipokampal dilim fEPSP genlik genellikle lif voleybolu genliği olarak iki kat daha fazla büyük olmalıdır. FEPSP genliği veya eğimi doğru ölçümü için, uyarılmış yanıtı polisinaptik aktivitesi olarak (çok yoğun tepki olarak algılanabilir) sinaptik aktivite hipereksitabilite için bir işaret olabilir elektriksel stimülasyon, bağımsız belirtir monosinaptik olmalıdır. Şekil 3C de gösterildiği gibi, hipokampusun CA3 bölge içinde gerçekleştirilen deneyler için, uyarma ve kayıt pipet konumlandırılır. Açıkça bir kaç saniye için mossy lif kuvvetle kolaylaştırıcı katkılar, paired-pulse stimülasyonu (50 msn strok arası aralık) ve 1 Hz stimülasyon tanımlamak için kitlesel fEPSP responses.At sonuna uyarılmış başlangıçta düşük genlik geliştirmek için uygulanırDeney, DCGIV bir mGluR2 / 3 reseptör antagonisti, daha doğrusu mossy lif girişleri teşvik olduğunu doğrulamak için yıkanabilir arasında. Bu antagonisti Uygulama mGluR2 / 3 reseptörleri, yosunlu lif boutons engelleyecek presinaptik sürüm yüksek ifadesi nedeniyle ~% 90 oranında fEPSP azaltmak gerekir.
  3. Filtre iç çözümü ile bir yama pipet (MΩ ~ 2-5) doldurun ve ikinci headstage bağlı bir klorlu gümüş tel üzerine monte, pipet tutucu boru ile bağlı bir şırınga ile pozitif basınç uygulayın. Sürekli 10 mV 20 msan testi darbe uygulamak ve hücre yüzeyine ulaşması ve membran bir saptırma görünür olana kadar doku içine pipet hareket ettirin. Ofset pipet Sıfıra, pozitif basınç, kaldırma ve membran kelepçe - 80 mV. Bir gigaseal (en az 1 GΩ) (birkaç saniyeden uzun sürmemelidir) ulaşılana kadar bekleyin. Bazı negatif basınç Nazik uygulaması ag ulaşmak için yardımcı olabilirigaseal. Hücresine Kır negatif basınç, kısa bir uygulama ile elde veya multiclamp içinde zap fonksiyonu kullanılarak edilir. FEPSP ve gerilim kelepçe yılında Astroglial yanıt (-; frekansı 0.1 Hz, bessel filtresi 2 kHz, kazanç 10 80 mV Vhold) uyarılmış Schaffer teminat eşzamanlı kaydı başlatın. Bitişik piramidal hücreler tarafından üretilen fEPSPs yansıtan, hızlı geçici dışa akım göreceksiniz ilk: Astroglial Geçerli cevap iki fazlıdır. Bu yavaş yavaş artan ve çürüyen içe akım (nöronal yanıtlar sona ermesinden sonra devam eden birkaç saniye (> 10 sn)) tarafından takip edilmektedir. Bu akım depolarize postsinaptik terminalleri çevredeki yayınlanmasının ardından, astrositler içine potasyum girişini kaynaklanmaktadır. Presinaptik glutamat salınımını tetiklediği akımı aynı anda aktive hızlı geçici glutamat taşıyıcısı (GLT), potasyum akım tarafından maskelenir. Astrosit yanı sıra, yama erişim direnç tutma potansiyel mo olmalıdırDeney boyunca nitored ve kayıt koşullarda değişiklikler nedeniyle astroglial cevapları arasında yanlış izlenmesi önlemek için, ~% 20 daha fazla değişiklik olmamalı. Ilk tutma potansiyeli> -70 mV Sadece astrositler sağlıklı hücreleri incelemek için araştırılmalıdır.
  4. Uyarılmış astrositik membran depolarizasyon kaydetmek amacıyla gerilim akım kelepçe geçin. FEPSP tamamen bloke olur ve GLT genlik bir platoya ulaşmıştır kadar iyonotropik glutamat reseptör blokeri kynurenic asit (5 mM) perfüzyon glial glutamat taşıyıcısı (GLT) akımı izole edin. Açıkça GLT akım belirlemek için, spesifik antagonist DL-treo-β-Benzyloxyaspartatic asit (DL-TBOA, 200 uM) de geçerlidir. Farklı sinaptik güçte nöronal ve astroglial yanıtlarını kaydetmek ve paired pulse stimülasyon yanıtlarını araştırmak için iki yakın aralıklı uyaranlara (50 milisaniye aralığı) uygulamak için 5 kata kadar 2 kat stimülasyon gücünü artırın. Seri r Kararlılığıglial hücre esistance ve membran potansiyeli kayıt boyunca izlenmelidir.
  5. Gap-kavşak ölçüde Astroglial ağları aracılığı görselleştirmek için, boya kaplin deneyler, böyle sulforhodamine-B gibi düşük moleküler boyalar (<1.5 kDa), pasif difüzyon etkinleştirmek için, herhangi bir akım enjeksiyonu olmadan, akım pensi modunda yapılmalıdır gap junction kanalları aracılığıyla. Çevreleyen doku içine boya taşkınlığın en aza indirmek için, doku girerken sadece zaman pozitif basınç yama pipet ile uygulanmalı ve yama kısa sürede ulaşılmalıdır.

Sonuçlar

Hipokampusun CA1 bölgesinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve nöronal yanıtlar bir temsilcisi, eş zamanlı kayıt (fEPSPs) Şekil 2 AB 'de gösterilmiştir. Uyarılmış Astroglial akımı bifazik, yani bu geçici bir dışa akım ve (Şekil 2B) (> 10 sn), yavaşça çürüyen içe akımı oluşur. Dışa akımı uyarılmış fEPSP yansıtır ve kynurenic asit (koyu gri iz, Şekil 2B) 3 tarafından iyonotropik glutamat reseptörlerinin inhibisyonu sonra bloke edilir. Aynı zamanda ana temsil bilinmektedir postsinaptik iyonotropik glutamat reseptör aktivitesini inhibe kynurenic asit (Şekil 2B ve Şekil 2C 1) 3-6, tarafından kaldırılmıştır beri yavaş içe akım çoğunluğu, astrosit aşağıdaki postsinaptik depolarizasyon içine potasyum girişini yansıtır potasyum serbest bırakma 7 kaynağı (% 80). Kalan hızla bir yükselend çürüyen içe akım GLT antagonisti DL-TBOA (açık gri iz, Şekil 2B ve Şekil 2C 2) tarafından inhibe edilir. Kynurenic asit (koyu gri eser) olarak akım dan TBOA (açık gri iz) içinde geriye kalan yavaş akım post-hoc çıkarma akımı saf astroglial glutamat taşıyıcı (siyah iz), ve izolasyon olarak Şekil 2C'de 2'de gösterildiği izin verir. Kalıcı yavaş kynurenic asit mevcut çürüme ve TBOA (açık gri iz, Şekil 2B ve Şekil 2C 2) TTX (veriler gösterilmemiştir) tarafından engellendi, ve büyük olasılıkla ekstraselüler K birikimi yansıtan + presinaptik afferent pişirim 3 sırasında serbest bırakılabilir. Schaffer kollateral orta tek uyarılması aynı hücre (Şekil 2B) kaydedilen küçük uyarılmış depolarizasyon nazaran göreceli olarak büyük bir Synaptically ile uyarılan astroglial akıma neden olmaktadır. Bu nedeniyleastrositlerde düşük membran direnci. Synaptically-uyarılmış Astroglial membran potansiyeli dinamiklerinin Kaydı, Şekil 2B'de gösterildiği gibi, yerel ekstraselüler potasyum düzeyleri 8 doğrudan bir ölçüsüdür. Yatan nöronal aktivite uyarılmış Astroglial yanıtların Normalizasyon, farklı deneylerin doğrudan karşılaştırma gibi son 6 gösterildiği sağlar. Toplam Synaptically ile uyarılan akım astroglial doğrusal fEPSP artış (Şekil 2E) aşağıdaki gibi astroglial akımlar ayrıca, çok güvenilir bir şekilde eksitasyon iletiminde değişiklik izleyebilir. Onlar göstermek yana astroglial akımlar da, kısa vadeli sinaptik plastisite yansıtacak, nöronlar gibi, paired-pulse kolaylaştırma (Şekil 2F). Bir CA1 piramidal hücre ve bir astrosit eşleştirilmiş tüm-hücre kaydı, bir depolarize darbe yanıt olarak gösterge nöron aksiyon potansiyelleri, çünkü her iki hücre tipi çok farklı davranış göstermektedir elektrofizyolojikkomşu astrosit (Şekil 3A-B) sessiz iken. Bununla birlikte, Schaffer kollateral orta uyarılması aynı anda CA1 piramidal hücre ve bitişik astrosit (Şekil 3B 2) içinde bir hızlı dışa doğru ve içe doğru akımlar içinde yavaş bir hızlı uyarıcı potansiyel posynaptic uyandırabilir. Şekil 3C 'de gösterildiği gibi Synaptically ile uyarılan nöronal astroglial ve çift kayıt cevaplar arasında, aynı zamanda, hipokampusun CA3 alanında kaydedilmiştir. Nitekim, CA3 yosunlu liflerinin tek uyarılması bazal koşullarda Astrositlerde hızlı küçük dışa ve içe yavaş akımlar (Şekil 3B 1) ile ilişkili yerel fEPSPs olarak kaydedilen çok küçük nöronal tepkiler çağrıştırıyor. Sadece orta Astroglial yanıt (Şekil 3D 2) artırırken aksine, birkaç saniye için CA3 yosunlu liflerinin 1 Hz stimülasyon şiddetle fEPSP artırmaktadır.

figure-results-1
Enine dilimlerin hazırlamak için 1. Hippocampus izolasyon Şekil. Beyin teşrih için orta hat (a) boyunca kafatası kesti. Koku ampul (b) düzeyinde ve daha sonra beyincik (c) seviyesinde bir koronal kesim olun. Dikkatlice bir forseps (d) yardımıyla kafatası kaldırmak, bir bıçak (e) ile iki hemisfer ayırın ve soğuk oksijenli ACSF (f) içine küçük bir kaşık üzerine aktarabilirsiniz. ~ 5 dakika dengelenme sonra yukarı medial yüzeyi (g) kuru doku üzerinde bir yarımkürede yerleştirin. Iki kaşık yardımı ile diensefalon (hj) çıkarın. Kesik çizgi (k) 'da gösterildiği gibi, hipokampus, şu anda görülebilir. Beyaz yapı (lm) olarak görünür, fimbriyalarına başlayarak, bir kaşık ile hipokampus dışarı teşrih. Soğuk ACSF geri hipokampus aktarın. Küçük agaroz-blok, Alveus tarafı konumu iki hipokampi yukarı ve ventral hippocamp hazırlayınbize agar blok kenarına bakacak ve agar (n) için bir iyi tutunmasını sağlar uzağa dikkatlice sıvı ıslatın. Tutkal hipokampus karın kısmı (o) üzerine agar kümesine bağlanır.

figure-results-2
Şekil 2. Hipokampus CA1 bölgesinde-Synaptically uyarılmış Simultane nöronal ve astroglial yanıtları. A) astrositik akımları kaydetmek için Schaffer teminatlar (SC), yama pipet elektrot, etkinleştirmek için uyarıcı elektrot düzenlemesi gösteren hipokampal dilim ve ekstraselüler elektrot, Şema hipokampal SC uyarılması tarafından uyarılmış, fEPSP kaydetmek için CA1 alanı. B) fEPSPs eşzamanlı kayıtları (üst panel) ve uyarılmış Synaptically presenc SC uyarılmasıyla astrositik akımları (alt panel) Temsilcisi izleriFarmakolojik ilaçlar e. Yanıtları ilk GABA eksitatör yanıtları yalıtmak için bir reseptör blokeri (picrotoxin, 100 uM, siyah izleri) varlığında kaydedilir. Bir iyonotropik glutamat reseptör blokeri (kynurenic asit, 5 mM, koyu gri izleri) daha sonraki uygulama, astrositik geçerli yanıt bir küçük ve hızlı geçici bileşeni, maskesini düşürüp fEPSP ve uzun ömürlü Astroglial akımının büyük bir kısmı inhibe Bir glutamat taşıyıcı engelleyicisi (TBOA, 200 uM, açık gri izleri) duyarlı. Ölçek çubuğu, fEPSP 0,1 mV, astrositik mevcut 15 pA, 10 msn. C 1). Toplam akım dan kynurenic asit (2) içinde kalan akım bileşeninin çıkarılması ile B (alt panel, siyah trace) 'de gösterildiği uyarılmış yanıt, izole edilebilir akım astroglial potasyum (1-2), numune izleme ( 1). Ölçek çubuğu, 20 pA, 1 sn. TBOA i çıkarılması ile elde edilen akım glutamat taşıyıcı (2-3), C 2) Örnek izkynurenic asit (2) 'den akım nsensitive yavaş bileşen (3). Ölçek çubuğu, 2.5 pA, 25 msn. D) bir içeriye doğru akım numune izleri voltaj-kelepçe (alt panel) ve SC uyarım ile bir astrosit indüklenen akım kelepçe (üst panel) içinde kaydedilen karşılık gelen membran depolarizasyon kaydedildi. Ölçek çubuğu, 1,5 mV, voltaj-klemp 5 pA, 1 sn akım kelepçe. E) presinaptik elyaf mermileri (giriş) ve (çıkış) toplam astroglial akımı arasındaki ilişkiyi gösteren girdi-çıktı eğrileri SC uyarım (n = 6) yanıt olarak eş zamanlı olarak kaydedilir. Nöronal fEPSP lineer olarak artan lif yaylım ile Astroglial akım artar. F) nöronal yanıt (fEPSP) ve astrositik akım Örnek izleri, 40 milisaniye strok arası aralıklarda eşleştirilmiş-nabız uyarılması için gösterilmiştir. Synaptically-uyarılmış Astroglial güncel sergiler, nöronlar, paired-pulse kolaylaştırma gibi. Ölçek çubuğu, 0,1 mV, 5 pA, 20 msn.

figure-results-3
Şekil 3,. Hipokampusun CA1 ve CA3 alanlarda Synaptically ile uyarılan nöronal ve astroglial yanıtları Çift kayıtları. A) sulforhodamine-B (kırmızı,% 0.1) ve tüm-hücre yama klemp tekniği kullanılarak, floresein dekstran (yeşil,% 0.1) ile dolu bir astrosit enjekte bir CA1 piramidal hücre Rekonstrüksiyonu. Ölçek çubuğu, 10 mikron. B 1) CA1 piramidal hücre ve bitişik bir astrosit akım-kelepçe kaydedilen membran potansiyelleri aynı anda tam hücre kayıtları Temsilcisi izleri. Nöronal aksiyon potansiyeli ateşlemesini (siyah iz), akım darbesi depolarizan 20 pA enjeksiyonu ile uyarılmış, bitişik astrosit (gri iz) hiç tepki uyandırır. Ölçek çubuğu, 20 mV, 10 pA, 100 msn. Akım-cisim bir CA1 piramidal hücre çift tam hücre kayıtları B 2) Numune izlerip ve picrotoxin (100 uM) varlığında, SC uyarıldıktan sonra voltaj-kelepçe komşu bir astrosit. SC stimülasyon (gri iz) küçük ve uzun ömürlü astrositik akımı ile ilişkili bir eksitatör postsinaptik potansiyel (EPSP, siyah iz) çağrıştırıyor. Ölçek çubuğu, 5 mV, 10 pA, 100 msn. C) hipokampal dilim Scheme yosunlu lifler, yama pipet elektrot (gri), astrositik akımları kaydetmek ve ekstraselüler elektrot, etkinleştirmek için, dentat girus (DG) ve CA3 alanlarda uyarıcı elektrot düzenlenmesinde betimleyen CA3 yosunlu liflerinin uyarılması tarafından uyarılmış rekor fEPSP. CA3 fEPSPs eşleştirilmiş kayıtları (üst panel, D 1 ve D2 olarak siyah izleri) ve astrositik tüm-hücre tepkileri (alt panel, D 1 ve D2 olarak gri izleri) CA3 yosunlu tek uyarılması ve D, E) Örnek izleri 0.02 Hz (içerlek yakınlaştırma) (D 1) veya 1 Hz stimülasyon frekansı (D 2) lifleri. D Ölçeği bar 1 ve D 2, 0,2 mV, 15 pA, zaman: D 1 1 saniye; D 2 100 msn. Inset ölçek çubuğu, 0,1 mV, 100 msn.

Tartışma

Synaptically-indüklenen nöronal ve glial cevapların Çift kayıt Astroglial özelliklerinde değişiklikler ilişkili öncesi ve postsinaptik faaliyetlerinde çevrimiçi değişiklikleri incelemek için kullanışlı bir yöntemdir. Synaptically-uyarılmış glial membran depolarizasyon ekstraselüler potasyum presinaptik aksiyon potansiyeli ateşlemesini nedeniyle kısmen artış 8, ama çoğunlukla postsinaptik depolarizasyon 7 doğrudan bir ölçüsüdür. Glial membran potansiyeli dinamik Dolayısıyla kayıt presinaptik uyarılabilir modifikasyonları, postsinaptik aktivitesi, hücre dışı ortamda hacim ve potasyum tamponlama kapasiteleri 6, 8 araştırmak için kullanılabilir. Astroglial glutamat taşıyıcısı güncel sürümü olasılığı 3 kısa vadeli değişiklikler, 5, 9 izlemek mümkün presinaptik glutamat salınımını duyarlı bir önlemdir. Bu ayrıca farklı sinapslarda ya da farklı gelişimsel st fonksiyonel sinaps-glia etkileşimleri karakterize etmek için kullanılır10 yaş. Bu GLTs derece ısıya duyarlı 11 ve Na +, K + ve H +12 elektrokimyasal gradyanı ile tahrik olduğu vurgulanmalıdır. Böylece GLT akımın genliği ve kinetiği çok seçilmiş deneysel koşullara bağlıdır. Buna ek olarak, kaydedilen GLT akım türetilen glutamat astroglial açıklık gerçek zaman süreci kısmen örtülü olduğu bilinmektedir. Bu, bu tür 13 kinetikleri deforme astrositlerin elektrotonik özelliklerini veya asenkron verici salınımlı faktörlerle GLT akımın filtre kaynaklanmaktadır. Filtreleme mekanizmasını geçici özelliklerini çıkarmak yöntemleri geliştirilmiş ve recenly 6,13,14 yaptığı gibi, fizyolojik veya patolojik durumlarda gerçek glutamat boşluk zaman süreci sağlamak için kullanılabilir. Buna ek olarak, astroglial zar depolarizasyon eş zamanlı kayıt, mevcut kelepçe içinde, INSIG sağlayabilirekstraselüler potasyum Transientlerin olası değişiklikler içine hts. Tek astrositler ~ 100 farklı nöron 100.000 sinapsların kadar başvurun, ve bu nedenle entegre yapmak ve yerel nöral ağların aktivitesini modüle.

astrosit tekniği kullanılarak burada sunulan, yani kayıt elektrofizyolojik tam hücreli yanıtları bazal sinaptik aktivite içgörüler kazanmak için, bir Astrositlerde, soma düzeyde yama klemp kayıtları tespit akımlar çoğunlukla hücre soma kaynaklanan izin akılda tutmalı veya proksimal süreçler. Reseptörleri ve çoklu ince süreçlerinde meydana gelen kanalların güçlü aktivasyonu hücre soma yayılmasını akımlar üretebilir Gerçekten, soma tespit akımları yalnızca kısmen ince distal süreçleri kaynaklanır. Böylece sinaptik bölmeleri kapsayan bireysel küçük Astroglial süreçlerinde bazal reseptör ve kanal aktivitesi pek algılanabilir. Bu, kısmen sınırlı dolayı tükürdü olduğuin situ astrosit tam hücre yama klemp kayıtları ile membran akım ve gerilimin ial ve temporal kontrolü. Bununla birlikte, küçük bir miktarda astrositik süreçlerin yüzey soma ve ana süreçlerin diyafram alanı tarafından çok fazla olduğu not edilmelidir. Buna ek olarak, bu perisynaptic astroglial microdomains muhtemel neuroglial iletişim ve sinaptik düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır işlevsel olarak uygun reseptörler ve kanallar içerir. Burada sunulan teknik bu nedenle afference uyarımı esnasında özellikle meydana gelen, nöronal topluluklar ikinci senkron aktivite astrositik entegrasyonu incelemek için oldukça yararlıdır. Bu bazal spontan aktivite sırasında oluşan bireysel sinapslar ve bitişik ince astrositik süreçler arasındaki diyalogu incelemek için kullanılmamalıdır. Bazal sinaptik aktivite ile indüklenen yerel Astroglial cevapları incelemek için alternatif bir yöntem ince süreçlerden yama klemp kayıtları gerçekleştirmek için olduğu gibi d olurdudentritler 15 biridir. Yama bu güzel Astroglial süreçleri büyük olasılıkla kendi küçük boyutu nedeniyle zor olmasına rağmen, muhtemelen Astroglial microdomains ve bireysel sinapslar arasındaki daha samimi iletişim çözülmeye sürdürmeye bir cadde. Elektriksel gürültü yama klemp kayıtları ortalama 3-5 pA ulaşılıncaya beri Ancak, bireysel ince Astroglial işlemler sonucu büyük olasılıkla küçük bir elektrofizyolojik Astroglial yanıtları, eşik algılama altında olabilir. Nöroaktif maddelerin astrositik membran reseptörleri veya taşıyıcıları aktivasyonu intraselüler kalsiyum transientler tetikleyebilir beri sinaptik aktivite Astroglial yanıtları okumak için başka bir yöntem, kalsiyum görüntüleme olduğunu. Ancak, kalsiyum göstergeleri ile astrositlerde toplu yükleme de çoğunlukla bedensel aktivite 16 yansıtıyor olabilir. Elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme kombinasyonu da ya b kendiliğinden oluşan veya tetiklenen, ince Astroglial süreçlerden küçük kalsiyum sinyallerini veriry az sinaptik stimülasyon 17, 18. Ancak, bir düşük afinitesi göstergeleri algılama seviyesinin altında işe yarayabilecek ise yüksek afinite kalsiyum göstergeleri, kalsiyum tamponlar, inhibe önemli kalsiyum sinyal yolakları gibi hareket olabileceğini akılda tutmak gerekir. Son olarak, aynı zamanda tam hücreli patch-klemp sırasında hücre içi sinyal moleküllerinin arınma circumvents ince astrositik süreçlerinde kalsiyum olaylar, çalışma zarif ve non-invaziv tekniği Astrositlerde ifade edilebilen bir membran hedefli kalsiyum sensör kullanarak oluşur in situ, hem de in vivo 19'da olduğu gibi. Tüm-hücre yama klemp kanal ve reseptör aktivasyonu üzerine tetiklenen tüm farklı iyonik akımların hakkında kantitatif bilgi sağlar, oysa Ancak, kalsiyum görüntüleme sadece bir sinyalleşme birçok yer almaktadır molekülü, ancak tüm hücresel aktiviteleri hakkında bilgi sağlayabilir. Nöronlar ve astrosit nedenle eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtlarneuroglial iyonik sinyalizasyon ve rolünü beynin bilgi işleme dinamikleri çevrimiçi çözülmeye benzersiz ve güçlü bir yöntemdir.

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Yazarlar fotoğraf ve sesli-over video post-prodüksiyon için Dana Kamalidenova, Morgan Autexier ve Roch Chopier, video ve animasyonlar yapılmış yanı sıra Florian Beck teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Olympus tarafından desteklenen ve HFSPO (Kariyer Geliştirme Ödülü), ANR (Program Jeunes Chercheurs ve Program Blanc Nörobilim), FRC (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), INSERM ve La Pitié Salpêtrière hastane (Translasyonel araştırma hibeleri tarafından desteklenen JS NR sözleşme), Fransız Araştırma Bakanlığı ve Deutsche Forschungsgemeinschaft doktora sonrası burslar gelen YUKARI ve doktora okul "Yaşam Bilim Frontiers" dan, Paris Diderot Üniversitesi, Bettencourt Schuller vakıf ve FRM (Fondation pour la Recherche MEDICALE) doktora bursu

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Picrotoxin Sigma P1675 DMSO içinde çözülür
Kynurenic Asit Tocris 0223 34 çözünmesi ° C karıştırma veya sonikasyon
DL-TBOA Tocris 1223 DCG IV Tocris 0975

Kaynaklar

  1. Finkel, A., Bookman, R. Chapter 6 The electrophysiology setup. Current protocols in neuroscience. Crawley, J. N., et al. , (2001).
  2. Yuan, Y. A., Atchison, W. D. Elelctrophysiological studies of neurotoxicants on central synaptic transmission in acutely isolated brain slices. Current Protocols in Toxicology. , (2003).
  3. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
  4. Diamond, J. S., Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glutamate release monitored with astrocyte transporter currents during LTP. Neuron. 21, 425-433 (1998).
  5. Luscher, C., Malenka, R. C., Nicoll, R. A. Monitoring glutamate release during LTP with glial transporter currents. Neuron. 21, 435-441 (1998).
  6. Pannasch, U., et al. Astroglial networks scale synaptic activity and plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 8467-8472 (2011).
  7. Poolos, N. P., Mauk, M. D., Kocsis, J. D. Activity-evoked increases in extracellular potassium modulate presynaptic excitability in the CA1 region of the hippocampus. J. Neurophysiol. 58, 404-416 (1987).
  8. Amzica, F., Massimini, M., Manfridi, A. Spatial buffering during slow and paroxysmal sleep oscillations in cortical networks of glial cells in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 1042-1053 (2002).
  9. Diamond, J. S., Jahr, C. E. Transporters buffer synaptically released glutamate on a submillisecond time scale. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 17, 4672-4687 (1997).
  10. Oliet, S. H., Piet, R., Poulain, D. A. Control of glutamate clearance and synaptic efficacy by glial coverage of neurons. Science. 292, 923-926 (2001).
  11. Bergles, D. E., Jahr, C. E. Glial contribution to glutamate uptake at Schaffer collateral-commissural synapses in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 7709-7716 (1998).
  12. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
  13. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2906-2916 (2005).
  14. Scimemi, A., Tian, H., Diamond, J. S. Neuronal transporter regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 18, 14581-14595 (2009).
  15. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature. 1, 1235-1247 (2006).
  16. Reeves, A. M., Shigetomi, E., Khakh, B. S. Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 9353-9358 (2011).
  17. Panatier, A., et al. Astrocytes are endogenous regulators of basal transmission at central synapses. Cell. 146, 785-798 (2011).
  18. Castro, M. A. D. i, et al. Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes. Nature. 14, 1276-1284 (2011).
  19. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nature. 13, 759-766 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Astroglial N ronal Yan tlarSinaptik Kaynakl Ak mlarYama Kenetleme Tekni iAlan Potansiyeli KaydStratum Radiatum AstrositleriGlutamat Al m AnaliziPotasyum Tamponlama De erlendirmesiGliyotransmiter Sal n m l m

İlgili makaleler