Peptid: Epitop-spesifik T-hücrelerinin MHC tetramer bazlı Zenginleştirme

Özet

Epitopa spesifik T-hücrelerinin alçak frekans popülasyonları izole etmek ve akış sitometrisi ile analiz etmek için bunları MHC tetramerleri ve manyetik mikro-küreler: Bu protokol peptit kullanımı açıklanmıştır. Bu yöntem ilgi endojen T hücre popülasyonlarının doğrudan çalışma sağlar In vivo Deneysel sistemler.

Özet

Vivo deneysel modellerde olan adaptif bağışıklık inceleyen araştırmacılar için temel bir gereklilik kendi T hücre antijen reseptör (TCR) özgüllük esas T hücreleri belirlemek için bir yetenek. Pek çok dolaylı yöntemlerle T-hücrelerinin bir yığın nüfus belirli bir antijen ile epitopu özgü T hücreleri proliferasyonu, sitokin üretimi, ya da aktivasyonu ¹ ifadesi olarak işlevsel bir yanıt ölçümü ile tespit edilir ile in vitro uyarılmış olduğu kullanılabilir. Bununla birlikte, bu yöntem sadece birçok olası fonksiyon gösteren bir epitopuna özgü T hücreleri belirlemek, ve saf haberci frekanslarda epitopa spesifik T hücreleri saptamak için yeterli değildir. Popüler bir alternatif, TCR transjenik adoptif aktarım modeli olan bir TCR transjenik fare monoklonal T hücreleri EASI olabilir epitopa spesifik T-hücrelerinin geniş bir haberci nüfus oluşturmak için histocompatible taşıyıcılara yerleştirildiği tohumlanmıştırly bir congenic işaretleyici antikor ^2,3 kullanımı ile izlenir. Güçlü olmakla birlikte, bu yöntem, ^4,5, tek bir epitopu için spesifikliğe sahip olan T hücrelerinin unphysiological frekansı ile ilişkili deneysel eser uğrar. Ayrıca, bu sistem, bir poliklonal popülasyon içindeki epitopa spesifik T hücre klonlarının fonksiyonel heterojen araştırmak için kullanılamaz.

MHC (pMHC) kompleksleri: kazanılmış bağışıklık incelemek için ideal bir şekilde sadece kendi akraba peptid bağlayıcı ile TCR özgüllük ayıran bir yöntem kullanılarak, endojen T-hücresi epitopu repertuarından-spesifik T hücrelerinin doğrudan saptanması içermelidir. PMHC tetramerleri ve akış sitometrisi kullanımı bu ⁶ gerçekleştirir, ancak şu antijen kaynaklı klonal büyüme bulunamadı epitopa spesifik T-hücrelerinin yüksek frekans popülasyonlarının tespiti ile sınırlıdır. Bu protokol, bir pMHC tetramerleri kullanımı ile koordine yöntem ve magnezyum tanımlamaktik hücre zenginleştirme teknoloji fare lenf dokuları ^3,7 son derece alçak frekans epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlamaktır. Bu teknik sayesinde, bir kapsamlı immün yanıtın tüm aşamalarında farelerde endojen T hücrelerinin tamamı epitop özel popülasyonlarda izleyebilirsiniz.

Protokol

1. Lenfoid Doku gelen Hücre İzolasyonu

1. Bir küçük kare ihtiva eden bir 60 mm kültür çanağı, buz cEHAA (EHAA +% 10 FBS, pen / strep, gentamisin, 2 mM L-glutamin, 55 mM 2-merkaptoetanol) ya da diğer eşdeğer T-hücresi orta 1 ml ekleyin buz üzerinde 100 mikron naylon örgü ve yer.
2. Fare Euthanize.
3. Dalak ve mümkün olduğunca çok sayıda kolayca erişilebilir lenf düğümleri kaldırın. Bunlar en az inguinal, aksiller, brakial, servikal ve mezenterik lenf düğümleri içermelidir. Kültür çanak naylon örgü üstüne yerleştirin.
4. Yavaşça püre lenfositler kurtarmak için naylon örgü üzerinde, kapalı bir 1,5 ml mikrofuge'de tüpünün üst kısmı düz lenfoid doku kullanma. Bir süspansiyon içine hücre çalışması için cEHAA ve pipet aşağı ve yukarı başka bir 1 ml ekleyin. 15 ml polipropilen santrifüj tüpünün üst üzerine yerleştirilen naylon örgü başka bir parça ile hücreleri aktarın. Buz cEHAA, po başka bir 1 ml çanak ve örgü durulayınaynı tüp içine miktarlar oling. 4 ml arasında bir nihai hücre süspansiyonu hacmi elde etmek için tekrarlayın.
5. 15 ml'lik bir son hacim için (PBS +% 2 FBS,% 0.05 azid) sıralayıcı soğuk tampon ilave edin ve 4, 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj tüpü ° C.
6. Dikkatli bir şekilde herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak süpernatant aspire. Yaklaşık olarak iki kat daha pelet kendisi ile eşit bir son hacim Fc blok (sıralayıcı tamponu + 2.4G2 antikor) olarak hücre pelet yeniden süspanse edin. Örneğin, saf bir fare dalak ve lenf düğümleri genellikle yaklaşık 100 ul hücre peleti üretir. Bu durumda, 200 ul hacim getirmek için Fc blok 100 ul ilave edin. Hücre topaklanma büyük ölçüde meydana gelmiş ise, dikkatli bir pipet ucu ile bu noktada cep tutam çıkarın.

2. Tetramer Boyama

1. 10 nM (ya da deneysel olarak optimum konsantrasyon) bir son konsantrasyon için PE-veya APC-etiketli pMHC tetramer ekleyin.
2. Mix ve inkübasyonOda sıcaklığında (ya da deneysel olarak optimum süre ve sıcaklığı) 1 saat boyunca te.
3. 15 ml'lik bir hacme kadar soğuk tampon sıralayıcı ekleyin ve 300 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj tüpü Buz üzerinde veya ° C andan itibaren 4 numune tutun.
4. Dikkatli bir şekilde herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak süpernatant aspire. 200 ul son hacim için sıralayıcı tampon içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Çift tetramer zenginleştirme için, 150 ul nihai hacim için tekrar süspansiyon.

3. Manyetik Zenginleştirme

1. Miltenyi anti-PE ya da anti-APC mikroboncuk 50 ul ekle. Çift tetramer zenginleştirme için, her ikisi de 50 ul ilave edin.
2. 4'te karıştırın ve 20 dakika için inkübe ° C
3. 15 ml'lik bir hacme kadar soğuk tampon sıralayıcı ekleyin ve 300 x g'de, 4 ° C'de 5 dakika süreyle santrifüj tüpü
4. Beklerken, bir MidiMACS veya QuadroMACS mıknatıs bir Miltenyi LS manyetik sütun kurdu. Bir açık bir 15 ml polipropilen santrifüj tüpüne yerleştirinsütununun altında doğrudan rafa.
5. O 15 ml tüp içine akabilmesi için, sütunun tepesine sıralayıcı tampon 3 ml ilave edilir.
6. Sütunun üstüne bir 100 mikron naylon örgü kare yerleştirin.
7. Hücreler iplik bitirdiğinizde, dikkatlice süpernatant aspirat ve sıralayıcı tampon 3 ml pelet tekrar süspansiyon haline getirin.
8. Sütunun üst üzerine naylon ağ yoluyla hücre süspansiyonu aktarın.
9. Hücre süspansiyonu tamamen sütun içine boşalttıktan sonra, sıralayıcı tampon başka bir 3 ml'lik tüp orijinal durulama ve sütun içine naylon ağ üzerinden aktarmak tampon, süreç içinde ağ durulama. Naylon örgü atın.
10. Tampon tamamen sütun içine boşalttıktan sonra, kolona sıralayıcı tampon başka bir 3 ml eklenir.
11. 3 x 3 ml yıkama toplam 10 adımı yineleyin.
12. Yeni bir 15 ml polipropilen santrifüj tüpü üzerinde mıknatıs ve yerden sütun çıkarın.
13. T sıralayıcı tampon 5 ml ekleyino sütun.
14. Hemen sütunun üst içine piston takın ve bir sürekli hareket halinde, tüpe kolonu tampon zorlayarak, piston tüm yol aşağı doğru itin.
15. 300 x g'de 5 dakika boyunca yıkandı bağlı fraksiyonu ve akan ilişkisiz bir fraksiyonu, 4 ° C'de santrifüje içeren tüpler
16. Ayrıca herhangi bir sıvı damlacıkları tüpün iki tarafında kalan emin olarak bağlı fraksiyondan süpernatan dikkatlice aspire. Tam olarak 95 ul son hacim için sıralayıcı tampon içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Aspire ve 2 ml arasında bir nihai hacim için bağlanmamış kısmı tekrar süspansiyon.

4. Akış Sitometri

1. Her bir fraksiyonu için, 5 ul kaldırmak ve bir 5 ml FACS tüp içinde sayım boncuk 200 ul (sıralayıcı tampon içinde 200,000 / ml 'lik bir konsantrasyon ile ayarlanmış olarak) eklenir. 4 at kenara ° C analizi için geç. Zamandan tasarruf etmek için, boncuklar deney başlamadan önce etiketli tüpler önceden aliquoted edilebilir.
2. Ben hazırlayınAntikorların aster karışımı hücreleri yüzey işaretleyicileri (Tablo 1) leke. Zamandan tasarruf etmek için, bu deney başlamadan önce yapılabilir.
3. Bağlı fraksiyonu için, tüp içinde hücrelerin ~ 90 ul doğrudan antikor kokteylinin bir doz ekleyin. Bağsız fraksiyonunun analiz istenirse, bir 5 ml FACS tüp için hücre 90 ul aktarımı ve antikor kokteyli bir doz ekleyin.
4. Akış sitometresi için tek renk telafisi denetimlerin paneli yukarı ayarlayın. Kullanılmak üzere her florokrom için, karşılık gelen florokrom ile konjuge anti-CD4 antikoru ile bir 1 ul FACS 5 ml tüp içinde kalan bağsız fraksiyonu hücreleri 50 ul ilave edilir. Bunun yanı sıra bir boyanmamış kontrol ayarlamayı unutmayın.
5. Girdap ve 4, 30 dakika için tüm örnekler inkübe ° C
6. 300 xg 5 dak, 4 ° C 'için her bir tüp ve santrifüj ile sıralayıcı tampon 5 mL
7. Bağlı fraksiyonu için, tampon dikkatlice sıralayıcı 200 ul süpernatan aspire hücreleri ve tekrar süspansiyonfer. 1.2 ml FACS mikrotüp içine hücreleri aktarın. Aynı mikrotüp içine sıralayıcı tampon ve havuz başka bir 200 ul ile tüp durulayın. Hücre kümeleri açık ise, bir 50 um filtre aracılığıyla hücre geçmektedir.
8. Ilişkisiz fraksiyonu ve tazminat kontrolleri, süzün veya supernatant ve tekrar süspansiyon 2 ml sıralayıcı tampon aspire için.
9. Tek renk telafisi kontrollerini kullanarak akış sitometresi ayarlayın. Kaydedilecek ek bir parametre olarak yan dağılım genişliği (SSC-W) seçin.
10. Şekiller 1 ve 2 de gösterildiği gibi, + ya da CD8 + T hücreleri CD4 belirlemek için ardışık içerme bir geçitlerinin dizisi kullanılarak boyanan numuneler analiz edin. Bağlı kesirler için, yukarı 2.000.000 toplam etkinlik azami mümkün olduğunca çok sayıda hücreleri toplamak. Ilişkisiz kesirler için, 1.000.000 toplam etkinlik toplamak. Alma hızı saniyede etkinliklerde veya 3000 altında tutun.
11. Aynı makine ayarları kullanarak, sayma boncuk örnekleri analiz. 10,000 toplam etkinlik toplayın.
12. FCS dosyaları gibi tüm verileri kaydedin.

5. Veri Analizi

1. FlowJo yazılımı kullanarak sayma boncuk örnekleri için FCS veri dosyalarını analiz edin. Plot ileri FITC ile saçılım ve (Şekil 1 ve 2) sayma boncuklar Kottbusser bir kapı ayarlayın. Her bir numune içinde tespit edilen boncuk sayma sayısını belirler. Toplanan hücre olayların sayısını belirlemek için toplanan olayların toplam sayıdan çıkart.
2. Kutu 1'de denklemler kullanılarak her bir örnek tüm hücrelerinin toplam sayısını hesaplayın.
3. Lekeli ilişkili ve ilişkisiz fraksiyonu örnekleri için FCS veri dosyalarını analiz edin. Lenfoid +, yan genişlik ^{dağılım-lo,} dökümü-, CD3 +, CD4 + ya da CD8 +, tetramer Şekiller 1 ve 2 de gösterildiği gibi, her bir numune içinde + T hücreleridir. Belirlemek için ardışık içerme kapıları bir dizi ayarlama
4. CD4 tanımlamak için kullanılan içerme kapılarının her biri sıklığı + tetramer göre örnek bir hücre toplam sayısı çarpma+ Ya da CD8 + tetramer + hücreleri epitopu özgü T hücreleri (Kutu 1) toplam sayısını hesaplamak için kullanılır.

Sonuçlar

Şekil 2'de daha önceden ilgili peptid + CFA ile bağışık hale getirilen farelerin için temsilci veriler göstermektedir iken Şekil 1, saf farelerden alınan pMHCII tetramer zenginleştirilmiş dalak ve lenf düğümü numuneleri için temsili akış sitometrisi parselleri göstermektedir. Seri yolluk CD4 analizi + T hücre popülasyonlarının gelen autofluorescent ve diğer istenmeyen olaylar kaldırır. CD8 + T hücre populasyonunun CD4 pMHCII tetramer boyama + T hücreleri için kullanışlı bir iç negat...

Tartışma

Bu protokol tarafından sunulan pMHC tetramer tabanlı cep zenginleştirme yöntemi endojen T hücre çizgilerinden epitop-spesifik T hücreleri incelemek için güçlü bir araçtır. PMHC tetramerleri kullanımı, doğrudan doğruya aynı kökten gelen pMHC ligandlar bağlamak için kendi TCRS yeteneğine dayalı epitopa spesifik T hücrelerin saptanması sağlar. Zenginleştirme antijen-spesifik T hücrelerinin çok nadir topluluğunun, genetik ya da haberci frekans herhangi bir düzenlemesi olmadan T hücrelerinin endojen çizgilerinden tespit edil...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Bayilik Katalog numarası
PE veya APC konjuge pMHC tetramer (veya multimer)	NIH tetramer çekirdek elde, araştırmacı tarafından yapılmış, ya da ticari kaynaklardan satın
Anti-PE konjuge manyetik mikroboncukları	Miltenyi	130-048-801
Anti-APC konjuge manyetik mikroboncukları	Miltenyi	130-090-855
LS manyetik sütunlar	Miltenyi	130-042-401
MidiMACS veya QuadroMACS mıknatıs	Miltenyi	130-042-302 veya 130-090-976
Hücre sayımı boncuk	Yaşam Teknolojileri	PCB-100