E4orf4 Bağlı Hücre Ölümü üzerine Nakavt Etkilerinin Gen Ekspresyonu ve Ölçüm Şartlı Nakavt için Hücre hatları hazırlanması

Summary

E4orf4 ile uyarılan hücre ölümüne ACF kromatin yeniden faktör katkı ölçüldü. Protokol doksisiklin tedavi ACF alt birimleri ACF1 ve SNF2h koşullu devirme neden olduğu hücre klonlarının seçimi içermektedir, ve indüklenebilir hücre hatlarında E4orf4 ile uyarılan hücre ölümü ölçmek için DAPI tahlil kullanımı.

Abstract

Memeli hücrelerinde gen ekspresyonu Fonksiyonel inaktivasyonu çeşitli yollar ^1,2 ilgilendiren bir protein katkı çalışma için çok önemlidir. Kurucu zaman devirme ^3-5 uzun bir süre için hücreler tarafından iyi tolere edilmez Bununla birlikte, gen ekspresyonunun şartlı devirme durumlarda gerekir. Burada ACF kromatin remodeling faktör altbirimden koşullu knockdown izin hücre hatlarının hazırlanması için bir protokol açıklar. Bu hücre hatları adenovirüs E4orf4 proteini tarafından ⁶ hücre ölümü indüksiyonu için ACF katkısının belirlenmesi kolaylaştırmak. ACF kromatin yeniden faktörü ACF1 ve SNF2h alt birimleri için kısa firkete RNA kodlayan diziler aynı zamanda neomisin direnç geni için bir geni içeren bir plazmid içinde bir doksisiklin-indüklenebilir promotör yanında klonlandı. Neomisin dirençli hücre klonları izole edilmiş ve G418 varlığında seçilmiştir. Sonuçta elde edilen hücre hatları ile uyarıldığındadoksisiklin tedavi, ve bir kez ACF1 SNF2h ya da ekspresyon düzeyleri azalmıştır, hücre bir plazmid kodlama E4orf4 veya boş vektör ile transfekte edildi. ShRNA yapıların belirli etkisini teyit etmek için, ACF1 veya SNF2h protein seviyeleri sessiz mutasyon dahil edilmesi ile shRNA karşı dirençli hale getirildi ifade eden bir plasmidin ACF1 veya SNF2h ile kotransfeksiyonu ile WT düzeylerine geri alındı. Çeşitli örneklerde hücre ölümünü teşvik etmek için E4orf4 yeteneği transfekte edilmiş bir hücre popülasyonunda apoptoz morfolojiye sahip çekirdeklerin görünüm frekans ^7-9 ölçüldüğü bir DAPI tahlil ile belirlenmiştir.

Yapıcı devirme hücre öldürücü olabilir burada açıklanan protokol durumlarda bunların protein partnerleri tarafından hücre ölümü indüksiyonu için çeşitli proteinlerin işlevsel katkı belirlenmesi için kullanılabilir.

Protocol

1. Indüklenebilir Hücre Hatları Üretimi

1. İstenen bir hücre hatlarının hazırlanması için kullanılan tüm hücreleri öldüren ilaç G418 asgari konsantrasyonu bulmak için gereken deney öncesinde. Bu amaç için, deney sırasında kullanılan ve G418 artan konsantrasyonlarda (her bir ml için 0-1.000 mg) eklemek olacaktır ortam içinde konfluense% 70 az birkaç çift plaka plaka içinde tercih edilen hücreler. Etkin bir şekilde hücrelerini öldürür en az G418 konsantrasyonunu belirlemek için günlük hücreleri izler. Hücre ölümüne, 3-7 gün içinde görülmüştür.
2. Bu shRNA ifade plazmidi üzerinde çalışılan genin ekspresyonu için bir ölçüde azaltabilir geçici transfeksiyon....

Discussion

Belirli gen ekspresyon Nakavt düzenleyici yolaklar bir protein katkısı soruşturma için önemli bir yaklaşımdır. Elzem genlerin ifade bünye knockdown olumsuz hücre çoğalmasını etkiler bu yana, yaptıkları çalışmada geçici siRNA'lar giriş veya sabit koşullu devirme sistemleri uygulama ya gerektirebilir. Burada tarif shRNAs bir ilaca bağlı ifade etme yeteneğine sahip kararlı hücre çizgileri üretimi, bir çok hücre hatları etkili olmayabilir geçici Transfeksiyonlar üzerinde bir avantaj sağlar, ve tekrarlanan bir hazırlık g.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Yüksek glukoz DMEM	Gibco	41965
Tet sistemi onaylı FBS	Clontech	631106
L-glutamin	Gibco	25030
Kalem Strep	Gibco	15140
% 0.25 tripsin-EDTA	Gibco	25200
T-Rex-293 hücreleri	Invitrogen	R710-07
G418	Sigma	A1720
blasticidin	InvitRogen'a	R210-01
plazmid pSuperior.neo + GFP	OligoEngine	VEC-PBS-0007/0008
jetPIE	Polyplus transfeksiyon	101-40
doksisiklin	Sigma	D9891
paraformaldehid	Elektron Mikroskopi Bilimleri	15710
4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Sigma	D9542
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01