Hızla ve tamamen retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbinden hücresel bileşenleri kaldırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, çoklu klinik uygulamalarda kullanım için potansiyele sahip bir site spesifik kardiyak ekstraselüler matriks iskele verir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü
Bu makalede
Özet
Özet
Büyük ölçüde iskele yerli mimarisi koruyarak Perfüzyon tabanlı tüm organ decellularization son zamanlarda, siteye özgü ekstraselüler matriks iskelelerinin oluşturmak için bir araç olarak doku mühendisliği alanında ilgi kazanmıştır. Bugüne kadar, bu yaklaşım, kalp, akciğer, karaciğer ve 1-5 de dahil olmak üzere, organ sistemlerinin çeşitli kullanılmıştır. Kolay erişilebilir bir damar ağı olmadan dokuların Önceki decellularization yöntemleri deterjanlar, asitler veya çevredeki ekstraselüler ortamda 6-8 hücresel ve nükleer bileşenleri kaldırmak için bir araç olarak enzimatik tedavi çözümleri doku uzun süre maruz başvurmuşlardır. Bununla birlikte, çözeltilerin yeteneği bu yöntemlerin menteşeli etkinliğini difüzyon yoluyla doku nüfuz. Buna karşılık, doğal damar sistemi aracılığıyla organ perfüzyon etkili bir difüzyon mesafe ve decellularizati kolaylaştırılmıştır taşıma azaltılmışdoku dışarı doku ve hücresel bileşenlerine ajanlardır. Bu yazıda, tam koroner retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbi decellularize için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol bozulmamış kalp üç-boyutlu bir yapıya sahip bir tam decellularized kardiyak hücre dışı matris (ECM c) iskele elde edilmiştir. Önerilen yöntem, enzimler, deterjan ve hücre lisisi ve çıkarmaya yardım etmek için hipertonik ve hipotonik durulama ile birlikte asit dizisi kullanılır. Protokol hücresel malzeme çıkarmaya yardım etmek için Triton X-100 ve sodyum deoksikolatın çözümler ardından matris hücreleri ayırmak için bir tripsin çözelti kullanılmıştır. Açıklanan protokol, aynı zamanda daha büyük 2 L / uzun süre için min perfüzyon hızlarını kullanır. Hücresel enkaz kirlenme olmadan dokuya ajanlar taşıma izin ve çözüm değişiklikler ile birleştiğinde yüksek debi, doku durulama etkili sağlanmalıdır. Burada tarif edilen yöntem nati tüm nükleer malzeme ayrılmıştırçeşitli uygulamalar için kullanılan bir site-spesifik kardiyak ECM iskele oluşturarak, domuz kardiyak doku ve.
Protokol
1. Doku Hazırlanması ve Deney Kurulumu
- Hemen bir mezbaha veya araştırma tesisi ötanazi sonra ve aşırı kan durulayın Hasat domuz organdır. Atrium ve aorta sağlam tutmak, aşırı yağ ve doku kalp kesin. Uzaklıkta aortadan pulmoner arter ayırmak için yağ kesin. Dokusunda herhangi bir kesik varsa, uygun atın.
- Dondurucu kağıt ayrı ayrı her kalp sarın ve tam donma sağlamak için en az 24 saat için -80 ° C derin dondurucuda tüm doku saklayın.
- Zaman kullanımı (genellikle 3 aydan daha az), gecede 4 ° C'de 4 L beher batık Tip 1 su çözülme biri sağlam dondurulmuş domuz kalbi hazır
- Kalbi tamamen çözülmüş sonra, kalp kurulayın kalp tartma....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bütün domuz kalpleri üzerinde decellularization etkisi doğal boyutunda farklılıklar, baskılar ve damar düzenleme nedeniyle değişir. Bu nedenle, elde edilen hücre dışı matris iskelelerinin tam kompozisyon kalp kalp ile aynı olmaz. Açıklanan protokol tamamlanması hücresel malzeme kaybı gösteren beyaz ya da yarı saydam görünür bir kalp ortaya çıkarır. Ancak, yaygın bir doku bir kaç daha fazla kantitatif parametreleri 8 kombinasyonuna dayalı "decellularized" kabul edilebilir olduğu kabul edilmektedir. B.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Çalışmada domuz kalp tutarlı ve verimli decellularization için metodoloji açıklanmalıdır. Protokol, daha önce yayımlanan bir raporunda, 1 bir değişiklik oldu ve daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar elde akışına uzun pozlama ve artan basınç, dahil. Çıkan decellularized doku doku 2 başarılı decellularization için yayınlanmış tüm ölçütleri bir araya geldi. Sık çözüm değişikliklerin doku hücresel materyalin yeniden yerleştirilmesi sınırlamak için yapılmıştır ve her decellularization maruziyet süresi ECM.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Gilbert çalışma yapılmakta idi ise ACell, Inc Bilimsel Danışma Kurulu, ve son zamanlarda Araştırma ve Geliştirme Başkan Yardımcısı oldu. ACell, Inc mesane matrisi satıyor ve bu çalışmada hiçbir ticari çıkarı vardır.
Teşekkürler
Yazarlar Brogan Konuk, Michelle Weaver, ve Kristen Lippert kabul etmek istiyorum. Bu çalışma için Fon NIH Grant R03EB009237 yanı sıra, National Biomedical Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü T32HL076124-05 NIH Eğitimi Teşvik T32EB001026-06 ile sağlanmıştır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif / Malzeme Adı | Şirket | Katalog Numarası | Yorumlar |
| Tripsin | Gibco | 15090 | |
| EDTA | Balıkçı | BP120-500 | |
| NaN 3 | Sigma | S2002-500G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 10X PBS | Balıkçı | BP399-20 | |
| Sodyum deoksikolatın | Sigma | D6750-500G | |
| Perasetik Asit | Pfaltz ve Bauer | P05020 | 35% CAS # 79-21-0 |
| Etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Masterflex Pompa Tahrik | Cole Parmer | SI-07524-50 | |
| Masterflex Boru | Cole Parmer | 96400-18 | Boyutu 18 |
| Dikenli Redüktör | Cole Parmer | EW-30612-20 | |
| 4L Beaker | Fisher Scientific | 02-540T |
Kaynaklar
- Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16, 927-933 (2010).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med<....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
