Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

Nathaniel T. Remlinger; Peter D. Wearden; Thomas W. Gilbert

doi:10.3791/50059

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

23.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50059

⸱

6 Aralık 2012

Nathaniel T. Remlinger¹^,² , Peter D. Wearden¹^,³ , Thomas W. Gilbert¹^,²^,³^,⁴

¹McGowan Institute for Regenerative Medicine, ²Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, ³Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, ⁴Department of Surgery, University of Pittsburgh

Bu makalede

Özet

Hızla ve tamamen retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbinden hücresel bileşenleri kaldırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, çoklu klinik uygulamalarda kullanım için potansiyele sahip bir site spesifik kardiyak ekstraselüler matriks iskele verir.

Özet

Büyük ölçüde iskele yerli mimarisi koruyarak Perfüzyon tabanlı tüm organ decellularization son zamanlarda, siteye özgü ekstraselüler matriks iskelelerinin oluşturmak için bir araç olarak doku mühendisliği alanında ilgi kazanmıştır. Bugüne kadar, bu yaklaşım, kalp, akciğer, karaciğer ve ^1-5 de dahil olmak üzere, organ sistemlerinin çeşitli kullanılmıştır. Kolay erişilebilir bir damar ağı olmadan dokuların Önceki decellularization yöntemleri deterjanlar, asitler veya çevredeki ekstraselüler ortamda ^6-8 hücresel ve nükleer bileşenleri kaldırmak için bir araç olarak enzimatik tedavi çözümleri doku uzun süre maruz başvurmuşlardır. Bununla birlikte, çözeltilerin yeteneği bu yöntemlerin menteşeli etkinliğini difüzyon yoluyla doku nüfuz. Buna karşılık, doğal damar sistemi aracılığıyla organ perfüzyon etkili bir difüzyon mesafe ve decellularizati kolaylaştırılmıştır taşıma azaltılmışdoku dışarı doku ve hücresel bileşenlerine ajanlardır. Bu yazıda, tam koroner retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbi decellularize için bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol bozulmamış kalp üç-boyutlu bir yapıya sahip bir tam decellularized kardiyak hücre dışı matris (ECM c) iskele elde edilmiştir. Önerilen yöntem, enzimler, deterjan ve hücre lisisi ve çıkarmaya yardım etmek için hipertonik ve hipotonik durulama ile birlikte asit dizisi kullanılır. Protokol hücresel malzeme çıkarmaya yardım etmek için Triton X-100 ve sodyum deoksikolatın çözümler ardından matris hücreleri ayırmak için bir tripsin çözelti kullanılmıştır. Açıklanan protokol, aynı zamanda daha büyük 2 L / uzun süre için min perfüzyon hızlarını kullanır. Hücresel enkaz kirlenme olmadan dokuya ajanlar taşıma izin ve çözüm değişiklikler ile birleştiğinde yüksek debi, doku durulama etkili sağlanmalıdır. Burada tarif edilen yöntem nati tüm nükleer malzeme ayrılmıştırçeşitli uygulamalar için kullanılan bir site-spesifik kardiyak ECM iskele oluşturarak, domuz kardiyak doku ve.

Protokol

1. Doku Hazırlanması ve Deney Kurulumu

Hemen bir mezbaha veya araştırma tesisi ötanazi sonra ve aşırı kan durulayın Hasat domuz organdır. Atrium ve aorta sağlam tutmak, aşırı yağ ve doku kalp kesin. Uzaklıkta aortadan pulmoner arter ayırmak için yağ kesin. Dokusunda herhangi bir kesik varsa, uygun atın.
Dondurucu kağıt ayrı ayrı her kalp sarın ve tam donma sağlamak için en az 24 saat için -80 ° C derin dondurucuda tüm doku saklayın.
Zaman kullanımı (genellikle 3 aydan daha az), gecede 4 ° C'de 4 L beher batık Tip 1 su çözülme biri sağlam dondurulmuş domuz kalbi hazır
Kalbi tamamen çözülmüş sonra, kalp kurulayın kalp tartmak ve ağırlığı kaydetmek. Bir pazar kilo domuz kalbi yaklaşık 375-450 g tartmak gerekir.
Bir dikenli redüktör ¼ "sonuna kadar boyutu 18 Masterflex hortumu bağlayın. Dikenli redüktör yerleştirin veaort içine hortum. Sadece brakiyosefalik gövde altındaki Sıra 2 hortum kelepçeleri veya aort etrafında güvenli zip bağları,. Redüktör ve hortum aort kapak üzerinde kalmalıdır, koroner arterler (Şekil 1) perfüze böylece.
Tip I su boruları doldurmak için 30 ya da 60 ml şırınga kullanın. Onun yaklaşık orta noktasında bir Masterflex silindir pompa kartuş içinde tüp yerleştirin. Akış 2.5 L su ile doldurulmuş bir 4 L ölçeğinin alt boru ucu ve boru güvenli daldırmak.
Su ile doldurulmuş behere kalp ve hava kabarcıklarını çıkarmak için pompayı yerleştirin. Kabarcıklar tüp eklenen aort gelen gözlenirse, aort ilave bağları ile yerleştirilmesi veya temin edilmesi gerekebilir. Hava geçirmez bir mühür decellularization işlemi (Şekil 2) sırasında yeterli basınç sağlamak için önemlidir.
% 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN 3 L içeren 4 L kabı yerleştirinPlaka karıştırın ve 37 ısıtın üzerine ° C decellularization sürecinin hazırlanmasında 3 çözüm.

2. Doku durulamak

Doğru boru boyutu seçilir sağlanması, 400 ml / dak 'lık bir akış oranı ile pompa ayarlayın. 15-25 dk Ben su yazın ile kalp yıkayın. Pompa çalışmaya başladığında, kalp şişer ve karıncıklar kan dökmek gerekir. Taze çözelti her 5-10 dakikada ikame edilmiş, ya da kalp kaldırılır kan miktarına dayalı olarak gerek yoktur. Kan kalp effused ise, gerekli olduğu gibi tüp ve kelepçeler ayarlayın.
Pompa durdurun ve 2X Fosfat dolu ayrı bir behere kalp aktarmak Salin (PBS) Tamponlanmış. Boru çözelti içine daldırılmış sonra, pompa ve 700 ml / dk 'ya kadar akış oranını artırmaktadır. Kalp çözümü her 5 dk değişen, 15 dakika için çözüm kalmalıdır. Her çözüm değişim doku ve boru hareket ederken geçici olarak kesilmelidir pompa gerektirirYeni behere.
10 dakika boyunca bir su tipi ve 750 ml / dakika akış hızı ile artmaya kalp aktarın.

3. Decellularization ve Çözüm Perfüzyon

37 NaN ₃ 0.2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% içeren behere kalp aktarın ° C. 1.200 ml / dk pompa hızını artırın ve pompa başlar. Beher içinde çözelti sirküle beher altına yerleştirilmiş bir karıştırma çubuğu kullanın. Kalp üç saat olmak üzere toplam 37 ° C'de% 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ çözüm kalmalıdır. 1 saat sonra, 1.500 ml / dk pompa hızını artırın. Ek bir saat sonra, 1.800 ml / dk pompa hızını artırın. Doku yavaş koşulu doku artmış perfüzyon hızları tabi ve damarların yırtılması önlemek edilir. Kalp protokolün bu adımı sırasında boyutu şişer ve neredeyse çift olacaktır. Doku inci boyunca atriyumlar apekse ilerliyor, doğal rengini kaybedere protokolü (Şekil 3).
Her çözüm perfüzyon sonra durulama iki adım hücresel enkaz, kimyasal kalıntı ve yardım hücre lizis kaldırmak için yapılır. Her durulama bir 10 dakika oluşan bir 10 dakika, ardından oda sıcaklığında su 2X PBS çözeltisi ile durulama Tip durulama. Her bir yıkama durulama çözüm, ekleme ve batık kalp içeren deney şişesi içinde dolaşan perfüzat, ilk kaptan çıkarılmasını çözelti oluşur. Ardından% 0.2 Trypsin/0.05% EDTA/0.05% _NaN3 çözeltisi ardından, perfuse 1,900 ml / dakika, su ve 1950 ml / dk 'da PBS 2X serpmek.
% 3 oda sıcaklığında, Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% _NaN3 ihtiva eden bir çözeltiye kalp aktarın. 2.000 ml / bir saat dakika ve perfuse çözüm pompa hızını artırın. Kaptan çözüm çıkarın ve taze solüsyon ile değiştirin, 2100 ml / dk pompa hızını artırmak, ve ek bir buçuk saat için taze solüsyon serpmek, toplam zamanı getirerek3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ 2.5 hr.
2180 ml / 10 dk için her bir dakikada 2150 ml / dakika ve 2x PBS de Tip I su içinde doku durulayın.
Oda sıcaklığında, bir% 4 Sodyum deoksikolatın çözeltisine kalp aktarın. 2.200 ml / dk ve 3 saat süreyle perfuse çözüm pompa hızını artırın.
De Tip I su içinde doku durulayın ve 2x PBS 2.200 her bir çözelti için 5-10 dakika sonra çözüm değişen 15 dakika her biri için, ml / dakika. Açıklanan perfüzyon adımları iki kez durulayın adımı gerçekleştirdikten ve 4 ° C gecede ekli boru ile kalp depolayarak birden fazla gün içinde bölünmüş ve Tip I suya sokulmasına olabilir.
Ertesi gün, 5 dakika ml / dk 1,500 1X PBS ile durulayın, 5 dakika, ardından 750 ml / dk hızla Tip I su ile durulama gerçekleştirmek. Bu protokol daha sonra uygun bir solüsyon içinde tarif akış hızında devam edilebilir.

4. Dezenfeksiyon ve Nihai İşleme

% 0.1 'lik perac için kalp aktarınetic asit / 2,200 ml / dk 'da% 4 etanol ve çözelti 1.5 saat için çözelti perfuse.
Doku için son çalkalamalar hepsi 2,200 ml / dk 'da gerçekleştirilir. Tip I su içinde iki yıkamadan 5 dakika, ardından 15 dk için 1X PBS ile doku serpmek. Durulama Bu bir dizi çözüm perfüzyon işlemi tamamlamak için bir kez daha tekrar edilir.
Pompayı kapatın ve kalp boşaltmak için çözüm kalp çıkarın. Aortadan bağları kes, tüm tüp kaldırın ve 1 saat boyunca boşaltmak için boş bir behere kalp yerleştirin. Aşırı sıvı periyodik tahliye edilmesi gerekir. Tam kalp (Şekil 4) boşaltmak için bir emici ped üzerine kalp yatırın.
Su en kaldırıldıktan sonra, kardiyak hücre dışı matris (C-ECM) ağırlığını kaydedin. Kalp decellularization işlemi sırasında iç ağırlığının yaklaşık olarak% 20-25 kaybetmeye beklenebilir.
Sağ ve sol ventrikül, hem de DNA quantificati için ventriküler septum teşrihve histolojik işlem sırasında doku tam decellularization (Şekil 5) teyit etmek için.
Liyofilizasyon önce en az 2 saat süreyle -80 ° C'de C-ECM dondurun.