Astrositler normal beyin gelişimi ve işlevi, ve merkezi sinir sistemi onarımı için gerekli olan temel biyolojik süreçler katılan yönlü hücreler olduğu kabul edilmiştir. Burada santral sinir sistemi hücrelerinin bu büyük sınıf biyoloji eğitimi saf fare astrosit kültürleri elde etmek için hızlı bir prosedürdür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Kortikal astrositlerde İzolasyon ve Kültür
Bu makalede
Özet
Özet
Astrositler memeli beyin içinde bol bir hücre tipi, henüz çok moleküler ve işlevsel özellikleri öğrendik gerekmektedir. Astrosit in vitro hücre kültürü sistemlerinde detaylı olarak bu glial hücrelerin biyolojik fonksiyonları incelemek için kullanılabilir. Bu video protokol fare yavrular karışık kortikal hücrelerin izolasyonu ve kültürü ile saf astrositler edinme gösterir. Yöntem, canlı nöronların ve astrositlerin yokluğunda, oligodendrosit ve mikroglia, kültür içinde merkezi sinir sistemi üç ana glial hücre popülasyonları, ayrılmasına dayanır. Kültürün ilk günlerinde Örnek görüntüleri karışık bir hücre popülasyonunun varlığına göstermek ve astrositler konfluent haline ve mikroglia ve oligodendrosit ayrılmalıdır zaman timepoint göstermektedir. Ayrıca, saflık ve iyi kurulmuş için immünohistokimyasal boyamalar kullanarak kültürlü astrositlerde astrositik morfolojisi göstermek veYeni astrosit belirteçler nitelendirdi. Bu kültür sistemi kolaylıkla astrosit biyolojinin çeşitli yönlerini araştırmak için saf fare astrosit ve astrosit-şartlı ortam elde etmek için de kullanılabilir.
Giriş
Astrositler merkezi sinir sistemi (MSS) bir çok bol hücre tipi vardır. İnsanda korteksin 1 nöron başına 1,4 astrositler vardır oysa nöronlara astrositlerde oranı, fareler ve sıçanların kortekste 01:03 olduğunu. Astrosit fonksiyonu ilgi son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. Astrositlerde bir anahtar işlevi nöronlar 2,3 yapısal ve metabolik destek sağlayarak onların rolüdür. Astrositlerin Yeni keşfedilen rolleri işlevleri geniş bir yelpazesini kapsar. Bu gelişim 4-6 esnasında gelişen aksonlar ve bazı nöroblast göç rehberlik, sinaptik iletim fonksiyonları, nöral devreleri 7-9 ile sinaps gücü ve bilgi işleme, kan-beyin bariyeri....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Karışık Kortikal Hücre İzolasyonu ve Kaplama
Astrosit kültürleri için Karma kortikal hücre izolasyonu P4 fare yavruları P1 kullanılarak yapılabilir. Uygun astrosit yoğunluğu elde etmek için, her iki T75 doku kültürü şişesi başına 4 fare korteksi pup kullanmak gereklidir. Bu nedenle, aşağıdaki protokol miktarlar 4 fare yavru kullanarak bir hücre hazırlama için hesaplanmıştır.
- Diseksiyon işlemine başlamadan önce, kültür ortamı astrosit prewarm 30 ml (DMEM, yüksek glikoz +% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu +% 1 penisilin / streptomisin; tabloya bakınız) 37 ° C'ye kadar 37, 1 saat boyunca hücre kültür dereceli ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tam fare beyin (Şekil 1A), serebellum ve olfaktor (Şekil 1B) kaldırılması gerekir izolasyonu üzerine. Korteksleri fare beyin sapı (Şekil 1C) ve bireysel korteks (Şekil 1D ') arasında menenjlerin soyulmuş özenle (Şekil 1E) kaldırılır. Meninksler meningeal arter sistemi ve meningeal hücreler ve fibroblastlar tarafından nihai astrosit kültür kirlenmesine eksik kaldırma sonuçları ortada.
Mikst kortikal hücre.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada belirtilen yöntem, ilk olarak 1980 de 27 McCarthy ve De Vellis tarafından tarif kemirgen neonatal beyin gelen astrosit kültür hazırlanması dayanmaktadır. Postnatal P1 P4 fare beyin kortikal astrositlerde izolasyonu ve kültür modifiye metodu Burada sunulan, verimleri saf primer astrosit hızlı ve son derece tekrarlanabilir olduğunu. Bu teknik kolaylıkla böyle sıçan veya domuz ve böyle omurilik gibi diğer beyin bölgelerinden gibi diğer türler, gelen astrositler yalıtmak için transfer edilebilir. McCarthy .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
SS, KB ve Avrupa Komisyonu FP7 Hibe PIRG08-GA-2010-276989, NEUREX için Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (BMBF 01 EO 0803), ve / Alman Araştırma Vakfı Hibe scha 1442 için Fazit Vakfı Lisansüstü bursu tarafından desteklenir CS 3-1 yazarlar çakışan mali çıkarları var.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Çalışma solüsyonu Adı | Şirket | Katalog numarası | Nihai konsantrasyon |
| Astrosit kültür besiyeri | |||
| DMEM, yüksek glukoz | Yaşam Teknolojileri | 31966-021 | |
| Isı inaktive FBS, | Yaşam Teknolojileri | 10082-147 | Nihai konsantrasyon:% 10 |
| Penisilin-Streptomisin | Yaşam Teknolojileri | 15140-122 | Nihai konsantrasyon:% 1 |
| Beyin dokusu kazmak için Çözümestion | |||
| HBSS | Yaşam Teknolojileri | 14170-088 | |
| % 2.5 tripsin | Yaşam Teknolojileri | 15090-046 | Nihai konsantrasyon:% 0.25 |
| Diğer | |||
| % 70 (hacim / hacim) etanol | Roth | 9065.2 | |
| Poli-D-Lizin | Millipore | A-003-E | 50 mg / ml |
| Su | PAA | S15-012 | hücre kültürü notu |
| PBS | PAA | H15-002 | hücre kültürü notu |
| 0.05% deneyinpsin-EDTA | Yaşam Teknolojileri | 25300-062 | |
| 0.45 mikron Steril filtre | Sartorius | 16555 | |
| 3,5 cm petri | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tüp | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tüp | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm 2 doku kültürü şişesi | BD Falcon | 353136 | |
| Forseps, ince | Dumont | 2-1032, 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forseps, düz meme | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm cerrahi makas | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomikroskopta | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomikroskopta + Kamera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Mikroskop + Kamera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Santrifüj | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Çalkalayıcı | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | Maxq 4450 |
| Su banyosu | JULABO | SW20; 37 ° C |
Kaynaklar
- Nedergaard, M., Ransom, B., Goldman, S. A. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 26, 523-530 (2003).
- Belanger, M., Allaman, I., Magistretti, P. J. Brain energy metabolism: focus on astrocyte-neuron metabol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
