Method Article

Testis Hücre Cezalı Hazırlanması için basit ve Verimli Tekniği

DOI:

10.3791/50102

⸱

August 4th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), 2Servicio de Citometría de Flujo y Clasificación Celular (SECIF), Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Enzimler ve deterjan kaçınarak kemirgen malzemeden testis hücre süspansiyonları, mekanik hazırlanması için bir yeni protokol tarif edilmektedir. Yöntem çok basit, hızlı, tekrarlanabilir ve akış sıralama ve RNA ekstraksiyon için uygun kaliteli hücre süspansiyonları, vermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli testis somatik testis hücreleri ve eşey hücrelerinde farklı aşamalarında dahil olmak üzere 30 farklı hücre tipleri, içeren çok karmaşık organlardır. Bu heterojenlik sperm gelişimi belirli aşamalarında saf ya da zenginleştirilmiş hücre popülasyonlarının en moleküler analizler 1 için gerekli olduğu gibi, memeli spermatogenez üsleri, çalışmaları ile ilgili önemli bir sorun var.

Bu Staput 2,3, santrifüj elutrasyon 1, ve akış sitometri gibi çeşitli stratejileri (FC) 4,5 diferansiyel gen ekspresyon çalışmaları sağlamak amacıyla zenginleştirilmiş ya da saflaştırılmış testiküler hücre popülasyonlarının elde etmek için kullanılmıştır.

Bu hücrelerin en zenginleştirme / saflaştırma yaklaşımlar için süspansiyon içinde olduğu gereklidir. İdeal olarak, hücre süspansiyonu orijinal dokunun temsili olacak, canlı hücreler ve az multinucleates yüksek bir oranda olması - çünkü şekline eğilimindedirve eksikliği hücre kümeleri 1 - seminifer epitel 6,7 sinsisyal doğası. Önceki raporlar sadece mekanik yöntemle hazırlanan testiküler hücre süspansiyonları tripsinize olanlar 1'den daha kolay clumped olduğunu kanıtladığı vardı. RNases ve / veya tripsin ve belirli alt uygulamalar için istenmeyen belirli makromoleküller bozulma, kollajenaz gibi kurşun ayırmak enzimler ile diğer yandan, enzimatik işlemlerin. İdeal süreci, mRNA gibi ilgi makromoleküllerin iyi bir koruma elde edilmesi amacıyla, mümkün olduğunca kısa ve minimal manipülasyon içermelidir. Katı dokulardan hücre süspansiyonlarının hazırlanması için mevcut protokoller genellikle zaman alan ve yüksek operatöre bağlı olan ve seçici olarak belirli bir hücre tipi 1,8 zarar verebilir.

Burada sunulan protokol bir ile son derece tekrarlanabilir ve son derece kısa bir mekanik ayrıştırma avantajlarını birleştirirAkış sitometrik analizi ve sıralama 4 ve art gen ekspresyon çalışmaları 9 için kullanılabilecek iyi kalitede hücre süspansiyonları yol açan enzimatik tedavi bsence.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücre süspansiyonlarının hazırlanması

  1. Bu IACUC veya eşdeğeri olarak özel komitelerin önerileri takip kullanılacak örnek Sacrifice (Uruguay, Ulusal Komisyonu Hayvan Deney için [CNEA]). Bizim durumumuzda, pentobarbital aşırı dozda uygulandı.
  2. Onaylı Standart prosedürler takip testis ayır ve buz gibi soğuk 10 mi DMEM içeren, buz üzerinde bir 96 mm cam petri tabağına yerleştirin,% 10 fetal dana serumu ile desteklenmiştir.
  3. Tunika albuginea çıkarın ve 2 kare parçalar halinde Decapsulated testis kesmek - Her iki tarafta 3 mm.
  4. Bu parçalar daha sonra bir Medimachine, doku bir delikli paslanmaz çelik ekran ve bir metal rotor içeren bir tek birim içinde ayrıştırılmış bir otomatik mekanik taşlama işlenir. 50 mikron tek birim, disaggregator açın ve süreç içinde bu parçaları 5 - Bunu yapmak için, soğuk yerine 1 ml DMEM ve 4 takviye üreticisinin basit yönergeleri izleyerek 50 sn.
  5. Iğne olmadan 5 ml şırınga - 3 kullanarak ayrıştırma ünitesinden çıkan hücre süspansiyonu kurtarın.
  6. 0.5 ml DMEM takviye ile daha önce ıslatılmış 50 mikron naylon örgü, süzülmeye.
  7. Bir batırılmış 25 mikron naylon örgü, ve buz üzerinde yer kullanarak tekrar süspansiyon filtre.
  8. Bir Neubauer odasında saymak ve 1 ile hücresel konsantrasyonu ayarlayın - 2 x 10 7 hücre / ml desteklenmiş DMEM ile. En az 4 x 10 7 hücre / testis malzemesinin gramı Ortalama elde edilir.
  9. Son olarak, hücre topaklanma önlemek için% 0.2 'lik nihai bir konsantrasyona kadar (2-naftol-6 ,8-disülfonik asit, dipotasyum tuzu) NDA ekleyin.
  10. İsteğe bağlı: Üreticinin talimatları izleyerek, hayvan hücreleri için bir ticari canlılığı kiti ile testis hücre süspansiyonları hücre canlılığı kontrol edin.

2. Akış Sitometrik Analizi

ve_content "> Biz propidyum iyodür yüksek konsantrasyonlarda (PI) ile lekeli hücrelerin analizi için 488 nm dalga boyunda yayan ayarlı bir Coherent argon iyon lazer ile donatılmış, bir Becton-Dickinson FACSVantage akış sitometresi kullandık. (sabitlenmemiş içine PI giriş sorunu stres altında hücreleri) başka bir yerde 9,10 ele alınmıştır.

  1. PI boyama için, 50 hücre süspansiyonu ug / ml 'lik bir son konsantrasyonda florokrom ekleyin ve 0 ° C'da 10 dakika ° C'de karanlıkta inkübe edin.
  2. Lazer gücü 100 mW ve 575/26 bant geçiren filtre FL2 PI-yayılan floresan toplamak için kullanılır ayarlanır.
  3. Biz bir 70 mikron nozul ile FC ölçümleri. Spermatosit nüfus sıralama için, zarf olarak 3 sıralama kriteri damla kullanarak, Normal-R veya Normal-C modunda sıralama ayarlayın. 3 de örnek ve toplama tüpleri tutun - 4 ° C soğutma ünitesi kullanarak. Saniyede 1.500 500 oranında hücreleri analiz etmek için örnek diferansiyel ayarlayın.
  4. Analiz etmek CellQuest yazılım (BD) kullanınAşağıdaki parametreleri: forward scatter (FSC-H); tarafında dağılım (SSC-H), toplam yayılan floresan veya darbe alan (FL2-A) ve floresan emisyon veya darbe genişliği (FL2-W) süresi.

Alternatif olarak, 5 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar önemli bir boya Hoechst 33342 kullanılan ve 37 dakika 10 ° C'de karanlıkta inkübe var. Hücre analizi bir MoFlo Sitometreyi (DakoCytomation) aracılığıyla 25 mW bir UV dalgaboyu lazer çalışma ile donatılmış ve 70 mikron nozul kullanılarak yapılmıştır. Veri işleme Zirvesi v4.3 yazılımı (DakoCytomation) ile yapıldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada tarif edilen protokol ile hazırlanan fare testis, iyi ayrıştırılmış hücre süspansiyonu, bir örneği Şekil 1'de gösterilmiştir.

Enzimatik tedavi 6,8 ve daha önce açıklanan mekanik ayrıştırma yöntemleri 2 ile karşılaştırıldığında, burada sunulan bir (özellikle diğer mekanik göre, çok daha hızlı daha az işleme içerir, (değil operatöre bağlı) kolayca tekrarlanabilir ve kıt hücre artıkları vermektedir yöntem) ve çok az multinucleates (geniş doku manipü...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan optimize yöntemi enzim ve deterjan tedavi kaçınarak ve iyi hücre bütünlüğü ve tipi oranlarını koruyarak, çok hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde kemirgen testis dokusundan hücre süspansiyonları hazırlanması sağlar. Prosedürü (15 dakika süresi testis diseksiyonu, doku kesme ve işleme dahil), yer az işleme ve enzimatik tedavilerin yokluğu kısalık en önemli avantajlarından bazılarıdır. Tüm bu orijinal hücre popülasyonu bulunan bileşiklerin temsil eden bir örneklem gerektiğinde önemlidir kısa yaşam makromo...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen CSIC (I + D proje C022) ve PEDECIBA tarafından desteklenmiştir. Yazarlar yavaşça bu projede kullanılan tüm kobay örnekler sağlamak için MoFlo hücre sıralayıcı ve Merial-Montevideo ile ilgili cömert işbirliği için Hücre Biyolojisi Birimi (Institut Pasteur de Montevideo) den Mariela Bollati ve Valentina Porro teşekkür etmek istiyorum. Şekil 1 Şekil 2 ve 3, ve S. Karger AG, Basel izni ile Tablo 1,, BioMed Central izni ile yeniden ve Şekil 4 ve 5 John Wiley & Sons, Inc (ait telif hakkı izni ile çoğaltılamaz veya uyarlandı Wiley- Blackwell, 2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Medimachine sistemiBD340587
Medicon ünitesi (50 μ m)BD340591
Filcon ünitesi (50 μ m)BD340603
DMEMGibco430-2100
Fetal buzağı serumuPAAA11-151
NDAChemos BmbH277081
H & # 8211; chst 33342Sigma-Aldrich14533Stok çözeltisi 5 mg / ml; 5 & mu'luk bir nihai konsantrasyonda kullanılır; g/ml
Propidium iyodürSigma-Aldrich 287075Stok çözeltisi 1 mg/ml; 50 & mu'luk bir nihai konsantrasyonda kullanılır; g/ml

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
  2. Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
  3. Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
  4. Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
  5. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).
  6. Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
  7. Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
  8. Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
  9. Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
  10. Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
  11. Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
  12. Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Testicular Cell SuspensionMechanical DisaggregationFlow CytometryCell Population SortingRodent Testis PreparationCell Viability StainingDNA Content AnalysisGene Expression StudiesCell Clumping PreventionNon Enzymatic Method

Related Articles