Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

Özet

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Membran proteinlerinin lipid gömülü alfa-sarmal etki arasındaki fiziksel etkileşimleri membran protein komplekslerinin katlama ve montaj ve böyle transmembran (TM) sinyalizasyon ve hücre yüzey proteini seviyelerinin düzenlenmesi gibi dinamik süreçler önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle dizilerinin dernek sürüş yapısal özelliklerini anlama TM peptid komplekslerini sofistike biyofiziksel ve biyokimyasal analizleri gerektirir. Ancak, TM etki aşırı hidrofobik standart peptid kimyası teknikleri kullanarak işlemek için onları çok zorlaştırır, ve uygun eğitim materyalleri üretimi genellikle engelleyici zorlu kanıtlıyor. Peptidler stabil helisel konformasyonları ve form kompleksleri kabul hangi koşullar altında belirlenmesi kendiliğinden zorluk daha ileri bir düzeyi ekler. Burada E. olarak ifade edilmiştir homo-ya da malzemelerden hetero dimerik TM peptid komplekslerini üretimi için bir işlem sunulmaktadır coli, böylece nükleer manyetik rezonans için izotop etiketler (NMR) ya da nispeten pahalı olmayan diğer uygulamalar için, doğal olmayan amino asitler birleşme sağlar. Bu yöntemde önemli yenilik TM kompleksleri üretilen ve deterjan, yağ veya diğer membran-mimetik malzemelerin içine rekonstitüe zaman istikrarlı stokiyometrik ve homojen yapılar oluşturabilirler kovalent ilişkili (disülfid-çapraz) birleştirmeleri olarak saflaştırılmış olmasıdır. Biz de Tekli TM etki veya çapraz kompleksleri üretiminde olsun aynı şekilde uygulanabilir ve yeni TM dizileri için bu yöntemleri adapte etmek için önerilerde ifade ve saflaştırma için özenle optimize prosedürleri sunuyoruz.

Giriş

Bu protokol detayları biz çözüm NMR kullanarak yapısal çalışmalar için disülfid stabilize transmembran kompleksleri (TM) peptidler üretmek için gelişmiş bir prosedür. Prosedür ΔtrpLE1413 füzyon sistemi (aşağıya bakınız) tarafından tanınan sağlam ifade yararlanır ve tanımlanan bileşim TM peptid komplekslerini modern çok boyutlu NMR deneyleri için gelişmiş bir kararlı-izotop etiketleme teknikleri kullanılarak oluşturulmasına olanak sağlar. Biz lenfosit aktive edici immunoreceptors (son ¹ yorum) kendi TM alanları arasındaki etkileşim yoluyla birden membran protein alt monte edilen ilgili önemli yeni bilgiler ortaya çeşitli NMR yapılarını belirlemek için bu teknikler istihdam var. Bu teknikler, bir çok başka zar proteini sistemlerinin yanı sıra çözelti NMR ek olarak aşağı analitik yöntemler geniş bir yelpazede için de geçerlidir. Burada verilen örnekte yerli sistein kalıntıları kullanır ikendoğal disülfit-gümrüklü protein taklit eden bir kompleks oluşturmak için, tasarım eşit derecede iyi normalde böyle homo-ve hetero-dimerik TM kompleksleri gibi zayıf, non-kovalent etkileşimler arada tutarak kompleksleri stabilize etmek için tasarlanmış disülfit bağları oluşturmak için uygundur epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ailesi proteinleri ^2-4 veya heterodimerik αβ integrin kompleksleri ^5,6.

Bu tür lipit türetilmiş olanlar gibi, son derece hidrofobik peptid dizileri kapsayan-çift-katlı TM proteinlerinin kısımlarını biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için son derece zor konusudur. Standart protein ve peptid kimyası teknikleri kullanılarak manipüle etmek çok zor olmasının yanı sıra, genellikle hücreler için oldukça toksik olan ve bu nedenle yeniden birleştirilerek üretmek zordur. Biz ^7,8 ve diğerleri ^9-11 sahip olan in-frame karboksi-terminal olarak bakteri gibi zor peptid sekansları ifade önemli bir başarıE. türetilen ΔtrpLE1413 dizisinin değiştirilmiş bir versiyonu ile füzyonları coli trp operon ^12. Bu sekans ile kodlanan ~ 13 kDa trpLE polipeptid bir T7 promotor altında yüksek düzeyde üretilebilir ve tamamen toksisite ve / veya istikrarsızlık ile ilgili problemler atlatılabilir edilir dahil organları lokalize edilmektedir. Bir amino-terminal 9-histidin etiketi ¹³ ve trpLE sıra, iç metionin ve sistein kalıntıları ortadan kaldırılması metal iyon afinite kromatografisi ile saflaştırıldı ve sindirildi edilmesi için izin verilen ¹⁴ trpLE-peptid füzyonları ve siyanojen bromür (CNBR kullanılarak eklenmesi ile sekans modifikasyonu ) istenen peptid dizisi serbest kalmasını sağlar. Biz başarıyla en fazla dört TM alanları içeren membran proteini parçaları temsil trpLE füzyonlar gibi bir düzine farklı dizilerin daha ifade etmek için bu sistemi kullanılmış ^(7,8 ve yayınlanmamış sonuçlar; ayrıca TARTIŞMA bölümüne bakınız).

Bu protokolde de önemli bir yenilik yapısal olmayan ve çok az çözünen trpLE-TM füzyonları verimli bir iş akışı bağlamında disülfür-çapraz bağlı olabilir hangi koşullar altında tespit edilmesidir. Yüksek verim ifadesi, taşıma ve peptid ürünlerinin saflaştırılması birkaç yönü de iyice optimize, ve burada sunulan öneriler olmayan disülfit çapraz bağlı (monomerik) TM peptid ürünlerinin üretimi için aynı derecede geçerli olarak oylandı.

Protokol

1. Klonlama ve Construct Tasarım

HindIII ve BamHI sınırlama siteleri (bkz. Şekil 1) kullanarak PMM-peptid vektör (hangi istek üzerine temin edilebilir) içine ilgi dizileri klonlama. Çift sarmallı DNA sokmasını aşağıdaki sırayla içermelidir: Bir HindIII sitesi; CNBR bölünme için tek bir metionin kodon; E. kodlama sekansı coli kodon-optimize peptid, bir stop kodonu, bir BamHI sitesi. Peptid diğer tüm methionines bertaraf edilmesi gerekir ve bu da asidik koşullar altında ayrılır edileceği gibi dipeptid sekans Asp-Pro kaçınılmalıdır.

Benzersiz bir sistein artığını nihai komplekse disülfid çapraz bağ arzu edilen konumlandırma göre her bir peptid sıranın içerisine sokulmuştur olmalıdır ve tüm diğer sistein, serin için mutasyonlu olmalıdır. Plazmit seçimi için bir kanamisin direnç kasedi taşır.

2. TrpLE-pepti İfadede Füzyon

1. (0.1 mM _CaCI2, 2 mM _MgSO4, 3 g / L, KH ₂ PO _4, 7.5 g / L Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 0.5 g / L NaCl, makyaj ve steril filtre M9/Kan en az büyüme ortamının 1 g / L _NH4CI, 4 g / L glukoz, 50 mg / L kanamisin sülfat). Çözünmeyen malzeme ve steril filtre turuncu süpernatant kaldırmak için 30 dakika, santrifüj için karıştırma ile 40 ml H ₂ O 1 tablet çözülür:. Olan Merkez Komple A B vitaminleri ve iz metaller sağlamak Çinko Supplement 2 haftaya kadar ve M9 4 ml / L kullanımı için karanlıkta 4 ° C de saklayınız stok solüsyonu.
   NOT: eğer istenirse ¹⁵ N-zenginleştirilmiş _NH4CI, ¹³ C-zengin glikoz veya diğer sabit-izotop etiketli öncüleri, bu aşamada M9 ortam olarak dahil edilebilir.
2. Taze transforme BL21 (DE3) suşu E. 100 ml starter kültür inoküle M9/Kan ortamda coli. 200 rpm'de sallama ile 37 ° C 'de gece boyunca büyümeye.
3. Ertesi sabah, başlangıç ​​kültür OD _600, - bu 2 veya daha büyük bir aralık içinde olmalıdır. Merkez-takviye M9 orta 1 L toplam hacmi içine 100 ml starter kültür seyreltin. Iki 2 L şaşkın şişeler (her bir şişeye 500 ml kültür) bölünür ve 37 büyüyecek ° C OD ₆₀₀ 0.6 ulaşıncaya kadar 140 rpm'de sallayarak.
4. 18 çalkalayıcı sıcaklığını ayarlayın ° C ve kültürler indüksiyonundan önce tamamen soğumasını sağlayan, 1 saat boyunca sallayarak devam.
5. (OD ₆₀₀ = 1 bir kültürün 50 ul eşdeğeri) SDS-PAGE analizi için bir ön-indüksiyon numune alın, sonra trpLE-peptid füzyon ifadesini teşvik etmek için 0.1 mM nihai konsantrasyona IPTG ilave edin. 18 ° IPTG indüksiyon altında gecede C/140 Devri (16-20 saat) büyüyor devam edin.

3. İçerme Vücut Hazırlama ve Nikel Matrix Ciltleme

1. Az orta gecede ifade kültürlerin son OD ₆₀₀ değişken ve sho olduğunuuld 2.5 ve 5.0 arasında olmalıdır. SDS-PAGE analizi için numune alın (OD ₆₀₀ = 1 bir kültür 50 ul eşdeğeri) ve 5.000 x g'de 20 dakika süreyle santrifüj hücreleri toplamak.
2. Yeniden süspanse hücre pelet, 50 ml lizis tamponu (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM β-ME, 0.2 M NaCI) içinde 1 M kültüründen. Hücre süspansiyonu daha sonra işlenmek için dondurulmuş saklanabilir.
3. 5 dakika buz üzerinde 1 dakika ve geri kalanı için maksimum çıkışta buz üzerinde sonication tarafından hücreleri Lyse. Biz ½-inç yüksek yoğunluklu değiştirilebilir ucu ile bir Misonix sonikatör 3000 (max çıkış 600 watt) kullanın. Sonication / üç kür için soğutma tekrarlayın.
4. 20.000 g'de 15 dakika santrifüj ile çözünmeyen inklüzyon cisimciği (IB) malzeme toplayın ve supernatant atın. Açık renkli hücre enkaz gevşek, ince bir tabaka yoğun IB pelet üstünde görülebilir, bu nazik ajitasyon ile su veya tampon kullanarak uzak yıkanabilir. Adımları 3.3 ve 3.4 IB fraksiyonu saflığını iyileştirmek için tekrar edilebilir eğer desikırmızı. Pelet ve süpernatant malzeme örnekleri dahil organlarına trpLE-TM füzyon yerelleştirme onaylamak için SDS-PAGE analizi için alınmalıdır.
5. İşlenmiş kültür litresi başına 25-50 ml kullanılarak guanidin çözeltisi (6 M guanidin HCI, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCI, 1% Triton X-100, 5 mM β-ME), IB granül çözülür. Bu adım, çalkalama ve sonikasyon ile zaman zaman hafif bir kaç saat gerektirir.
6. 75,000-100,000 xg'de 1 saat ile 20 ° C için santrifüjleme ile IB lizat temizleme Bir 0.2 um membran ile süpernatantı ve filtre süzün.
7. 50 ml'lik konik bir tüp içinde temizlenmiş IB lizat, ya da su ve guanidin çözeltisi ile dengelenmiş ile yıkandı nikel afinite reçine ile, sıkıca kapatılmış olabilir daha büyük bir kap birleştirin. TrpLE-DAP12TM (Şekil 3, şerit 2), burada gösterildiği gibi benzer bir dereceye kadar ifade füzyonları için işlenmiş kültür litre başına 3-4 ml yerleşik reçine kullanımı. Oda t geceleme kuluçkaya alarak Toplu bind nazik karıştırma ile emperature.

4. On-sütun Oksidatif Crosslinking

1. Tüm hacmi akan kadar sürekli olarak ekleyerek, gözenekli yatak desteği ile boş bir yerçekimi akışı sütuna IB lizat / nikel reçine süspansiyon yükleyin. Toplamak ve hala çözülmüş füzyon proteini içerebilir flowthrough, bir kenara koymak.
2. Β-ME 5 mM üre çözeltinin 5 yatak hacmi (8 M üre, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl) ile yerçekimi akışı ile nikel reçine yıkanır.
3. Β-ME olmadan üre çözeltisi 5 yatak hacmi ile tekrar nikel reçine yıkayın.
4. 20 uM CuSO ₄ ve glutatyon okside 2 mM ile takviye edilmiş üre çözeltisi 5 yatak hacmi ile nikel reçine üçüncü kez yıkayın. Bu yıkamadan sonra, sütun çıkış yakın ve en fazla disülfit bağ oluşumunu sağlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.

5. TFA Elüsyon ve Miktar

içeriği "> DİKKAT: Trifloroasetik asit (TFA) deri ve duman ile temas şiddetli yanıklara neden son derece rahatsız edici olan Konsantre TFA göz koruması olmayan lateks eldiven ile onaylı kimyasal davlumbaz kullanılmalıdır tüm kimyasal uyumluluğunu kontrol edin.. malzemeler; polipropilen Bu protokol tüm adımları ile uyumludur.

1. Su 10 yatak hacmi ile oksitleyici üre çözeltisi yıkayın ve sütun çıkışına bir vakum hattı uygulayarak sütun yatak kurulayın.
2. Kolon çıkışında kapatın ve düzgün (99-100%) TFA 1.5 yatak hacmi ekleyin. Asit ile dahi maruz kalmasının ve 5 dakika inkübe edilir ve küçük bir spatula ile nikel reçine karıştırın. Kolon çıkış açın ve tüm sıvı dışarı itmek için gerekli ise, bir şırınga veya basınçlı hava hattı ile yavaşça basınçlandırma, asit ile arındırıldı ve toplamak.
3. Düzgün TFA başka 1.5 yatak hacmi ile asit elüsyon adımı yineleyin. Beade tam çözünmesini önlemek için bu aşamada hızlı çalışınd agaroz matrisi. Protein verim Beer-Lambert denklem ile trpLE-peptid dizisi teorik molar tükenme katsayısına göre bu noktada tespit edilebilir. Trifluoroethanol içinde TFA ile arındırıldı (1:20-01:50) (TFE) bir örnek seyreltilir ve bir boş olarak aynı dilüsyonda, TFA / TFE kullanılarak, 280 nm'de absorbansı ölçülür.

6. CNBR Sindirim

DİKKAT: siyanojen bromür (CNBR) son derece toksik ve sadece onaylı kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. Emniyet gözlüğü, laboratuvar önlüğü ve olmayan lateks eldiven dahil KKD kesinlikle gereklidir. CNBR neme reaktif ve açmadan önce oda sıcaklığına getirilmelidir. Nötralizasyon / CNBR-kontamine çözümleri ve malzemelerin bertaraf talimatları için kurumsal güvenlik ofisine başvurun.

1. Hafifçe karıştırma sırasında damla damla su ilave edilerek% 80 TFA nihai konsantrasyon asit elüsyon seyreltilir. Bir çökelti oluştu, bir varsadd geri temiz TFA küçük bir miktarda (0,5-1 ml) çözeltisi su ile% 80 yeniden doğru, daha sonra açıklık kadar. Sıvı azot içinde dondurulması ve hemen örnek liyofilize edilmesiyle, SDS-PAGE analizi için bir 5 ul ön özet numune alın.
2. Kapalı, önceden tartılmış tüpleri güvenle toksik kimyasal tartmak bakımı veya kimyasal davlumbaz içinde bir denge kullanarak, yaklaşık 0.2 g / ml CNBR kristalleri ekleyin. Tamamen eriyene kadar yavaşça karıştırın. Yıkayın ve atıl gaz (argon ya da azot akışı) altında tepkime kabı mühürlemek ve ışıktan koruyarak, oda sıcaklığında 3-4 saat inkübe edilir.
3. SDS-PAGE analizi için 5 ul sonrası özet numune alın ve dondurma ve hemen lyophilize. Beklenen peptid kompleksi boyutu göre, 3.5 kDa ya da daha az bir moleküler ağırlığa sahip bir kesme rejenere selüloz diyaliz kaset ya da boru (selüloz asetat konsantre asit içinde eriyecektir) ile sindirmek reaksiyon aktarın. Su içinde 4 M vermek üzere gece boyunca Dialyzekimyasal davlumbaz TFA konsantrasyonunu azaltmak ve herhangi bir reaksiyona girmemiş CNBR ayrıştırılması. Gecede diyaliz sırasında hacminde önemli bir artış (kadar üç kat iki-gibi) için diyaliz kaset veya tüp boşluk bırakın.
4. Diyaliz kaset ya da boru (protein en TFA konsantrasyonu düşük olduğu zaman çökelti olacaktır) asılı bir çökelti ile diyalize edilen çözelti tepkime çıkarın ve 50 ml konik tüpe süspansiyon aktarın. Freeze ve su CNBR / TFA izlerini kaldırmak için lyophilize. Bu adım birkaç gün ihtiyacı doğacaktır.
   DİKKAT: diyalizlenmiş özeti reaksiyonu ve diyaliz su Hem toksik ve uygun önlemler ile bertaraf / ele muamelesi devam edilmelidir.
5. Öncesi indüksiyon ve hasat dönemlerinde, inklüzyon body süpernatant ve pelet, TFA arındırıldı ve CNBR-sindirilmiş malzemeden kültürlerin örnekleri SDS-PAGE ile analiz edilebilir. 95 ile ısıtma ile numuneler hazırlayın Invitrogen NuPAGE LDS sampl ° Ce tampon. TFA arındırıldı ve özet örneklerinin oksidatif crosslinking ürün tanımlama ve değerlendirme kolaylaştırmak için azaltma ve non-düşürücü hem koşullarda hazırlanmalıdır.
6. En küçük özet ürünlerin optimum çözümü için MES-SDS tamponu kullanılarak çalışan bir% 12 NuPAGE bis-tris önceden dökme akrilamid jel üzerinde örnekleri ayırın.

7. Disülfür çapraz bağlı peptid komplekslerini arasında Ters-faz HPLC saflaştırma

1. Bir preparatif-ölçek üzerine 2-3 ml formik asit ve muntazam yük (21.2 x 150 mm) içine liyofilize özet ürünleri 100 mg a kadar eritilir Agilent Zorbax SB-300, çözücü, C3 PrepHT A sütunu (tipik olarak% 10-20 asetonitril ya da 5 % 0.1 TFA ile su içinde% 10 izopropanol).
2. En az 5 kolon hacmi üzerinden çözücü B gradyanı (% 0.1 TFA ile asetonitril veya izopropanol) içinde özet ürünler Zehir. Farklı peptidle optimum eğim koşulları seçimi önerileri için TARTIŞMA bakınız.
3. AlmakSDS-PAGE analizi ve dondurma ve hemen lyophilize için her HPLC fraksiyonu 50-100 ul örnekleri. HPLC solvent kaldırılmasını hızlıdır ve 1-2 saat içinde tam olmalıdır.
4. Herhangi bir indirgen ajan ile Invitrogen NuPAGE LDS numune tamponu içinde 95 ° C ye ısıtmak suretiyle SDS-PAGE için liyofilize HPLC numuneleri hazırlanır. Soğutulur ve onları ve yeniden ısıtma kısaca birine 100 mM DTT ekleyerek, eşit 2 mikrosantrifüj tüpleri içine her bir numune ayrılır.
5. MES-SDS olarak yukarıdaki tampon ile çalışan bir% 12 NuPAGE bis-tris önceden dökme akrilamid jel üzerinde daha az olmayan ve azaltılmış HPLC numuneleri ayırın. Küçük, hidrofobik peptitler genellikle Coomassie sıra leke yapmayız ve beklenen molekül ağırlıklarında çalışmayabilir. Ancak, azaltılmış ve non-azaltılmış örneklerinin karşılaştırılması çapraz peptid ürünleri ve saflık değerlendirilmesi belirlenmesi kolaylaştırmalıdır.
6. Matriks destekli lazer desorpsiyon iyonlaşma time-of-flight (MALDI-TO tarafından aday peptid içeren fraksiyonları analizF) kütle spektrometresi (TARTIŞMA bakınız) faiz türleri belirlemek ve beklenen kitle onaylayın.
7. , Kombine saf, çapraz bağlı TM peptid kompleksi ihtiva eden HPLC fraksiyonları dondurmak ve lyophilize ve verimi belirlemek için, son ürünün bir kuru ağırlık al. Yüksek izopropanol içerikli Kesirler dondurulmuş kalmayabilir. Peptit parçaları yerine bir kabarık liyofilize edilmiş ürüne göre daha aşağı kuru film halinde, saf hekzafloroizopropanol (HFIP) küçük bir hacim içinde tamamen filmi yeniden çözülür donma ve tekrar lyophilize. HFIP ile tedavi edilen ürün, kolaylıkla dışarı uçlu ve tartılmış küçük, beyaz bir koni olmalıdır.

Sonuçlar

TrpLE füzyonları için elde ekspresyon seviyesi, değişken ve ekli peptidin amino asit dizisinin büyük ölçüde bağlıdır. Şekil 3, önceden indüksiyon SDS-PAGE analizi (hat 1) ve time-of-hasat (kulvar 2) göstermektedir kültürü 1 litre ve 4 ml nikel matris saf, bozulmamış trpLE-DAP12TM füzyon yaklaşık 120 mg'lik bir kültür örnekleri. TrpLE-DAP12TM füzyon Tüm olarak süpernatant (yol 3) karşı inklüzyon cisimciği pelet (şeritli 4) lokalize edilmiştir.

Nikel-saflaştırılmış trpLE-D...

Tartışma

TrpLE-TM füzyonlar Ekspresyonu. Bizim tecrübelerimize göre, trpLE-TM füzyonlar zayıf 37 ° C'de zengin kültür ortamı olarak ifade edilir, ve burada açıklanan kültür koşullarında verimleri değişen bir ila dört TM etki içeren birçok farklı dizileri için başarısı kanıtlanmış 50 ile 150 mg / saf, bozulmamış füzyon L. Fusions kodlama üç veya dört-TM GPCR parçaları (insan CCR5 sırasıyla TM1-TM3 ve TM4-TM7,) ya da insan sinyal peptit peptidaz (dört TM etki; ref ¹⁵⁾ bir çekirdek katalitik fragmanı ifade b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif / Malzeme Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Siyanojen bromür	Aldrich	P.No-C91492, CAS-506-68-3	TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Teneffüs edilmesi, deri ile teması ve yutulması halinde zararlıdır. Asitlerle temasında çok toksik gaz çıkarır. Sudaki organizmalar için çok toksik, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir.
Trifloroasetik asit	Sigma-Aldrich	P.CODE-1000984387, CAS Numarası 76-05-1	TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL., Ciddi yanıklara neden olur. Solunması halinde sağlığa zararlıdır. Sudaki organizmalar için zararlı, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir.
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	P.No M7154, CAS Numarası 60-24-2	TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Solunduğunda, cilt ile temasında ve yutulduğunda toksiktir. Cildi tahriş eder. Gözlere ciddi hasar riski. Deri ile teması halinde hassasiyete neden olabilir. Sudaki organizmalar için çok toksik, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir.
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolün hazırlanması	Sigma-Aldrich	Ürün Numarası 52512, CAS-No. 920-66-1	TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Solunması halinde sağlığa zararlıdır ve yutulduğunda toksiktir. Yanıklara neden olur.
Formik asit	Merck KGaA	K41186564	Yanıcı sıvı ve buhar. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur.
Üre	UNIVAR, AJAX Finechem	Ürün Numarası, 817, CAS-No 57-13-6	ısıtmalı, deckarbon dioksit ve amonyak ile omposes, yanmış halinde, azot oksit, az miktarda yayar. Kızarıklık ve cilt ve gözlerde tahrişe neden olabilir.
Guanidin HİDROKLORİD	Amresco	P.No-M110, CAS Numarası: 50-01-1	Yutulması halinde zararlıdır, Ciddi derecede göz tahrişine neden olur cilt tahrişi, Akut Toksisite Oral, Cilt Tahriş edici, Göz Tahriş edici neden olur.
TRİTON X-100	SIGMA	Ürün Numarası-T8532 CAS No: 9002-93-1	Triton X-100 sık sık proteinleri çözünür biyokimyasal uygulamalarında kullanılan bir iyonik olmayan deterjan,% 100 aktif maddedir. Triton X-100, herhangi bir antimikrobiyal özelliklere sahiptir ve nispeten hafif bir denatüre edici olmayan bir deterjan olarak kabul
Onun-Seçiniz Nikel-Affinity jel	Sigma-Aldrich	Katalog Num-P6611	IS-Select Nikel Affinity Jel bir immobilize metal iyon afinite kromatografisi (IMAC) ürünüdür. HIS-Seçiniz NickEl Affinity jel özellikle histidin içeren proteinlere bağlamak için tasarlanmıştır nikel ile tahsil boncuklu agaroz üzerine özel bir quadridentate preparatıdır.
(-)-Glutatyon, okside	Sigma-Aldrich	Katalog num 150568
Misonix S-3000 sonikatör	QSONICA	S-3000 (üretilmiyor)	Maksimum çıkış gücü 600 watt. 1/2-inch değiştirilebilir uçlu prob 1/2-inch yüksek yoğunluklu, yüksek hacimli ipuçları ve yüksek yoğunluklu, düşük hacimli ipuçları bir dizi alır. Bu firma şu anda mevcut en yakın modeller Q500 ve Q700 vardır.
RP-HPLC: Biyolojik Çift Geçişli kromatografi sistemi, Yazılım Sürüm 5.3	Bio-Rad Laboratories	Katalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Seri No: 484BR3705	Peptitler yüksek aq faz HPLC kolonları ters bağlanırueous mobil faz ve yüksek organik hareketli faz ile RP HPLC kolonları arasından kolonda sürüklenecektir. RP HPLC peptidlerin hidrofobik özelliğine göre ayrılır. Peptitler, organik çözücü bir doğrusal gradyan ile çalışan ayrılabilir.
Hazırlık HT C3 Zorbax 300SB-Analitik HPLC Kolon, 21.2 x 150 mm, 5 mm partikül boyutu	Agilent	Ürün No: 895150-909	Ters-faz HPLC kolon
NuPAGE% 12 Bis-Tris Jeller	Yaşam Teknolojileri	NP0341BOX	Protein elektroforezi için Prefabrik jeller
Slide-A-Lyzer G2 Diyaliz Kasetler, 3,5 K MWCO	Thermo Scientific	Ürün No: 87724	Örnek diyaliz