Yöntem makalesi

Yapısal Çalışmaları üretimi disülfid stabilize Transmembran Peptit Kompleksi

DOI:

10.3791/50141

⸱

6 Mart 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Structural Biology Division, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, 2The University of Melbourne

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran-gömülü protein etki arasındaki etkileşimler biyofiziksel ve biyokimyasal çalışmalarda uygun çalışma malzemesi elde edilir ilki birçok teknik sorunlarla karşı karşıya. Bu makale, çözelti nükleer manyetik rezonans (NMR) ve diğer analitik uygulamalar tarafından yapısal analizi için uygun olan disülfid stabilize transmembran peptid komplekslerini üretme ve arıtma için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Membran proteinlerinin lipid gömülü alfa-sarmal etki arasındaki fiziksel etkileşimleri membran protein komplekslerinin katlama ve montaj ve böyle transmembran (TM) sinyalizasyon ve hücre yüzey proteini seviyelerinin düzenlenmesi gibi dinamik süreçler önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle dizilerinin dernek sürüş yapısal özelliklerini anlama TM peptid komplekslerini sofistike biyofiziksel ve biyokimyasal analizleri gerektirir. Ancak, TM etki aşırı hidrofobik standart peptid kimyası teknikleri kullanarak işlemek için onları çok zorlaştırır, ve uygun eğitim materyalleri üretimi genellikle engelleyici zorlu kanıtlıyor. Peptidler stabil helisel konformasyonları ve form kompleksleri kabul hangi koşullar altında belirlenmesi kendiliğinden zorluk daha ileri bir düzeyi ekler. Burada E. olarak ifade edilmiştir homo-ya da malzemelerden hetero dimerik TM peptid komplekslerini üretimi için bir işlem sunulmaktadır coli, böylece nükleer manyetik rezonans için izotop etiketler (NMR) ya da nispeten pahalı olmayan diğer uygulamalar için, doğal olmayan amino asitler birleşme sağlar. Bu yöntemde önemli yenilik TM kompleksleri üretilen ve deterjan, yağ veya diğer membran-mimetik malzemelerin içine rekonstitüe zaman istikrarlı stokiyometrik ve homojen yapılar oluşturabilirler kovalent ilişkili (disülfid-çapraz) birleştirmeleri olarak saflaştırılmış olmasıdır. Biz de Tekli TM etki veya çapraz kompleksleri üretiminde olsun aynı şekilde uygulanabilir ve yeni TM dizileri için bu yöntemleri adapte etmek için önerilerde ifade ve saflaştırma için özenle optimize prosedürleri sunuyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol detayları biz çözüm NMR kullanarak yapısal çalışmalar için disülfid stabilize transmembran kompleksleri (TM) peptidler üretmek için gelişmiş bir prosedür. Prosedür ΔtrpLE1413 füzyon sistemi (aşağıya bakınız) tarafından tanınan sağlam ifade yararlanır ve tanımlanan bileşim TM peptid komplekslerini modern çok boyutlu NMR deneyleri için gelişmiş bir kararlı-izotop etiketleme teknikleri kullanılarak oluşturulmasına olanak sağlar. Biz lenfosit aktive edici immunoreceptors (son 1 yorum) kendi TM alanları arasındaki etkileşim yoluyla birden membran protein alt monte edilen ilgili önemli yeni bilgiler ortaya çeşitli NMR yapılarını belirlemek i....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Klonlama ve Construct Tasarım

HindIII ve BamHI sınırlama siteleri (bkz. Şekil 1) kullanarak PMM-peptid vektör (hangi istek üzerine temin edilebilir) içine ilgi dizileri klonlama. Çift sarmallı DNA sokmasını aşağıdaki sırayla içermelidir: Bir HindIII sitesi; CNBR bölünme için tek bir metionin kodon; E. kodlama sekansı coli kodon-optimize peptid, bir stop kodonu, bir BamHI sitesi. Peptid diğer tüm methionines bertaraf edilmesi gerekir ve bu da asidik koşullar altında ayrılır edileceği gibi dipeptid sekans Asp-Pro kaçınılmalıdır.

Benzersiz bir sistein artığını nihai komplekse d....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TrpLE füzyonları için elde ekspresyon seviyesi, değişken ve ekli peptidin amino asit dizisinin büyük ölçüde bağlıdır. Şekil 3, önceden indüksiyon SDS-PAGE analizi (hat 1) ve time-of-hasat (kulvar 2) göstermektedir kültürü 1 litre ve 4 ml nikel matris saf, bozulmamış trpLE-DAP12TM füzyon yaklaşık 120 mg'lik bir kültür örnekleri. TrpLE-DAP12TM füzyon Tüm olarak süpernatant (yol 3) karşı inklüzyon cisimciği pelet (şeritli 4) lokalize edilmiştir.

Nikel-saflaştırılmış trpLE-DAP12.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TrpLE-TM füzyonlar Ekspresyonu. Bizim tecrübelerimize göre, trpLE-TM füzyonlar zayıf 37 ° C'de zengin kültür ortamı olarak ifade edilir, ve burada açıklanan kültür koşullarında verimleri değişen bir ila dört TM etki içeren birçok farklı dizileri için başarısı kanıtlanmış 50 ile 150 mg / saf, bozulmamış füzyon L. Fusions kodlama üç veya dört-TM GPCR parçaları (insan CCR5 sırasıyla TM1-TM3 ve TM4-TM7,) ya da insan sinyal peptit peptidaz (dört TM etki; ref 15) bir çekirdek katalitik fragmanı ifade b.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MEC ve Victoria Hükümeti (Veski Yenilik Fellowship, bu iş için Harçlar Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (WEHI Bağımsız Araştırma Enstitüleri Altyapısını Destekleme Programı [IRIISS] hibe MEC ve MJC için NHMRC proje hibesi 1011352) tarafından sağlanır; WEHI için Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapısını Destekleme). MEC Avustralya Araştırma Konseyi Kraliçe Elizabeth II üyesidir. EFXB Melbourne Üniversitesi'nde Norma Hilda Schuster Burs Programı desteğini onaylar.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif / Malzeme Adı Şirket Katalog Numarası Yorumlar
Siyanojen bromür Aldrich P.No-C91492, CAS-506-68-3 TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Teneffüs edilmesi, deri ile teması ve yutulması halinde zararlıdır. Asitlerle temasında çok toksik gaz çıkarır. Sudaki organizmalar için çok toksik, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir.
Trifloroasetik asit Sigma-Aldrich P.CODE-1000984387, CAS Numarası 76-05-1 TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL., Ciddi yanıklara neden olur. Solunması halinde sağlığa zararlıdır. Sudaki organizmalar için zararlı, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir.
2-merkaptoetanol Sigma-Aldrich P.No M7154, CAS Numarası 60-24-2 TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Solunduğunda, cilt ile temasında ve yutulduğunda toksiktir. Cildi tahriş eder. Gözlere ciddi hasar riski. Deri ile teması halinde hassasiyete neden olabilir. Sudaki organizmalar için çok toksik, su ortamında uzun süreli olumsuz etkilere neden olabilir.
1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanolün hazırlanması Sigma-Aldrich Ürün Numarası 52512, CAS-No. 920-66-1 TEHLİKELİ MADDE. TEHLİKELİ MAL. Solunması halinde sağlığa zararlıdır ve yutulduğunda toksiktir. Yanıklara neden olur.
Formik asit Merck KGaA K41186564 Yanıcı sıvı ve buhar. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur.
Üre UNIVAR, AJAX Finechem Ürün Numarası, 817, CAS-No 57-13-6 ısıtmalı, deckarbon dioksit ve amonyak ile omposes, yanmış halinde, azot oksit, az miktarda yayar. Kızarıklık ve cilt ve gözlerde tahrişe neden olabilir.
Guanidin HİDROKLORİD Amresco P.No-M110, CAS Numarası: 50-01-1 Yutulması halinde zararlıdır, Ciddi derecede göz tahrişine neden olur cilt tahrişi, Akut Toksisite Oral, Cilt Tahriş edici, Göz Tahriş edici neden olur.
TRİTON X-100 SIGMA Ürün Numarası-T8532 CAS No: 9002-93-1 Triton X-100 sık sık proteinleri çözünür biyokimyasal uygulamalarında kullanılan bir iyonik olmayan deterjan,% 100 aktif maddedir. Triton X-100, herhangi bir antimikrobiyal özelliklere sahiptir ve nispeten hafif bir denatüre edici olmayan bir deterjan olarak kabul
Onun-Seçiniz Nikel-Affinity jel Sigma-Aldrich Katalog Num-P6611 IS-Select Nikel Affinity Jel bir immobilize metal iyon afinite kromatografisi (IMAC) ürünüdür. HIS-Seçiniz NickEl Affinity jel özellikle histidin içeren proteinlere bağlamak için tasarlanmıştır nikel ile tahsil boncuklu agaroz üzerine özel bir quadridentate preparatıdır.
(-)-Glutatyon, okside Sigma-Aldrich Katalog num 150568
Misonix S-3000 sonikatör QSONICA S-3000 (üretilmiyor) Maksimum çıkış gücü 600 watt. 1/2-inch değiştirilebilir uçlu prob 1/2-inch yüksek yoğunluklu, yüksek hacimli ipuçları ve yüksek yoğunluklu, düşük hacimli ipuçları bir dizi alır. Bu firma şu anda mevcut en yakın modeller Q500 ve Q700 vardır.
RP-HPLC: Biyolojik Çift Geçişli kromatografi sistemi, Yazılım Sürüm 5.3 Bio-Rad Laboratories Katalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Seri No: 484BR3705 Peptitler yüksek aq faz HPLC kolonları ters bağlanırueous mobil faz ve yüksek organik hareketli faz ile RP HPLC kolonları arasından kolonda sürüklenecektir. RP HPLC peptidlerin hidrofobik özelliğine göre ayrılır. Peptitler, organik çözücü bir doğrusal gradyan ile çalışan ayrılabilir.
Hazırlık HT C3 Zorbax 300SB-Analitik HPLC Kolon, 21.2 x 150 mm, 5 mm partikül boyutu Agilent Ürün No: 895150-909 Ters-faz HPLC kolon
NuPAGE% 12 Bis-Tris Jeller Yaşam Teknolojileri NP0341BOX Protein elektroforezi için Prefabrik jeller
Slide-A-Lyzer G2 Diyaliz Kasetler, 3,5 K MWCO Thermo Scientific Ürün No: 87724 Örnek diyaliz

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Call, M. E., Chou, J. J. A view into the blind spot: solution NMR provides new insights into signal transduction across the lipid bilayer. Structure. 18, 1559-1569 (2010).
  2. Bocharov, E. V., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dis lf r apraz Ba lanmaE coli EkspresyonuNikel Afinite PurifikasyonuSiyanojen Brom r KesimiTers Fazl HPLCSDS PAGE AnaliziK tle SpektrometrisiDeterjan ile Rekonstit syon

İlgili makaleler