Method Article

Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma

DOI:

10.3791/50143

⸱

August 20th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Systems Biology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department for the Biology of Ageing, European Research Institute for the Biology of Ageing, University Medical Centre Groningen, University of Groningen, 3Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 4Department of Health Sciences and Technology, ETH Zurich, 5Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz tek tomurcuklanan maya hücreleri onların bütün ömrü boyunca izlenebilir hangi basit mikroakışkan kurulum, kullanımı göstermektedir. Mikroakışkan çip micropads bir dizi kullanarak anne ve kızı hücreleri arasındaki boyut farkı patlatır. MicroPad ve cam kapak arasındaki mesafe, bir maya hücresi (3-4 mikron) çapına benzer olduğu için yükleme sırasında, hücreler, bu micropads altında tutulur. Yerleştirme işleminden sonra, kültür ortamı sürekli olarak küçük boyutu nedeniyle yastıkları altında korunmaz ortaya çıkan kızı hücreleri üzerinden basması zamanda tüm deney boyunca sabit ve tanımlanmış bir ortam oluşturur sadece çip, ile kızarmış, ancak. Kurulum tek bir deneyde 50 kadar tek tek hücrelerin daha uzun, gerekirse, 5 gün boyunca tam otomatik bir şekilde izlenebilir veya böylece verimli anne hücreleri korur. Buna ek olarak, yonga mükemmel optik özellikleri yüksek izinTüm yaşlanma sürecinde hücrelerin çözünürlüklü görüntüleme.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Maya tomurcuklanma araştırmalar 1 yaşlanma için önemli bir model organizmadır. Yakın zamanda maya hücreleri yaşlanma replikatif eğitim kadar her tomurcuk elle anne hücre 2,3 kaldırıldı hangi, bir diseksiyon yöntemi gerektiren zahmetli bir süreçti. Bu sorunu çözmek için, son zamanlarda onların bütün ömrü boyunca 4 ayrı anne hücreleri izlemek mümkün yeni bir mikroakışkan kurulum sundu.

Bizim mikroakışkan çip, maya hücreleri (bkz. Şekil 1) yumuşak elastomer tabanlı micropads altında sıkışıp kalırlar. Orta bir sürekli akış uzakta yeni kurulan kızı hücreleri yıkar ve taze besin hücreleri sağlar....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bir Silikon Gofret Kalıp üretimi ve hazırlanması

Mikroakışkan cips yumuşak litografi tarafından üretilen bir silikon yonga kalıp oluşturulur. Bu gofret mikroakışkan yongaları üretmek için birçok kez tekrar edilebilir. Bu ilgili bir gofret üretimi Mikroakiskan 6 uzmanlaşmış bir grup tarafından gerçekleştirildiğini tavsiye edilir.

Gofret negatif fotorezist iki farklı katmanları, SU-8 7 kullanarak iki aşamalı bir fotolitografi işlemi yapılır. Kanalların üst katman (yüksekliği 10 mikron SU-8 2010) ile yapılır, oysa; alt tabaka, hücre bindirme alanı (yüksekliği 3-4 mikron SU-8 Aralık 2002) ol....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hücreleri doğrudan orta-üstel kültür mikroakışkan çip yüklenir. Mikroakışkan çip sıkışıp hücrelerinin yaş dağılımı yükleme öncesi kültürünün benzer olup olmadığını tespit etmek için, hücreleri tomurcuk izleri görselleştirmek için FITC konjuge buğday agglutinin (WGA-FITC) ile boyandı. Şekil 3'te görülebileceği gibi, mikroakışkan çip micropads altında hücrelerin tuzak belirli bir yaştaki hücrelere yanlı değildir.

Replikatif ömrü sadece tek bir ana hücre tarafından.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan mikroakışkan yöntem sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birlikte maya replikatif ömrü veri basit ve otomatik nesil sağlar araştırma yaşlanma önemli bir yeni bir araçtır. Bu özellikler, klasik diseksiyon yöntemi deneysel olanakları üzerinde büyük gelişmeler, yine dikkate alınması gereken bir yöntem bazı sınırlamalar vardır.

Bir MicroPad altında tutulur her hücre (komşu bir hücrenin tomurcuklanan hücre örneğin ondan itin olabilir çip yıkanabilir belirli bir ol.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz mitokondriyal morfolojileri puanlama için hücre yükleme protokolü ve Marcus de Goffau ve Guille Zampar ilk sürümü yazmak için Laura Schippers teşekkür etmek istiyorum.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
DC Sylgard 184 elastomer Mavom bv1060040Bu paket, PDMS tabanı ve PDMS kürleme maddesi içerir.
Cam petri kapları 120/20 mm VWR International391-2850
Kapak camları 22x40 mm CBN Labsuppliers BV190002240
Sert Etiketler Sigma-AldrichZ359106
Alüminyum folyo
Plastik tek kullanımlık bardak
Serolojik pipet 5 ml VWR International612-1245
Scotch bant VWR International819-1460
Baysilone macunu (GE Bayer silikonları) Sigma-Aldrich85403-1EA
PTFE mikro delikli boru, 0.012 "ID x 0.030" OD Cole ParmerEW-06417-11İnce boru olarak adlandırılır
Tygon mikro delikli Boru, 0.030 "ID x 0.090" OD Cole ParmerEW-06418-03Kalın boru olarak adlandırılır
Neşter VWR International233-5334
50 ml Luer-Lok şırıngalar BD
5 ml şırıngalar, Luer ucu VWR International613-1599
Cımbız VWR International232-2132
20 Gauge Luer saplamaları Instech SolomonLS20
Şırınga filtreleri (gözenek boyutu 0.20 μ m) Sigma-Aldrich16534K
Paslanmaz çelik kateter Tapası, 20 ga x12 mm Instech SolomonSP20/12
Petri kapları VWR International391-0892
EQUIPMENT
Tezgah Üstü UV-Ozon Temizleyici NOVA ScanPSD-UVT
Harvard Pompa 11 Elite Harvard Aparatı70-4505
SU-8 silikon ana kalıp (gofret) Kendi kendine yapılan; Ayrıntılar için ilgili yazarla iletişime geçin
Balance Sartorius corporationED4202S
Vakum pompası KNF NeubergerN022 AN.18
Kurutucu VWR International467-2115
Sıcak plaka VWR International460-3267
Opsiyonel: Kapak camı için metal tutucu (22x40 mm) Self; Ayrıntılar için sorumlu yazar
(Floresan) ile iletişime geçin: 60x objektif, otomatik odaklama, hızlandırılmış çekim özelliklerine sahip mikroskop ve tercihen otomatik (motorlu XY kontrolü) aşaması NikonEclipse Ti-E
300137

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
  2. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  3. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Budding Yeast AgingMicrofluidic ChipYeast Cell TrackingReplicative LifespanContinuous MicroscopyMother Daughter SeparationPDMS Chip FabricationFluorescence MicroscopyMitochondrial MorphologyLifespan Curve Analysis

Related Articles