Biz burada onların tam replikatif ve / veya kronolojik ömrü boyunca tek tomurcuklanan maya hücreleri sürekli ve yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme sağlayan bir mikroakışkan cihazın çalışmasını gösterir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Replikatif sürekli yüksek çözünürlüklü Mikroskobik Gözlem geliştirici Maya Yaşlanma
Bu makalede
Özet
Özet
Biz tek tomurcuklanan maya hücreleri onların bütün ömrü boyunca izlenebilir hangi basit mikroakışkan kurulum, kullanımı göstermektedir. Mikroakışkan çip micropads bir dizi kullanarak anne ve kızı hücreleri arasındaki boyut farkı patlatır. MicroPad ve cam kapak arasındaki mesafe, bir maya hücresi (3-4 mikron) çapına benzer olduğu için yükleme sırasında, hücreler, bu micropads altında tutulur. Yerleştirme işleminden sonra, kültür ortamı sürekli olarak küçük boyutu nedeniyle yastıkları altında korunmaz ortaya çıkan kızı hücreleri üzerinden basması zamanda tüm deney boyunca sabit ve tanımlanmış bir ortam oluşturur sadece çip, ile kızarmış, ancak. Kurulum tek bir deneyde 50 kadar tek tek hücrelerin daha uzun, gerekirse, 5 gün boyunca tam otomatik bir şekilde izlenebilir veya böylece verimli anne hücreleri korur. Buna ek olarak, yonga mükemmel optik özellikleri yüksek izinTüm yaşlanma sürecinde hücrelerin çözünürlüklü görüntüleme.
Giriş
Maya tomurcuklanma araştırmalar 1 yaşlanma için önemli bir model organizmadır. Yakın zamanda maya hücreleri yaşlanma replikatif eğitim kadar her tomurcuk elle anne hücre 2,3 kaldırıldı hangi, bir diseksiyon yöntemi gerektiren zahmetli bir süreçti. Bu sorunu çözmek için, son zamanlarda onların bütün ömrü boyunca 4 ayrı anne hücreleri izlemek mümkün yeni bir mikroakışkan kurulum sundu.
Bizim mikroakışkan çip, maya hücreleri (bkz. Şekil 1) yumuşak elastomer tabanlı micropads altında sıkışıp kalırlar. Orta bir sürekli akış uzakta yeni kurulan kızı hücreleri yıkar ve taze besin hücreleri sağlar. Tek bir deneyde, 50 kadar anne hücreleri onların bütün replikatif ömrü boyunca tam otomatik bir şekilde izlenebilir. Mikroakışkan çip mükemmel optik özellikleri nedeniyle, aynı anda maya hücre biyolojisi farklı yönleri (örneğin izlemek mümkündür floresan proteinleri) kullanarak.
Klasik diseksiyon yöntemi ile karşılaştırıldığında, mikroakışkan kurulum önemli avantajlar sağlamaktadır. Bu bütün yaşlanma deney sırasında, tanımlı ve sürekli ortam sağlar. Hiçbir pahalı özel ekipman gerektirir ve otomatik odaklama ve zaman atlamalı yetenekleri yanı sıra sıcaklık kontrol hücre kültürü için donatılmış herhangi bir mikroskop üzerinde çalıştırılabilir. Mikroakışkan cips üretim ve operasyon birkaç gün içinde öğrenilebilir. Buna ek olarak, hücreleri doğrudan katlanarak büyüyen kültür, anne hücre biyotinilasyon gerektiren başka bir son yayınlanan mikroakışkan yöntemi 5, üzerinde bir avantaj yüklenebilir. Bir Burada anlatılan yöntemi kademeli değişiklikleri ölçmek için kullanılabilecek yüksek çözünürlüklü görüntüleme, ile birlikte hücresel morfolojisi, maya sırasında protein ekspresyonu ve lokalizasyonu benzeri görülmemiş bir şekilde yaşlanma. Için yeteneğitek hücre uzun vadeli izleme de maya hücre döngüsü çalışmaları için eşsiz olanaklar sağlar.
Bir Bu yöntem son zamanlarda bu yazının yorum iken yayınlandı protokol 16, gelen biyotinilasyon kaldırmak için optimize edilmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Bir Silikon Gofret Kalıp üretimi ve hazırlanması
Mikroakışkan cips yumuşak litografi tarafından üretilen bir silikon yonga kalıp oluşturulur. Bu gofret mikroakışkan yongaları üretmek için birçok kez tekrar edilebilir. Bu ilgili bir gofret üretimi Mikroakiskan 6 uzmanlaşmış bir grup tarafından gerçekleştirildiğini tavsiye edilir.
Gofret negatif fotorezist iki farklı katmanları, SU-8 7 kullanarak iki aşamalı bir fotolitografi işlemi yapılır. Kanalların üst katman (yüksekliği 10 mikron SU-8 2010) ile yapılır, oysa; alt tabaka, hücre bindirme alanı (yüksekliği 3-4 mikron SU-8 Aralık 2002) oluşturmak için kullanılır. Gofret üretim işleminin bir gösterim Huang ve ark 8'de bulunabilir. Mikroakışkan cips çizimler ilgili bir gofret edinme hakkında yazarların yanı sıra tavsiye elde edilebilir.
- Gofret elde edildikten sonra, Sert-Tag int tek parça kesmekBir neşter ve giriş kanalları ve MicroPad dizi (Şekil 2A) arasındaki kanal yapısı üstüne biraz gofret dikkatle koyun ile 3 mm 0,5 mm kadar o ince şeritler. Bu, yalnızca hücre yükleme esnasında kullanılamaz her bir çip, büyük bir ek kanal oluşmasına neden olabilir, fakat mikroakışkan cihazın düzgün çalışması için de önem taşımaktadır.
- Alüminyum folyo bir çift katmanlı ile cam Petri kabı Kapak ve Petri kabındaki gofret koydu. Alüminyum folyo gofret ve Petri kabı arasında çalışmasını PDMS önleyecektir. PDMS gofret ve cam Petri kabı arasında sürünme eğer, gofret Petri kabındaki sürekli sabit olacak. Gofret hala kullanılabilir olmasına rağmen sonları ve PDMS sonra kesmek gerekir, bu cam Petri kabı değiştirmek mümkün olmayacaktır.
2. Mikroakışkan Chips üretimi
- Boş bir plastik yerleştirindenge ve dara dengesine fincan. Plastik bardak (12 cm çapında cam petri için) içine 40 gr PDMS temel dökün. 4 ml 1:10 yani aw / w oranında bir pipet ile PDMS sertleştirici ekleyin.
- Birkaç dakika boyunca iyice PDMS ve sertleştirici karıştırın. Bu sertleştirme ajanı pipetle için kullanılan tek kullanımlık bir plastik pipet ile yapılabilir. Bu karışım, iyi gofret üzerine dökülmeden önce karıştırılır önemlidir. Kötü karıştırma polimerize değil PDMS bir parçası neden olur.
- Cam Petri kabındaki gofret üstüne PDMS dökün.
- Sertleştirme maddesi ile PDMS karıştırma PDMS karışımı içinde kabarcık oluşumuna yol açacaktır. Bu kabarcıklar PDMS polimerize önce kaldırılması gerekir. PDMS bir vakum pompasına bağlı bir desikatör içinde petri yerleştirerek gofret üstüne dökülerek sonra gazı alınmış olabilir. Bu kurulum ile, karışım tüm kabarcıklarını çıkarmak için yaklaşık 30 dakika sürer.
- Inci polimerizeBir saat boyunca 65 ° C de 1 saat karıştırıldı ve daha sonra 120 ° C'de sıcak bir levha üstünde gofret ile Petri kabı yerleştirerek e PDMS.
- Cam Petri kabı gofret ve polimerize PDMS ile birlikte alüminyum folyo çıkarın. Alüminyum folyo ve gofret arkasından polimerize PDMS ince kalan tabaka soyun. Gofret üstüne PDMS katmanı sonra dikkatlice yukarı kaldırarak gofret ayrılabilir.
- Bankta ters (yukarı bakacak şekilde kanalları) PDMS katmanı yerleştirin ve bir neşter ile dikkatle PDMS baskılı tek bir yonga tasarımları kesip. Daha sonra cam kapak için çip eki geliştirmek için kanal kenarlarında PDMS yaklaşık 3 mm korumak için deneyin.
- Düz bir şekilde PDMS aracılığıyla 20 Ölçer Luer saplama tüm yol iterek giriş, çıkış ve yan kanal (Şekil 2A) uçlarında PDMS içinde delikler.
Emin olun PDMS çipdelik delme ise hala bankta ters yatıyor. Bu kanalın tıkanmasına neden olabilir kanal içine yapışmasını PDMS engeller.
- Her delik delme sonra, tekrar saplama çekerek önce cımbız ile Luer saplama içinde PDMS sütun çıkarın. PDMS sütun aksi geride kalmak ve sadece delikli delik engelleyebilir.
- Üzerinde viski bant yerleştirerek ve hemen tekrar bant kaldırarak toz parçacıkları ve artık PDMS gelen çip yüzeylerini temizleyin. Aynı çip takılacak için cam kapak temizleyin.
- Tezgah üstü UV-Ozon Cleaner UV lamba altında temizlenir çip ve cam kapak yerleştirin. Birbirine bağlanmış gereken iki lamba bakmalıdır.
- PDMS ortaya çıkarmak ve 6-8 dakika UV ışık cam kapak ve doğrudan daha sonra birbirlerinin üstüne yüzeyler yerleştirerek kapak camına çip koymak.
- Yavaşça çip kenarından dokununcam kapak için PDMS eki teşvik etmek ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için. Bu micropads de cam kapak bağlı olsun neden olabilir gibi kanal yapısı üstüne dokunmayın.
- 60 dakika için 100 ° C sıcak bir plaka üzerinde yeni yapılan mikroakışkan kurulum yerleştirin. Biraz PDMS çip kenarları kaldırmak için deneyerek kapağı cam ve PDMS çip arasındaki bağ gücünü test edin. PDMS blok cam yüzeyinden kaldırılması mümkün olmayan zaman, bir bağın başarılı olduğu ve çip kullanıma hazır hale gelir.
3. Hücre Yükleme için Chip hazırlanması
Bir mikroakışkan cihazın arızası potansiyel mikroskop içine orta kaçağı neden olabilir. Bunu önlemek için, bir metal tutucu ve / kullanabilir veya PDMS oje veya epoksi yapıştırıcı ile cam karşılayan çipin iki mühür tavsiye niteliğindedir. Bu PDMS yonga, cam için yeterince bağlı değildir durumunda orta sızmasını önler. Aynı zamanda, borununbağlantı orta kaçağı önlemek için benzer bir şekilde ekleme noktaları etrafında güvence altına alınabilir. Kaçak durumunda şırınga pompası kapanır bir ev yapımı su sensörü ekstra bir güvenlik önlemi olarak kullanılabilir. Özellikle mikroakışkan çip için tasarlanmış metal sahibinin Çizimler yazarlar elde edilebilir.
- Çipin cam ve su geçirmez bir mühür oluşturmak için sahibinin metal parçalar arasında silikon jel ile, metal tutucuya mikroakışkan çip yerleştirin. Cam kırmak için değil, yavaşça fındık vida.
- Ince tüpler (yaklaşık 5-15 cm uzunluğunda) yan kanal ve çip çıkış kanalına bağlayın. Cımbız kullanımı daha kolay deliklere boru eklemek için yapar.
- Kültür ortamı ile 50 ml Luer-Lok şırınga doldurun, şırınga hava çıkarın ve bir şırınga filtresi, 20 Ölçer Luer saplama, kısa kalın boru (yaklaşık 2 cm uzunluğunda) ve ince bir tüp sıralı bağlayın. Emin olun ince küvete şırınga pompası ve mikroskop sahne arasındaki mesafe span yeterince uzun.
- Hızlı ileri ince bir tüp kadar pompa tamamen ortam ile doldurulur, şırınga pompası şırınga yerleştirin.
- Çipin giriş kanalının içine şırınga bağlı olan ince bir tüp itin ve 10 ul / dak (Şekil 2B) olan çip yoluyla orta akışını sağlar. Çip (bir Petri kabındaki gibi) bırakarak orta toplayın. Orta çünkü Sert Tag büyük yan kanal ve çıkış kanal yapılan arasındaki direnci fark yan kanalı üzerinden tükenecektir.
- Mikroskop aşamasında çip yerleştirin ve yastıkları mikroskop odağı ayarlayın.
Petrol Deney zaman boyunca kurumasına değil çünkü immersiyon yağı hedeflerinin kullanımı suya daldırma hedeflerinin bu tercih edilir.
Mikroskop bağlı olarak f istinat ile ilgili sorunlar olabilirDeneyin ilk saatlerde ocus. Bu hücreler yükleme ve deney başlamadan önce yerleşmek böylece mikroskop aşamasında bir iki saat için çip bırakmak nedenle tavsiye edilir.
4. Mikroakışkan Chip içine Maya Hücreleri yüklenmesi
- 20 Ölçer Luer saplama ve kalın bir tüp (yaklaşık 3 cm) bir 5 ml Luer ucu şırınga bağlayın.
- Yonga içine yüklenecek hücre kültürü bir örnek alın.
Yükleme için tercih edilen hücre sayısı, ml başına 1-5 x 10 6 hücre arasındadır. Yüksek hücre sayısı ile kültürleri yüklemeden önce seyreltilmesi gerekir. Hücreler ilk olarak suyla yıkandı ve yüklemeden önce benzer bir glukoz yüzdesi içeren minimal ortamda yeniden süspanse edilir ise YPD kültür hücreleri, hücre yükleme verimliliği birçok kat geliştirilebilir zaman. Çip işlemi sırasında, YPD ortamı daha güvenli bir şekilde kullanılabilir.
- Th içine hücre süspansiyonu, yaklaşık 1 ml yüke şırınga ve şırınga tüm hava çıkarın.
- 0.5 ul / dak şırınga pompa akış hızı azaltın. Yükleme sırasında şırınga pompası (adım 4.5) tarafından uygulanan düşük ve sürekli akışı yan kanal (Şekil 2C) ile olmayan bağlı hücreleri itecektir.
- Çıkış kanalının tüp hücre süspansiyonu içeren şırınga bağlayın. Yavaşça şırınga pistonu üzerine basarak hücreleri yerleştirin. Gelen ve göz ile micropads altında veya bilgisayar ekran üzerinden yerleşme hücreleri dikkat edin.
- Yeterli hücreleri yastıkları altına yerleşmek kadar piston üzerindeki basıncı koruyun. Optimum yük ped başına 1-3 hücredir. Hücreleri rastgele yastıkları altında yerleşmek gibi, birkaç yastıkları herhangi bir hücre ve diğer yastıkları tamamen hücrelerle doldurulur içermeyen oldukça yaygındır.
- Hücre yükleme ve çıkış kanalının ince borudan buna bağlı olan kalın bir tüp için kullanılan şırınga çıkarın, yan kanal hizadayüksek akış oranları (10 ul / dk) de birkaç dakika için annel hava kabarcıkları ve / veya henüz yonga (Şekil 2B) çıkmak yoktu hücreleri çıkarmak için. Hücreler yan kanal kaldırılmaz, bunlar yan kanalda büyümeye başlar ve daha sonra deney engelleyebilir.
- Geri 0.5 ul / dk için şırınga pompası akışını koymak ve sonuna (Şekil 2B) bir kateter fişi içeren kalın bir tüp (yaklaşık 5 cm uzunluğunda) bağlayarak yan kanal kapatmak.
- 1-5 ul / dakikalık nihai bir akış oranına akışını artırır. Akış hızları orta ve maya suşu bağlı olarak değişebilir.
- Deney hedef için uygun mikroskop ve kamera ayarları ile bir film başlar. Mikroskop sahne hızını yağ takip edebilirsiniz böyle bir düşük hıza ayarlanmış olduğundan emin olun. Replikatif ömrü, görüntü hücreler her 10 dk belirlenmesi için. Halojen tarafından yayılan UV ışığının az miktarda hücreleri korumak içinDIC satın alma sırasında kullanılan lamba, ışığın yolunda ek bir UV filtresi yerleştirilmesi tavsiye edilir. Floresan mikroskobu kullanarak, bu fototoksik etkileri önlemek için (örneğin her 20 dakikada bir) daha az sıklıkla görüntü hücreleri tercih edilir. Deney Deney başlangıcında yüklenen tüm hücreler, normal koşullar altında 5 gün öncesine kadar sürer, ölü zaman tamamlanır. Düzenli olarak deney sırasında görüntülerin odak kontrol edin ve gerekirse ayarlamak için tavsiye edilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu protokol, hücreleri doğrudan orta-üstel kültür mikroakışkan çip yüklenir. Mikroakışkan çip sıkışıp hücrelerinin yaş dağılımı yükleme öncesi kültürünün benzer olup olmadığını tespit etmek için, hücreleri tomurcuk izleri görselleştirmek için FITC konjuge buğday agglutinin (WGA-FITC) ile boyandı. Şekil 3'te görülebileceği gibi, mikroakışkan çip micropads altında hücrelerin tuzak belirli bir yaştaki hücrelere yanlı değildir.
Replikatif ömrü sadece tek bir ana hücre tarafı...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan mikroakışkan yöntem sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme ile birlikte maya replikatif ömrü veri basit ve otomatik nesil sağlar araştırma yaşlanma önemli bir yeni bir araçtır. Bu özellikler, klasik diseksiyon yöntemi deneysel olanakları üzerinde büyük gelişmeler, yine dikkate alınması gereken bir yöntem bazı sınırlamalar vardır.
Bir MicroPad altında tutulur her hücre (komşu bir hücrenin tomurcuklanan hücre örneğin ondan itin olabilir çip yıkanabilir belirli bir ol...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Biz mitokondriyal morfolojileri puanlama için hücre yükleme protokolü ve Marcus de Goffau ve Guille Zampar ilk sürümü yazmak için Laura Schippers teşekkür etmek istiyorum.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | Bu paket, PDMS tabanı ve PDMS kürleme maddesi içerir. |
| Cam petri kapları 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Kapak camları 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Sert Etiketler | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Alüminyum folyo | |||
| Plastik tek kullanımlık bardak | |||
| Serolojik pipet 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Scotch bant | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone macunu (GE Bayer silikonları) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE mikro delikli boru, 0.012 "ID x 0.030" OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | İnce boru olarak adlandırılır |
| Tygon mikro delikli Boru, 0.030 "ID x 0.090" OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Kalın boru olarak adlandırılır |
| Neşter | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok şırıngalar | BD | ||
| 5 ml şırıngalar, Luer ucu | VWR International | 613-1599 | |
| Cımbız | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer saplamaları | Instech Solomon | LS20 | |
| Şırınga filtreleri (gözenek boyutu 0.20 μ m) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Paslanmaz çelik kateter Tapası, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petri kapları | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENT | |||
| Tezgah Üstü UV-Ozon Temizleyici | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pompa 11 Elite | Harvard Aparatı | 70-4505 | |
| SU-8 silikon ana kalıp (gofret) | Kendi kendine yapılan; Ayrıntılar için ilgili yazarla iletişime geçin | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vakum pompası | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Kurutucu | VWR International | 467-2115 | |
| Sıcak plaka | VWR International | 460-3267 | |
| Opsiyonel: Kapak camı için metal tutucu (22x40 mm) | Self; Ayrıntılar için sorumlu yazar | ||
| (Floresan) ile iletişime geçin: 60x objektif, otomatik odaklama, hızlandırılmış çekim özelliklerine sahip mikroskop ve tercihen otomatik (motorlu XY kontrolü) aşaması | Nikon | Eclipse Ti-E |
Kaynaklar
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
