Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları

12.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50145

⸱

12 Mart 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Clinical Research Center (ECRC), Charité Medical Faculty and Max-Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Medical Department, Division of Cardiology, Campus Virchow-Klinikum, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Medical Department, Division of Cardiology and Angiology, Campus Mitte, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Bu makalede

Özet

Kv kanal disfonksiyonu kardiyak aritmiler ile ilişkilidir. Biz Kv kanal yan altbirim knockout farelerde atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu için sistematik bir protokol kullanmak gibi aritmiler neden moleküler mekanizmaları incelemek için. İzole kardiyomiyositlerde hemen sonra hücresel elektrofizyolojik çalışmalar, biyokimyasal ya da immunofloresan (IF) deneyleri için de kullanılabilir.

Özet

KCNE genlerin fonksiyonel özelliklerini değiştirmek için Kv kanalı alfa alt birimden heteromerik kompleksler oluştururlar Kv kanal yan altbirimden küçük bir aile için kodlamak. KCNE genlerdeki mutasyonlar gibi uzun QT sendromu ve / veya atriyal fibrilasyon gibi kardiyak aritmiler olan hastalarda bulunmuştur. Bununla birlikte, bu hastalıklara yol açan belirli moleküler patofizyolojisi belirsiz kalır. Önceki çalışmalarda bu genlerdeki mutasyonların sebep olan hastalığın elektrofizyolojik özellikleri çoğunlukla heterolog ekspresyon sistemleri incelenmiş ve rapor edilmiş etkileri doğrudan yerli kardiyomiyositlerde tercüme edilebilir eğer biz emin olamayız. Laboratuvarımızda bu yüzden farklı bir yaklaşım kullanır. Biz görüntülenmiştir Deneyleri Dergisi bu sayısında tanımlayan benzersiz bir teknik - Biz doğrudan hücresel elektrofizyoloji tarafından nakavt farelerin izole kardiyomiyositlerde KCNE gen delesyonu etkilerini incelemek. Genetica gelen kalplerlly mühendislik KCNE farelerin hızla eksize ve aort kanülasyon tarafından Langendorff aparatı monte edilirler. Miyokardda Serbest Ca 2 + EGTA tarafından bağlanır ve kardiyak miyosit dissosiasyon ardından özel bir düşük Ca 2 + tampon içeren kollajenaz ile koroner arterlerin retrograd perfüzyon elde edilir. Atria, serbest sağ ventriküler duvara ve sol ventrikül sonra, mikrocerrahi teknikler ile ayrılabilmektedir. Kalsiyum sonra yavaş yavaş işlem çamaşır içeren bir çoklu adım izole kardiyomiyositler tekrar ilave edilir. Spontan kontraksiyonları ile sağlıklı görünüm Atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde sonra hemen izolasyonu takiben ilk 6 saat içinde yama klemp tekniği veya diğer biyokimyasal analizler ile elektrofizyolojik analizlere tabi tutulmaktadır.

Protokol

1. Hayvan Anestezi ve Organ Toplama

  1. Ketamin (200 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile fare narkoz.
  2. Kan pıhtılaşması ve trombus oluşumunu önlemek için 250 IU Heparin ip enjekte antikoagülan için.
  3. Derin narkoz arefleksi ile karakterize olan, ulaşılana kadar bekleyin. Hafifçe kuyruk çimdikleme kornea veya test uçuşu refleks dokunarak arefleksi, test korneal refleks kontrol etmek için.
  4. Ameliyat masasının üzerine fare aktarın ve yatar pozisyonda sabitleyin.
  5. Cilt ve kılıç şeklinde aşağıda karın duvarı kesilirken ve kapaklı torakotomi gerçekleştirin: kosta kemer boyunca her iki taraf için kesme uzatın ve daha sonra medial aksiller hat kaburga kesilmiş, göğüs kafesi yukarı saptırmak.
  6. , Perikard aç büyük damarları bulmak. Yavaşça iyi aorta görüntülemek için kalp kaudal basın. Forseps kullanarak aort Kelepçe.
  7. Nin bir çift içbükeylik olarak kalp yerleştirin cissors ve tek kesim ile tüm bağlantı damarları teşrih. Langendorff kanülasyon için asendan aort yeterince büyük bir bölümünü korumak için emin olun.
  8. Buz gibi soğuk ve pre-Oksijenli çözümü 1 (çözümler için, bkz Tablo 1) ile dolu bir Petri kabı hemen çıkarılarak kalp aktarın.

2. Kalp ve Langendorff Perfüzyon hazırlanması

  1. Bir 1.8F çelik kanül ile aorta kanüle. Hava embolisi önlemek için emin olun.
  2. Çözelti 1 1 ml olan bir cerrahi dikiş ve çalkalama ile koroner aort kanülünün üzerinde sabitleştirmek.
  3. Langendorff aparatı ile kanül takın.
  4. Torakotomi gelen Langendorff kanülasyon için zaman emin olun miyokarda Uzamış iskemi / reperfüzyon hasarı önlemek için 120 sn aşmaz.
  5. Ca 2 10 ml serpmek kalp + serbest çözelti 2 (4 ml / dak.)
  6. 8 dak (4 mL / dak) kollagenaz için çözelti 3 ile serpmek kalp.
Kardiyak Chambers le "> 3. Mikrocerrahi Ayrışma

  1. Düşük Ca 2 + çözümü 4 içeren önceden ısıtılmış 100 mm Petri kabı içine Transferi kalp.
  2. Dikkatlice makas ile aort ve diğer non-kardiyak doku kaldırmak ve atın.
  3. Ayrı atriyumlar ve ventriküller ve ayrı ayrı her odası ile devam edin. Çözüm 4 dalmış hücreleri tutun. Küçük hacimli (az 5 ml) kullanın.

4. Kardiyomiyositlerin Diğer Ayrışma

  1. Atriyal kardiyomiyositlerde:
    1. Atriyal kardiyomiyositlerde ayrı önceden ısıtılmış 100-mm kültür çanak içine kulakçıklar aktarmak ve nazikçe ince forseps ile didik didik dokuya disosiye bireyselleştirmeye için. Dokusunun neredeyse tam bir ayrışma olun.
    2. 5 dakika boyunca çözelti 5, 1 ml hücre askıya almak için büyütülmüş bir ateş cilalı bir plastik pipet ucu ile bir 1 ml pipet kullanın.
    3. Bir hücre filtresi (200 mikron göz açıklığı) kullanılarak artıklardan hücreleri ayırın.
    4. 5 ml hücre süspansiyonu ile çözelti 5 ve oda sıcaklığında 16 x g'de 2 dakika süre ile santrifüje ekleyin.
    5. Aşağıdaki adımlar, bir hücre kültürü kaputu altında işletilmektedir. 6 çözelti 5 ml süpernatant ve yeniden askıya pelet atın.
    6. Bir 15 ml tüp içinde 10 dakika boyunca yerçekimi ile sedimantasyon sonra, oda sıcaklığında 16 xg'de 1 dakika süreyle santrifüjlenir. Süpernatantı. Solüsyonu 6 1-5 ml kendi miktar bağlı hücreleri yeniden askıya.
  2. Ventriküler kardiyomiyositlerde:
    1. 4. çözelti 5 ml ince forseps ile söz konusu sol ventrikül bölge teşrih.
    2. Hücrelerin en ayrılır kadar yavaşça pipetle hücreler süspanse edin. 50 ml'lik bir tüpe (200 mikron göz açıklığı) filtrelenmesinden sonra çözelti hücre transferi, 25 ml'lik bir hacme ekleyin.
    3. Oda sıcaklığında 16 x g'de 2 dakika süre ile santrifüje.
    4. Aşağıdaki adımlar, bir hücre kültürü kaputu altında işletilmektedir. Süpernatantı, 25 ml pelet yeniden askıya6 ve çözelti 10 dk için hücrelerin sedimantasyon izin verir.
    5. Hücreleri sayın ve süpernatant kaldırmak, 25 eklemek - 50 ml çözelti 6 hücreleri üzerinde.

5. Biyokimyasal Hücresel Elektrofizyoloji, ya Çalışmaları IF kardiyomiyositlerin hazırlanması

  1. Elektrofizyolojik çalışmalar için, bir 50 ml tüp içinde çözelti halinde 6 miyositleri tutmak ve sedimantasyon inhibe ederler.
  2. Için biyokimyasal çalışmalar, örneğin kalsiyum görüntüleme, laminin kaplı hücre kültürü çanak tabak miyositler (son konsantrasyonu 20 mg / PBS ml laminin).
  3. Immunofloresan boyama cam kapak slipleri ile bir hücre kültürü çanağı plaka hazırlamak ve laminin çözeltisi (nihai konsantrasyon 50 mg / ml PBS içerisinde laminin) ile kaplanmış için.
    1. Kaplama miyositlerin önce çözüm çıkarın. Levha hücreleri ve bir mikroskop kullanarak, hücre yoğunluğu kontrol eder.
    2. % 2 CO2 içinde 37, 1 saat boyunca kayma ° C kapsayacak şekilde miyositleri bağlı olsun, çözelti çıkarmakve standart bir boyama işlemi protokolü ile hemen başlayabilirsiniz.
    3. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde sabitleştirici, örneğin,% 4 PFA (pH 7.5) ile inkübe edin ve 5 dakika her biri için üç PBS yıkama adımları ile takip.
    4. Hücreler geçirgenliği ve spesifik olmayan bağlayıcı antikor% 10 serum ve% 0.3 Triton, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 BSA ile miyositleri inkübe inhibe etmek.
    5. 37, 1 saat boyunca birincil antikor ile inkübe ° C ve daha önce anlatıldığı gibi yıkayın.
    6. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle ikincil antikor ile inkübe edin. Çekirdekler counterstain ve α-aktinin kullanımı DAPI ve florokrom konjuge phalloidin (Alexa Fluor 488, Invitrogen) için.
    7. Yıkadıktan sonra, cam kapak floresans montaj orta silan tedavi mikroskop slaytlar ve embed hücreleri üzerinde dikkatle kayıyor aktarın.

6. Hücresel Elektrofizyoloji

  1. Fre üzerine Tüm-hücre yama klemp kayıtları yapınshly oda sıcaklığında atriyal ve ventriküler kardiyomiyositlerde izole.
  2. Ekstrasellüler banyo solüsyonu tanımlı ses ile dolu perfüzyon odasının içine sağlıklı görünmesini kardiyomiyositlerde aktarın. 117 mM NaCl, 4 mM KCI, 1 mM KH 2 PO 4, 4 mM NaHCO 3, 1,7 mM MgCl2, 3 mM CoCl 2, 10 mM HEPES, 10 mM glukoz, ve 0.02 mM Tetrodotoxin (TTX), (pH 7.4) . PH değeri ayarı için NaOH kullanın.
  3. (Yani IX71 inverted mikroskop, bir Multiclamp 700B Amplifikatör, pClamp10.3 yazılımı (Moleküler Cihazlar) ile Digidata 1440A toplama sistemi ve PC) düzgün yama kelepçe teçhizat kullanın.
  4. 2. CP Na 130 mM KCl, 2 mM MgCl2, 11 mM HEPES, 11 mM EGTA, 5 mM Na 2 ATP, 0.4 mM Na 2 GTP, 5 mM ihtiva eden hücre içi solüsyonu ile dolu olduğunda MΩ 3-5 arasında dirençleri ile yama pipet kullanarak ve 4.9 mM CaCl2 (pH 7.2). PH değerinin ayarlanması için KOH kullanın.
  5. Dışa K + akımları du Evokehalka 4.5-sn voltaj adımları -60 ve 20 ms -40 mV prepulse sonra -70 mV tutarak potansiyelinden 10 mV adımlarla +50 mV arasında potansiyelleri test etmek.
  6. Sızıntı akımları her zaman <100 pA olduğundan emin olun.
  7. , Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) veya tetraetilamonyum (TİM, Sigma); farklı K diseksiyonu için + akımları gibi 4-aminopiridin (ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA 4-AP) gibi spesifik inhibitörleri kullanmak. Stok çözeltileri ekstraselüler banyo solüsyonu olarak hazırlanmış ve "temel" kayıt sonra bir mikro tip yoluyla hücre olası en yakın çevresine doğrudan doğruya uygulanabilir. Dengeleme "ilaç" kayıtları önce 2-3 dakika süreyle izin verilmelidir.
  8. Analizi için hücre boyutu ayrı ayrı hücrelerde (tam hücre zarındaki kapasitans) akım genlikleri normalleştirmek. PClamp10.3 yazılımı (Moleküler Cihazlar) veya benzer yazılımları kullanarak çevrimdışı verileri analiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

In vitro ilgi belirli genlerin işlevini incelemek için genetiği değiştirilmiş farelerin erişkin fare kardiyomiyositlerde izolasyonu daha da kardiyak patofizyoloji anlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir. Bu yöntem, şu anda dünya çapında temel bilim laboratuarları sadece bir küçük ama artan sayıda tarafından kullanılır. Ancak, yetişkin ventriküler murin kardiyomiyositlerde izolasyonu zor ve tecrübeli eller tarafından iyice ve tekrarlı yapılması gerekiyor olabilir. Şekil 1 taze izole timsali...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Gen delesyonu ile ilgili kardiyak fonksiyon ve kardiak patoloji incelemek için GDO'lu fare suşları artan gelişimi ile in vitro spesifik gen silinmesi etkilerini incelemek için özel yöntemler giderek artan bir ilgi de var. Laboratuarımızda kardiyak repolarizasyon üzerine Kv kanal yan alt birimden bir aile rollerini incelemek. KCNE genler KCNEs kendi üzerinde herhangi bir potasyum akımları geçemez tek transmembran alanı Kv kanal yan alt birimden vardır. Insan ventriküler ve atriyal repolariz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Teşekkürler

Bu çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Fritz-Thyssen-Stiftung ve Charité / MDC hibe tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif Adı Şirket
Tetrodotoxin Alomone
4-aminopiridin ICN Biomedicals
2 Heteropodatoxin Alomone
Tetraetilamonyum Sigma Kimyasallar
Kollajenaz Tip 2 Worthington

Kaynaklar

  1. Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs? Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
  2. Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
  3. Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels? Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
  4. Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
  5. Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
  6. Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
  7. Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
  8. Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
  9. Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
  10. McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. The MinK-related peptides. Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).
  11. Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
  12. Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
  13. Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
  14. Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
  15. Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
  16. Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
  17. Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. Atrial fibrillation in KCNE1-null mice. Circ. Res. 97, 62-69 (2005).
  18. Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
  19. Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
  20. Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kardiyomiyosit zolasyonuT m H cre Yama KenetlemeKCNE Gen NakavtLangendorff Perf zyonuKollajenaz DisosyasyonuAtriyal Ventrik ler Ay rmaKalsiyum Yeniden EklenmesiVoltaj Kap l Potasyum Ak mlarMikro u la UygulamasP Clamp Yaz l m
Mürin Atriyal ve Ventriküler kardiyomiyositlerde izolasyonu ve Kv Kanal Kayıtları
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.