Bakteriyel Prostatit bir fare modelinde Dokunsal allodini Ölçümü

Marsha L Quick; Joseph D Done; Praveen Thumbikat

doi:10.3791/50158

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Bakteriyel Prostatit bir fare modelinde Dokunsal allodini Ölçümü

16.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50158

⸱

16 Ocak 2013

Marsha L Quick¹ , Joseph D Done¹ , Praveen Thumbikat¹

¹Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

Bu makalede

Özet

Prostat enfeksiyonu kronik prostatit pelvik ağrı arabuluculuk katkıda bulunan bir faktör olabilir. Biz standardize edilmiş bakteriyel inokulum, zamanla farelerde dokunsal allodini ölçmek için erkek farelerde ve metodoloji üretra içine bakteri instilasyon hazırlama prosedürü açıklanmaktadır.

Özet

Üropatojenik Escherichia coli (UPEC) idrar yolu enfeksiyonları ve bakteriyel prostatit ¹ önemli bir rol oynamaktadır patojenlerdir. Biz son zamanlarda UPEC kronik pelvik ağrı ^2, Kronik prostatit / kronik pelvik ağrı sendromu (CP / CPPS) ^3,4 bir özelliği başlatılmasında önemli bir role sahip olduğunu göstermiştir. Klinik UPEC ile prostat enfeksiyonu doku hasarı ve otoimmünite ⁵ mekanizmalarının başlatılması içerebilir mekanizmalar yoluyla kronik ağrı başlatmak ve kurabilir.

Prostat UPEC patogenezini anlamak için bir meydan okuma manipülasyon prostat bezinin nispi erişilememesi olduğunu. Böylece de prostat bir artan enfeksiyon oluşturma erkek farelere UPEC bir klinik suşu vermek üzere, daha önce anlatılan intraüretral enfeksiyon yöntemiyle ⁶ kullanılmıştır. Burada, biz ba standartlaştırılması için protokoller tarifgibi bakteri perfüze anestetize erkek fareler catheterizing için işlem olarak cterial inokulum ^7.

CP / CPPS öncelikle dokunsal allodini ⁴ varlığı ile karakterizedir. Davranış testleri ifade viseral ağrı ^8-10 kaynaklanan kutanöz hiperaljezi kavramına dayanmaktadır. Visseral dokularda bir irritabl odak normal olmayan ağrılı uyaranlar (allodini) için abartılı bir tepki veren Kutanöz ağrı eşikleri azaltır. Yatan visseral ağrının şiddeti ile artış eğilimindedir anormal yanıtları cilt sonucu normal kuvvet uygulanması. Bu UPEC bakteri ile bir tek enfeksiyonuna yanıt olarak zaman içinde dokunsal allodini ölçmek için von Frey lifler kullanmak NOD / ShiLtJ farelerde yöntemi açıklanmaktadır.

Protokol

1. Fare Aşılama için bakteri Hazırlık

Aşağıdaki aseptik koşullar altında yapılmalıdır.

Kapakları biri 17 x 100 mm polipropilen tüpler atın ve taze Luria broth (LB) medya 3 ml ekleyin. Otoklavlanmış ipuçlarını kullanarak, gerginlik CP1 ² bazı dondurulmuş bakteri gliserol stok almak ve LB ortamı içeren tüpe kültürünün küçük bir miktar transfer. Oksijen yine tüp girebilir, böylece tüp kapak değiştirin - kültür aerobik koşullar altında büyüyebilir gerekmektedir. 37 Sıra tüp ° gecede 220 rpm'de bir sallayarak inkübatör C.
Ertesi gün, 3 ml LB ortamı ile yeni bir tüp vermek üzere gece boyunca kültür 5 ul aktarmak ve 37 ° C 'de bir gece boyunca kuluçka makinesi içinde statik koşullar altında büyüyebilir
Günde aa 50 ml tüp içinde 3 taşıma kültürün 40 ul, 40 ml LB ortamı her içeren. 37 ° C sabit inkübatör gecede yerleştirin.
Açın ve 4 ° C'ye santrifüj ayarlayınBir kez santrifüj son sıcaklığa ulaştığını, 40 ml Nalgene santrifüj tüpüne her 40 ml kültürü aktarmak.
Gerektiğinde LB medya ile ses seviyesini ayarlamak - santrifüj dengelemek için tüpleri tartılır. 20 dakika boyunca 6000 rpm'de tüpler Spin.
Dikkatlice süpernatant kaldırmak ve yavaşça 40 ml steril PBS bakteriyel pelet askıya.
PBS ile adım 1.5 tekrarlayın.
Süpernatantı kapalı aspire ve 500 ul steril PBS içinde bakteri askıya. 1.5 ml mikrofuge'de tüpüne çözümü aktarın. Süspansiyonu 10 ul alın ve buz gibi soğuk PBS 990 ul seyreltin. Aşılama için gerekli hacim belirlemek için OD _{420 nm} okumak için bir spektrofotometre kullanın. Uygun miktarda belirlemek için buz gibi soğuk PBS içinde pelet askıya: OD _{420 nm} sayısı (ml) alın ve bakteriyel pelet [ex tahmini hacmi çıkarın. OD _{420 nm} = 0.545, pelet yaklaşık 0.075 ml. 0,545-0,075 = 0,470].
10. Bakteriyel süspansiyon ul ve di kaldırma990 ul buz gibi soğuk PBS içinde ud. OD _{420 nm} okuyun. Hedefi 1.000 seyreltilmiş süspansiyonu ± .010 bir OD _{420 nm} değeri elde etmektir. Sizin seyreltme sayısı bu hedefin üzerinde ise, süspansiyon daha fazla hacim kazandırmak ve başka bir okuma almak. Numarası altında ise 0,990 ardından istediğiniz okuma elde edilinceye kadar erteleme ve tekrar OD _{420 nm} okuma aşağı spin.

2. Hayvan Enfeksiyon

Fareler (5-7 haftalık, her grupta on) Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) 'den satın alındı.

Fare bir pleksiglas odasında izofluran% 1-4 solunması ile anestezi ve yatık kadar izlenir.
Bir seferde bir fare bir cam Hamilton şırınga (1.5-2.0 cm uzunluğunda) değiştirilmiş 30 G iğne takılı bir polietilen (PE10) kateter ile kateterizasyon ile bakterilerin instilasyonu için alınır. Kateter iğne merkeze yerleştirilir. Fare Plac olduğunued anestezi altında dorsal yüzeyi üzerinde bir burun konisi kullanılarak yapılmaktadır.
Fare penis penil üretra girişinde yağlanması için kullanılan hafif basınç ve pamuklu çubuk üzerine yağ bolca tarafından çekilmektedir.
10 ul fosfat-tamponlu 1 x 10 ⁸ bakteri içeren tuzlu kateterizasyon anestetize farelerin üretra içine katılmaktadır.
Bakteri bağlanma sağlamak için acil idrara çıkma ve önlemek için bakteri giriş sonra fareler pleksiglas bölme içinde 15 dakika süreyle bir anestezi altındaki bir durumda muhafaza edilir.
Fare onların tekrar kafeslerine yerleştirildi ve sonraki 24 saat boyunca izlenir.

3. Davranış Testi

Fare öncesinde enfeksiyon (bazal) ve gün 3, 7, 14, 21 ve enfeksiyon sonrası 28 üzerinde test edildi. Referans hiperaljezi ve dokunsal allodini karın ^11,12 ve plantar r uygulanan von Frey filamentleri kullanılarak test edildiarka pençe ¹³ egion. Test-saati günlük sabit bir de perfomed edildi, standart metodoloji ve tüm hayvanların tek deneyci testi kullanılmıştır. Grupların Kör test hayvan modellerinde davranış bazlı test ağrı ile ilgili sınırlamalar ile mücadele için kullanılmıştır. 0.04 arasında kuvvetler, 0.16, 0.4, 1.0 ve 4.0 g (Stoelting, ABD) ile beş ayrı von Frey filamentlerin çekilme yanıtların karın ve frekans uygulanmıştır hesaplanmıştır.

Alışma sürecinden bir 30 dakika süre sonra, fareler bir paslanmaz çelik tel ızgara taban ile evde yapılan bireysel pleksiglas odacığı (6 x 10 x12 cm) yerleştirilmiştir.
Referans hiperaljezi ve dokunsal allodini beş von Frey filamentleri kullanılarak test edildi. Her filament toplam 10 kez 5 sn bir uyarıcılar arası süre ile 1-2 saniye uygulandı ve tüyleri kuvvet artan düzende test edildi.
Her bir fılaman, prostat Genel çevresinde alt karın bölgesine uygulanır vebakım duyarsızlaştırma önlemek veya etkilerini "rüzgar" Bu bölgedeki farklı alanlarda teşvik götürüldü. Filamentler 10 kez toplam uyarımlar arasında en az 5 saniye aralıklarla 1-2 saniye için kuvvet artan sırada uygulanmıştır.
Davranış üç tip filament stimülasyon olumlu bir yanıt olarak kabul edilir: karın 1) keskin retraksiyonu; 2) hemen yalama veya filament stimülasyon alan kazıma; 3) atlama.
Tepki frekansı olumlu yanıt yüzdesi (10 üzerinden, 10 =% 50 örneğin 5 karşılıklar) olarak hesaplandı ve data cevabı frekans ortalama yüzdesi ± SE olarak rapor edildi
25'den fazla pozitif toplam taban yanıtları Hayvanlar çalışmanın dışında tutulmuştur.
Dokunsal allodini 0.04 güçleri, 0.16, 0.4, 1.0 ve 4.0 g ile von Frey filamentleri kullanılarak arka pençenin plantar bölgeye üzerinde test edildi. Medyan% 50 geri çekme eşiği (5) yukarı-aşağı tuşlarını kullanarak değerlendirildifilaman hafif bir açı kadar test 0.04 g filaman ile başlatılan yöntem arka pençenin plantar yüzeye dik olarak uygulanır. Filament olumlu bir yanıt gözlenmiştir kadar artan sırayla test edildi. Filament pozitif tepki testi pençe pençe ya yalama keskin bir geri çekilme ya olarak tanımlandı. Olumlu bir yanıt kaydedildi zaman bir sonraki daha zayıf filaman uygulandı, ve bir negatif cevap gözlendi, sonra bir sonraki daha güçlü bir filaman uygulanmıştır.
Açıklanan deneyler ve metodoloji incelenen ve onaylanan Northwestern Üniversitesi hayvan bakımı ile ve komite kullanabilirsiniz edilmiştir.