RNA tüm montaj yöntemleri birleştirerek In situ Hibridizasyon ve histoloji, gen ekspresyonu gelişen embriyonun hücre kaderi kararlar ile bağlantılı olabilir. Bu yöntemler deniz elasmobranchs uyarlanmış ve biyomedikal, toksikoloji ve karşılaştırmalı çalışmalar için model organizmalar olarak bu hayvanların kullanımını kolaylaştırmak edilmiştir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Adaptif bağışıklık var ve osmoregülasyon 1-3 için benzersiz mekanizmalara sahip en ilkel omurgalılar olarak Deniz elasmobranchs biyomedikal ve genomik çalışmalar için hayvan modellerinin değerlenir. Eşleştirilmiş ekleri ile en ilkel canlı çeneli-omurgalılar olarak elasmobranchs özellikle evrim ve gelişme çalışmaları için, evrimsel önemli bir model vardır. Deniz elasmobranchs ayrıca iklim değişikliğinin 4 ilişki sucul toksikoloji ve stres fizyolojisi incelemek için kullanılmıştır. Böylece, metodolojilerin geliştirilmesi ve adaptasyonu kolaylaştırmak ve çoklu biyolojik disiplinlerin bu ilkel omurgalıların kullanımını yaygınlaştırmak için gereklidir. İşte situ hibridizasyon ve gen ekspresyonu ve elasmobranchs hücre histolojisi çalışma histolojik teknikler RNA bütün mount başarılı uyum sunuyoruz.
Gen ekspresyonu İzleme gelişimsel başina bir işaretidir araçtırogists ve yaygın olarak gelişim süreçleri 5 incelemek için kullanılır. In situ hibridizasyon RNA bütün montaj gelişen embriyonun dokularda görselleştirme ve belirli bir gen transkript lokalizasyonu için izin verir. Bir genin mesajının ifade desen gelişimsel süreçler ve hücre kaderini belirleyen bir gen kontrol edebilir ne içgörü sağlayabilir. Farklı gelişim aşamalarında bir genin ekspresyonu desen karşılaştırarak, içgörü gelişimi sırasında gen değişikliklerinin nasıl rolüne elde edilebilir.
In situ 's tüm montaj dokuya gen ekspresyonu yerelleştirmek için bir araç sunarken, histolojik teknikler farklılaşmış hücre tipleri ve dokuların tespiti için izin verir. Histolojik lekeleri çeşitli işlevlere sahiptir. Genel lekeleri hücre morfolojisi vurgulamak için kullanılır, örneğin sırasıyla hematoksilen ve çekirdek ve sitoplazma genel boyama için eozin,. Vardır Diğer lekeleri spesifik hücre vurgulayabilirsiniztürleri. Örneğin, alcian mavi mucosaccharides belirlemek için yaygın olarak kullanılan bir katyonik leke bu yazıda leke. Alcian mavisi ile sindirim sistemi Boyanması mucosaccharides üreten goblet hücrelerinin dağılımının tespit edebilirsiniz. Kısa peptidler üzerine mucosaccharide bileşenlerinin değişimleri sindirim sistemi 6 içinde işlevi tarafından goblet hücreleri ayırt. Eşzamanlı in situ 's ve histokimyasal yöntemlerle RNA bütün montaj kullanarak, hücre kaderini belirleyen gen-spesifik ekspresyonu ile bağlantılı olabilir.
RNA in situ 's ve histokimyası yaygın olarak araştırmacılar tarafından kullanılıyor olmasına rağmen, deniz elasmobranchs onların uyum ve kullanımı sınırlı ve çeşitli başarı tanıştım. İşte elasmobranchs için geliştirilen ve benim laboratuvarda düzenli olarak kullanılan protokoller mevcut. In situ 'in hibridizasyon metodu ile de RNA daha fazla değişiklik farklı türler uyum için gerekli olsa da, burada p açıklanan protokolonların bilimsel araştırmalar için deniz elasmobranchs kullanımı uyarlamak isteyen araştırmacılar için güçlü bir başlangıç noktası rovide.
Protokol
Deniz Elasmobranchs in situ Hibridizasyon I. RNA Tüm Dağı
1. Embriyo Fiksasyon ve Hazırlık
- Skate embriyolar Ballard 7'ye göre düzenledi olabilir. Gen ifadesinin saptanması için en uygun aşamada ilgili doku bağlıdır. Paten sindirim sisteminde gen ekspresyonu izlemek için, aşamaları 27-30 Temmuz optimaldir.
- Yolk kesesi gelen embriyolar ayıran, PBS içine embriyo teşrih.
- 4'e bir 50 ml konik boru ° C'de hafif sallama ile taze olarak yapılmış% 4 paraformaldehit (PFA), 30 ml düzeltildi. 24 saat için düzelt.
- Iki kez oda sıcaklığında 15 dakika dönen için, PBT embriyon....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
L. farklı bölgelerinde alcian blue boyama örnekleri erinacea sindirim sistemi Şekil 2 'de gösterilmiştir. Globlet hücreleri içeren Asit musin sindirim sistemi boyunca leke alcian blue tarafından net bir şekilde görülebiliyor. Asit müsin dağılımı dolayısıyla fonksiyon farklılıkları yansıtan, sindirim sisteminin farklı bölgelerinde farklıdır. Asit müsin yüksek konsantrasyon distal barsakta (2b Şekil 2a ve 2c karşılaştırın) tespit edilirken Asidik müs.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Sunulan protokoller gen ekspresyonu izlenmesi ve farklılaşmış hücre türleri tespit için klasik yöntemlerdir ve deniz elasmobranchs kullanım için adapte edilmiştir. Bu protokollerin ayrıntılı değişiklikler farklı elasmobranch türlerin uyum için gerekli olabilir.
In situ 's RNA bütün montaj ile ilgili en yaygın endişe RNaz kontaminasyon riski ve böylece RNA probu ve endojen mesajları kayıplardır. İki yönleriyle dikkate alınması gerekir: Spastine Özgü Riboprop sentezi ve hibridizas.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Ben ifşa etmek başka bir şey var.
Teşekkürler
Benim laboratuvarda çalışmış ve bu protokollerin evrimine katkıda bulunduğu birçok lisans öğrencilerine teşekkür etmek istiyorum. NAT Skidmore-Sendika Ağı, hibe ÖDENEN bir NSF ADVANCE ile kurulmuş bir proje destek aldı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Tablo 4. Alcian Blue için reaktifler ve ekipman
td colspan="4">.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 10 x transkripsiyon tamponu | Roche | 11-465-384-001 | |
| DIG-RNA etiketleme karışımı | Roche | 11-277-073-910 | |
| RNAse inhibitörü | Roche | 03-335-399-001 | |
| RNA polimeraz - SP6 | Roche | 10-810-274-001 | |
| DNAseI, RNAseZ içermeyen | Roche | 10-776-785-001 | |
| Maya RNA'sı | Invitrogen | 15401-029 | |
| CHAPS | EMD-Millipore | 220201 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| DEPC (dietil pirokarbonat) | Research Organics | 2106D | |
| Moria Delikli | Kaşık Güzel Bilim Araçları | 10370-17 | |
| Netwell ekler | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 64713-00 | 6 oyuklu doku kültürü kaplarında kullanım için ağ kuyuları |
| 6 oyuklu doku kültürü plakası | Corning | 3516 | |
| Vidalı kapaklı cam sintilasyon şişeleri | Weaton Science Products | 986540 | |
| formamid | Fisher | BP227500 | |
| Proteinaz K | Invitrogen | 59895 (AM2542) | |
| NBT | 11585029001 | ||
| BCIP | Roche | 11585002001 | |
| Hidrojen peroksit, %30 | EMD | HX0635-1 | |
| Koyun serumu | VWR | 101301-478 | |
| glutaraldehit | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| tRNA | Roche | 10-109-541-001 | |
| Anti-DIG Fab Parçaları | Roche | 1137-6623 | |
| Tablo 3. RNA tam montaj in situ's için reaktifler ve ekipman. | |||
| % 1 Alcian Mavisi 8GS, pH 2.5 | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 26323-01 | |
| Nükleer Hızlı Kırmızı Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 26078-05 | |
| DPX Montajlı Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 13510 | |
| Parafin (Paraplast X-tra) | McCormick Bilimsel | 39503002 | |
| %10 Formalin, NBF | VWR | 95042-908 | |
| Vidalı kapaklı cam sintilasyon şişeleri | Weaton Science Products | 986540 | |
| Paslanmaz çelik taban kalıpları | Tissue-Tek | 4161-4165 | Birden fazla boyut mevcuttur. |
| Kasetler | Tissue-Tek | 4170 | |
| Slayt Isıtıcı | Fisher-Scientific | 12-594Q | |
| Doku Gömü | Leica Microsystems | EG1160 | |
| Mikrotom, döner | Leica Microsystems | RM2235 | |
| Tissue-Tek Slayt Boyama Seti | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 62540-01 | |
| Tissue-Tek 24-Slide Tutucu Elektron | Mikroskobu Bilimleri | 62543-06 | |
| Superfrost*Plus slaytları | Fisherbrand | 12-550-17< | |
Kaynaklar
- Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
- Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
- Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
