Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi

11.5K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50189

⸱

25 Mart 2013

 ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University , 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Bu makalede

Özet

Büyük tespit nöronlar (ile hayvanlarda Örneğin Yumuşakçalar), motorlu havuzları analiz hücre içi teknikleri kullanılarak yapılır 1,2,3,4. Son zamanlarda, biz ekstraselüler bireysel nöronlar teşvik etmek ve kaydetmek için bir teknik geliştirdi Aplysia'nın californica 5. Biz şimdi benzersiz bir şekilde tanımlamak ve motor havuzu içindeki motor nöronlar karakterize etmek için bu tekniği kullanmak için bir protokol açıklar.

Özet

Büyük tespit nöronlar (örneğin yumuşakçalar), motor havuzları analizi ile hayvanlarda intraselüler teknikleri 1,2,3,4 kullanılarak yapılır. Son zamanlarda, biz ekstraselüler uyarmak ve Aplysia'nın californica 5 bireysel nöronların kaydetmek için bir teknik geliştirdi. Biz şimdi benzersiz bir şekilde tanımlamak ve motor havuzu içindeki motor nöronlar karakterize etmek için bu tekniği kullanmak için bir protokol açıklar.

Bu ekstraselüler teknik avantajları vardır. İlk olarak, hücre dışı elektrotlar uyarmak ve kaydetmek nöronlar kılıf ile 5 arasındaki, bu nedenle kaldırılması gerekli değildir olabilir. Böylece, nöronların hücre içi olanlardan daha hücre dışı deneylerde sağlıklı olacaktır. İkinci olarak, eğer ganglion kılıf bağlantılarını uygun göre döndürülür, hücre dışı elektrodlar daha kolay ve daha verimli aynı hazırlanmasında birden nöron tespit edilmesini sağlar gangliyon, her iki tarafına da nöronlar erişebilir. Üçüncü olarak, ekstraselülerlar elektrotlar hücreleri nüfuz gerek yok, ve böylece onları kolayca daha az zarar, nöronlar arasında ileri ve geri hareket ettirilebilir. Bir tek dakika sürebilir motor desenleri yinelenen sırasında birden nöronların kaydetmek için çalıştığında bu özellikle yararlıdır. Dördüncü olarak, ekstraselüler elektrotlar kas hareketleri sırasında intrasellüler olanlardan daha esnektir. Hücre içi elektrotlar çekin ve kas kasılmaları sırasında nöronlara zarar verebilir. Hücre dışı elektrotlar yavaşça nöronlar üzerinde kılıf üzerine basıldığında bu yana Buna zıt olarak, genellikle kas kasılmaları sırasında aynı nöron üzerinde kalmak ve böylece daha sağlam preparatlar da kullanılabilir.

Soma büyüklüğü ve yeri, aksonal yansıtma, ve kas innervasyon 4: benzersiz bir hücre dışı elektrotlar kullanılarak bir motor havuzu (özellikle, Aplysia olarak I1/I3 kas) için motor nöronlar belirlemek için, bir kriter olarak hücre içi ölçüm gerektirmezler özelliklerini kullanarak6,7. Tekniğin göstermek için kullanılan özel motor havuz için, aksonal projeksiyonlar ölçmek için bukkal sinirlerden 2 ve 3 kaydedilir ve tek tek motor nöronlar, kas innervasyonunun model belirlemek için I1/I3 kas kasılması güçler ölçülür.

Daha sonra hızlı bir tanımlama için basitleştirilmiş bir tanı yöntemi oluşturarak, motor desenleri sırasında zamanlama karakterize, kas innervasyonu kullanarak ilk tanımlayan motor nöronların tam işlem gösterilmektedir. Basitleştirilmiş ve daha hızlı tanı yöntemi askıya bukkal kütle hazırlama 8 veya in vivo 9 örneğin, daha sağlam hazırlıkları için üstündür. Bu işlem, aynı zamanda 2,3,13,14 Aplysia ya da diğer hayvan sistemleri içinde 10,11,12 diğer motorlu havuzlarda uygulanabilir.

Protokol

1. Kayıt Bulaşık hazırlanması

  1. Kuvvet dönüştürücü deneyleri sırasında, bukkal ganglionlar, serebral ganglion ve bukkal toplu kuvvet çalışmaları için uzmanlaşmış bir yuvarlak borcam tepsiye yerleştirilir.
  2. Deneylerde ingestive gibi desenler indüklemek için, serebral ganglion 15 non-kolinerjik hidrolizlenebilir karbakol uygulamak gerekir. Bukkal ganglia ve bukkal kitle üzerine karbakol doğrudan temas önlemek için, ayrı odaları bukkal ganglia ve bukkal kütlesi (Şekil 1) serebral ganglion yalıtmak için gereklidir.
  3. Bukkal kitle bukkal ganglionlar daha kalın olduğu için, onlar aynı düzeyde yer olmayacak. Bu nedenle, bu kap (bölge D, (alan Şekil 1 A), bukkal gangliya (Şekil 1 'de C alanı) ve bukkal kütlesi için daha derin bir ön bölme için bir platformun orta serebral ganglion için bir arka bölümüne sahip olmalıdır Şekil 1).
  4. Bu yemeğin oluşturmak için, bir yuvarlak 100x15 borcami (yüksek 15 mm, çapı 100 mm) ile başlar. Yemeğin İnşaat birkaç Sylgard pours gerektirecektir. Sylgard ürün ile birlikte verilen talimatları izleyin. Sylgard farklı döküyor arasında ayarlamak için izin verilmelidir.
  5. Birinci dökmek orta platform ve arka bölme duvarı arasında kap (Şekil 1 'de B alanı) içinde Sylgard en yüksek düzeyde oluşturmaktır.
  6. Sylgard duvarın (Şekil 1 'de alan B) için alan izole etmek için iki hamuru taşıyıcılı kullanın. Onlar kolay çıkarılması için Sylgard irtibata geçecektir plastik wrap ile kaplayın modelleme kil telaları. Kil modelleme kaçağı en aza indirmek için, çanak irtibata geçecektir nerede, kenarları sıkı mühürler olun.
  7. Neredeyse kadar yemeğin üstüne iki kil modelleme telaları arasındaki kısmına Sylgard dökün. Tam gecede ayarlamak Sylgard edelim. Ilık bir yerde çanak tutulması neden olacaktırhızlı ayarı. Kil modelleme telaları çıkarın ve Sylgard herhangi kil tortuyu temizlemek.
  8. Daha sonra, arka bölme (alanı Şekil 1 A) ve orta platformu (Şekil 1 'de C alanı) dökülür olmalıdır.
  9. Uzakta platformun orta bölümü (C alanı) için Sylgard ön yüzeyinden yaklaşık 5 mm bir hamuru destek yerleştirin.
  10. Geri odasındaki (alan A) ve yukarı olanlar Sylgard duvar (B alanı) üst kotundan yaklaşık 3-5 mm'lik bir yüksekliğe orta platformu (C alanı) için bölümlere Sylgard dökün. Arka odasının Sylgard yüzey orta platforma karbakol içeren arka odasından gelen sızıntıyı önlemek için orta platformun göre biraz daha düşük olmalıdır. Yine, Sylgard tam gecede belirlemenize olanak sağlar ve daha sonra kil modelleme desteğini çıkarın.
  11. Nihai adım gitmek için serebral-bukkal bağlayıcılar için bir kanal (CBCs) sağlamak için Sylgard duvarının ortasında bir çentik kesmek içinorta platform ve arka odası arasında aracılığıyla. Bu çentik bölgesinin genişliği yeterince geniş CBCs için yaklaşık 3-4 mm olması gerekmektedir. Çentiğin alt sızmasını önlemek için orta platformun Sylgard yüzeyinden daha düşük olmamalıdır. Bistüri çentik kesmek için kullanılabilir.

2. Elektrot Hazırlama

  1. Bölüm 3.1 'deki gibi McManus ve ark tarafından tanımlanan Flaming-Brown mikropipet çektirmesi. 8 kullanarak tek namlulu kapiller camından ekstrasellüler cam elektrotlar çekin. Çekiciye FT345B filament ile, tipik program ayarları Isı 480, Pull 50, Hız 13 ve Zaman 20, ancak ayarları farklı filamentler için farklı olacağını unutmayın. Bu program hiçbir yangın parlatma kademesi ile, tek bir çekme içinde elektrotlar oluşturur. Elektrot uç boyutu hücre gövdelerinin boyutu daha küçük olması gerekir. 50 um dan soma çapı, iç Diamete 400 mikron arasında değişen motor nöronlar içinEkstraselüler cam elektrot sc yaklaşık 40 um olmalı ve Aplysia tuzlu su ile dolu olduğunda bunların dirençleri MΩ yaklaşık 0.1 olması gerekir.
  2. Bir Bunsen beki kullanarak polietilen boru emme elektrot çekin. Yaklaşık 10 cm uzunluğunda polietilen boru bir parça kesin. Her iki ucundaki hortumu tutun ve ısı yumuşak olana kadar tüpü dönerken çok Bunsen beki tarafından üretilen aleve yakın yerleştirin. Ateşten uzak taşırken uzunluğu boyunca dikkatle tüp gerin. Borunun uzunlamasına orta kısmı ve boru çekilir olarak daralır.
  3. Iki emme elektrot oluşturmak için yarım boru kesin. Bazen geçerken en uygulanabilir olsa da emme elektrodu genellikle, sinir ve kas kesme uçları uygulanır.
  4. 3,2-3,13 bölümler içinde McManus ve ark 8 tarafından tarif edilen protokol takip sinir kayıtlar için kanca elektrotlar oluşturun. Bu elektrotlar especi vardırBir sinir veya kas kesilmez kullanışlıdır müttefiki.

3. Kanca Elektrot Eklenti

  1. Hayvan teşrih ve McManus ve ark tarif edilen protokol takip bukkal kütle çıkarın. 8 bölüm 4.
  2. Kayıt ve stimülasyonu için, kanca elektrotların farklı bir sinir sayıda takılabilir.
  3. Cullins ve Chiel 9 in vivo olarak yapıldı desenleri karakterize etmek, kayıtları gıda kapatılması grasper 17, bukkal gösteren 16 beslenme protraksiyon aşaması, radular sinir (RN) gösterir I2 sinir ve kas alınmalıdır retraksiyon faz 17,18 göstermektedir sinir 2 (BN2) ve bukkal sinir 3 (BN3). Kanca elektrotların Ek McManus ve diğerleri 8, Bölüm 5 tarafından tarif edilene benzer bir prosedür takip eder.
  4. Bu sinirlerin konumlarında gösterilen Aplysia besleme aygıtının şematik bakınızMcManus ve ark 8 Şekil 2. Not dalları yanal oluk de I1 kas altına gitmeden önce a, b ve c içine BN2 e ayrılır. Bir ana gövdeden ayırmak için birinci dal ve BN3 bitişik Branch.
  5. Dalları adlandırılması, b ve c Warman ve Chiel 18 tarafından kullanılmıştır. Dallar a, b, c ve Nargeot ve diğerleri tarafından kullanılan isimlendirme, sırasıyla, dallar 3, 2 karşılık gelir ve 1. 19. Ayrıca, RN, BN1, BN2 ve BN3 Kandel 20 ve Scott ve ark tarafından kullanılan isimlendirme, sırası ile, sinirler 1, 6, 5 karşılık gelir ve 4. 21
  6. I1/I3 kas kas innervasyonu incelemek için, bukkal sinirler dışındaki tüm sinirler 2 deneyler sırasında bukkal kütleden kesilecek. Böylece, BN2 gelen kaydetmek için bir kanca elektrodu kullanılmıştır.
  7. I2 sinir ve RN bukkal kütle eklenmiş ve bu kanca elektrotlar kullanılarak ulaşmak çok zor olan olmayacak olduğundan, onların yerine kayıt yapmak emme elektrodu uygulamak tercih edilir. Biz 7. bölümünde emme elektrot uygulaması anlatacağız.
  8. Bu elektrot iki tür kullanarak erişmek kolaydır, çünkü BN3 gelen kaydetmek için bir kanca elektrodu veya bir emme elektrot birini kullanın. Biz emme elektrot tutmak için manipülatörlerin sayısını en aza indirmek için, ve diğer manipülatörler veya ekipman için yer kazanmak için BN3 kayıtlar için bir kanca elektrodu kullanmayı seçti.
  9. BN2 bir (BN2-a) Deneyler sırasında ret benzeri desenler başlatmak için şube bir kanca elektrodu takın. Bazı nöronlar ipsilateral vs kontralateral BN2-a uyarım farklı tepki, çünkü, diğer tarafta BN2-a için bir ek kanca elektrodu bağlamak için yararlıdır.
  10. Unilateral vs ikili projeksiyonlar nöronların ayırt yardımcı olmak için,bukkal gangliyonların diğer tarafında BN2 ve BN3 için kanca takmak için elektrotlar de yararlıdır.

4. Ganglion ve Kas Hazırlama

  1. Bukkal gangliyon, serebral gangliyon ve bukkal kütle serebral ganglion tek BN2s üzerinden CBCs ve bukkal kütle bukkal gangliyon bağlı üzerinden bukkal gangliyon bağlanmış olduğu, söz konusu güç dönüştürücü deney için hazır edilir.
  2. Kancalı elektrotlar takılarak sonra bukkal kütleye eki noktada kesim, bukkal sinir 1 (BN1) ve bilateral özofagus sinir (TR) kesti.
  3. I2 kas onu yolun dışına taşımak için ileri serebral ganglion çekin. Radular kese üzerindeki I2 kas içine bir kesim olun, her iki yönde yanal ve anteriorda kesim genişletmek ve radular sinir maruz ileri I2 kas flep çekin. İki RN dalları kesin ve dalları emme elektrot eki için yeterince uzun olduğundan emin olun.
  4. Cbukkal ganglia ve I2 kas ekli kısmı tamamen bukkal kitle ayrılabilir kadar bukkal ganglionlar etrafında geniş bir daire içinde I2 kesim, BN2s veya BN3s kesmek için dikkatli olmak, Devam et. Kanca elektrodu eki ötesinde, bukkal kütleye eki noktada ikili BN3s kesin.
  5. Vakum gres glob pick up ve çentik üzerine yaymak için bir pipet kullanarak, arka kamara ve orta platformu bağlandığı yukarıda açıklanan kayıt çanak çentik vakum gres ince bir tabaka uygulayın.
  6. Sadece orta platformun Sylgard baz önünde, bukkal kütle yerleştirilir ön odasının cam alt hızlı-Jel süper yapıştırıcı ince bir tabaka uygulanır.
  7. Dikkatle kanca elektrotların hiçbiri sinirleri hasar verebilecek sıkıca çekilir emin, Bölüm 2'de açıklanan kayıt çanak (Şekil 1) serebral ganglion, bukkal ganglionlar ve bukkal kütle transferi.
  8. Dikkatli bir şekilde ventral yüzeyi çanak tabanına yapıştırılır emin olmak için, kayıt çanak ön bölme içinde yapıştırıcı üzerinde bukkal kütle yerleştirin. Tutkal dokunmadan ganglia ve elektrotlar tutmak için emin olun. Tutkal neden olur ki, çanak Aplysia tuzlu 8 (460 mM NaCI, 10 mM KCI, 22 mM MgCl2, 33 mM MgSO4, 10 mM CaCl2, 10 mM glikoz, 10 mM MOPS, pH 7.4-7.5) ekleyin ayarlamak için kullanılır.
  9. Çanak ekstraselüler soma kayıtları için bukkal ganglionlar hazırlamak için başka bir mikroskop aktarılması gerekiyorsa, kancalı elektrotlar ile çok dikkatli olun. Grup birlikte bukkal kütle bir tarafında elektrodları, ve aynı zamanda bir arada bukkal kütle diğer tarafında grup elektrotlar. Dikkatlice tekrar elektrotların hiçbiri sıkıca çekilir emin, konektör pimleri kapsayan laboratuvar bant tutarak elektrotlar tutun.
  10. Çanak mikroskop, elektrot altına konumlandırılmış olduğundas yemeğin yanındaki platformda çanak ve dinlenme taraf üzerinde hafifçe kaplanması gerektiğine.
  11. Sonları sırasında ve deney kademeleri arasında, bir akvaryum airstone kullanılarak bukkal boşluk içinde kütle tuzlu havalandırır.
  12. Serebral ganglion kılıf kapmak ve CBCs çentik aracılığıyla çalıştırmak sağlayarak, arka kamara içine çekmek için forseps kullanın. Sağlam CBCs zarar görmesini önlemek için CBCs dışındaki sinirleri kullanarak serebral ganglion Pin.
  13. CBCs üzerinde daha fazla yağ vakum uygulanır ve daha sonra ganglionlar tamamen daldırılmış böylece, her iki çanak odalarına daha Aplysia tuzlu ekleyin. Hiçbir sızıntı odaları arasında oluşacak şekilde vakum gres üst Sylgard duvara biraz daha olduğundan emin olun.
  14. Bukkal gangliyonların stabilize etmek için, ilk önce BN3s, orta platformu (Şekil 2) Sylgard taban üzerinde BN1s ve lerin uçları pin. BN3s kanca elektrodu kullanılarak kaydedilmiş olacağındans, pimleri kanca elektrotların bağlanma noktalarına göre daha distal yerleşimli olmalıdır.
  15. CBCs (Şekil 2) hasar olmayacak, böylece CBCs esneme ve çapa kanca gibi, 90 derece eğildi, iki iğne kullanın.
  16. Geri odasındaki ve bukkal ganglionlar arasındaki RN dalları aşağı Pin. Sonra I2 kas RNS üstünde olacak. I2 sinir göstermek için, I2 kas kapmak ve bukkal ganglionlar üzerine çekmek için forseps kullanabilir. I2 sinire zarar vermemek için I2 kasının iki köşe Pin.
  17. Onun iki şube I2 kas içine birleştirme hangi noktaya distal I2 sinir Sever. Kas hala vivo kayıtları ile karşılaştırılabilir olduğu innerve olduğundan emin olun. I2 kas kalanı uzak kesin ve I2 sinir geri çevirmek ve (Şekil 2, inset bakınız) iki RN dalları arasına sıkıştırmak.
  18. Bir sinir çok gevşek ise germek ve gerginlik eklemek için pinlerini ayarlayın veya nerv eğer gerginliği boşaltmak içine çok sıkı. Daha bukkal ganglionlar stabilize etmek, sinirler arasındaki kılıf daha işaretçilerine ekleyin.
  19. Bukkal ganglion kaudal tarafı yukarı yerleştirilir beri ilgi nöronlar rostral tarafında ise, bukkal ganglionlarda döndürün. İki bukkal gangliyonların birini döndürmek için, bukkal ganglionlar yakın olduğu CBC bazı aşırı kılıf kapmak için ince forseps kullanın ve BN2 ve BN3 arasındaki aşağı pin. Bazı gangliyon, bu CBC ve BN3 arasına aşağı pin daha uygun olabilir.
  20. Bukkal ganglion hareketini en aza indirmek için, ön bölme yakın yan üzerinde bukkal ganglion kılıf üzerinde ek bir pim ekleyin.
  21. Bukkal gangliyon kapsayan kılıf kırpmak için, arka odaya tarafında yakın üzerindeki kılıf kapmak için ince forseps kullanın ve sonra hücre gövdeleri maruz kalmadan ince makas ile aşırı kılıf kesip. Zararı en aza indirmek için, sadece hücre gövdeleri görmek için gerekli kılıf en az miktarda çıkarın.
  22. T sonraO bukkal gangliyonların kılıf bukkal ganglionlar üzerinde I2 sinir ve RNS çekin ve daha bukkal ganglionlar döndürmek için bukkal ganglionlarda ve ön kamara arasında onları aşağı pin, düzeltilebilir. (Bakınız Şekil 2).
  23. Diseksiyon öncesi hayvan uyutmak için kullanılan kalan magnezyum klorür 8 yıkamak için taze Aplysia'nın salinle çanak Aplysia'nın salin değiştirin.

5. Elektrikle Kanca Elektrotlar bağlanması

  1. Ganglionlar ve kas hazırlandıktan sonra, deneyler için titreşim izolasyonu masaya çanak dikkatle aktarın.
  2. Amplifikatörler (AM Sistemleri model 1700 amplifikatör) bağlanmak BNC kablolar yuvalarına tüm elektrot pimleri takın. Yine, bunu yaparken elektrotlar sıkıca çekilmiş değil emin olun. Elektrotların doğru şekilde uygun kabloların bağlı ve kutupları doğru olduğundan emin olun.

6. Soma Kayıtlar için Ekstrasellüler Cam elektrotlar kurma

  1. Yaklaşık 15-20 cm uzunluğundaki polietilen boru parçasına bağlanmış bir şırınga kullanılarak Aplysia tuzlu su ile elektrot doldurun. Cam elektrot sonuna kadar polietilen hortumun serbest ucunu. Aplysia'nın salin ile elektrot doldurmak için şırınga pistonunu geri çekin.
  2. Manipülatör üzerinde sahibinin çentik dolu ekstraselüler cam elektrot yerleştirin. Bukkal ganglion içeren Aplysia'nın salin içine elektrot ucu yerleştirin manipülatör kullanın.
  3. Kayıt tel olarak hizmet elektrot bir erkek altın konektörü pin lehimlenmiştir bir gümüş / gümüş klorür tel yerleştirin. Referans teli gibi davranmaya bukkal ganglionlar içeren kayıt yemeğin bölümünde Aplysia'nın salin doğrudan bir erkek altın konektörü pin lehimlenmiştir başka bir gümüş / gümüş klorür tel yerleştirin. Th bağlayınamplifikatör bağlanır BNC kablosunun e kayıt ve başvuru teller.
  4. Daha manipülatörleri için yeterli yer olması durumunda, ilave ekstraselüler cam elektrot aynı anda birden fazla nöronlar kaydetmek için ilave edilebilir.

7. Sinir Kayıtlar için Emici elektrotlar ayarlama

  1. Sinirin çapına uygun ucu emme elektrot dar sonunu kesin. Elektrot ucunun iç çapına benzer ya da sıkı bir emme sağlamak için en sinir çapından biraz daha küçük olması gerekir.
  2. I2 sinir ve RN birbirine çok yakın olduğundan, onların elektrotlar yer kazanmak için aynı manipülatör tarafından tutulabilir. Aynı tutucunun iki çentik iki elektrot yerleştirin. Iki elektrot döndürün ve kendi ipuçları bir diğer yakın olduğundan emin olun. I2 sinir kayıt için bir tanesi, RN kayıt için diğer bir seçin.
  3. Recordin içindeki Aplysia'nın salin içinde elektrot ucu yerleştirinbukkal ganglion içeren g çanak. Emme elektrodu için şırınga polietilen hortumun serbest ucunu. Aplysia tuzlu su ile elektrot doldurmak için şırınga kullanarak. Yakınında hedef sinir ucuna uç elektrot hareket ettirin, I2 sinir yani, ve elektrot içine sinir emmek için şırınga kullanın. Elektrot içindeki sinir uzunluğu sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için 0.5-1.0 mm olmalıdır.
  4. RN eklenir elektrot için emme tekrarlayın.
  5. Bölüm 6.3 'de tarif edildiği gibi, karşılık gelen BNC kablolara elektrodu bağlayın.

8. I1/I3 kas kasılması Tedbir Kuvvet Dönüştürücü ayarlama

  1. Kas kuvvet dönüştürücüleri takmak için, ipek dikişlerle kullanın. Her sütür kavisli iğne bükün ve kuvvet dönüştürücü için dikiş atılmalıdır. Yavaşça kapmak ve asansör kas küçük bir miktar forseps ile ve, forseps başka bir set içinde iğne tutan, insertyukarı iğne içinde eğilmiş noktası (Şekil 1) ile iğne kas içinden.
  2. Transdüserler I1/I3 kas ya dorsal veya yanal takılabilir. Dorsal eki kas sol ya da sağ tarafına aktivasyonu tarafından uyarılmış kasılmaların ölçümünü sağlar. Yanal eki nöronların çoğunluğu için güçlü kuvvetler gösterecektir, ancak dönüştürücü bağlı olduğu tarafta daralma ölçüm sadece sağlayacaktır.
  3. I1/I3 ön, arka veya her ikisi bölgeleri aktive olabilir nöronlar belirlemenize yardımcı olmak için, faringeal dokuya sadece anterior kas arka kısmına bir kuvvet dönüştürücü takın ve ön kısmına bir başka kuvvet dönüştürücü takmak kas, çeneler (Şekil 1; not kancalar) at.
  4. Sütür gergin çekti kadar kuvvet dönüştürücüleri kaldırın ama overstretch yok. Sütür i biraz rahat olduğunda Bunu kontrol etmek için, kuvvet dönüştürücü gelen ölçüm görüntüleÖlçüm hafifçe bu taban seviyesine kadar t, sonra dönüştürücü kaldırın.

9. Bir Motor Pool içinde Motor Nöronlar belirlenmesi

  1. Bu protokol, ekstraselüler bir motor havuzu içinde motor nöronlar belirlenmesi için bir işlemi tarif etmektedir. Biz bireysel nöronlar, birden sinirler ve kas (EMG sinyali veya kasılma kuvvetleri) aktivitesini izlemek için AxoGraph yazılımını kullanmıştır. Bu protokol, biz motor nöronların belirleme işlemi için bir örnek olarak kas kasılması kuvvetleri kullanılır; diğer deneylerde, biz de EMG kullanılır ve bu tür deneyler için kurulum (Tartışma bakın) çok benzer.
  2. Bir aday nöron bulmak için, hafifçe uyarılması ve kayıt seçicilik 5 için en iyi yerdir nöron soma 5 (Şekil 3), merkezi üzerinde kılıf üzerine ekstraselüler cam elektrot ucu aşağı doğru basın manipülatör kullanın. Yana eşik akımı fveya bir nöron aktive elektrot-to-soma mesafe 5 ile doğrusal olarak arttığını, stimülasyon seçicilik kötü elektrot bir komşu nöronun doğru hedef nöronun merkezinden uzağa taşındığında olacak.
  3. Bir motor nöron belirlemek için, öncelikle doğrudan sadece bu nöron ateşleme sağlamak için ekstraselüler cam elektrot kullanılarak nöron uyarmak ve kas innervates olmadığını incelemektir. Sonra, ekstraselüler bu nörondan rekor kurmak için bir-biri için ekstraselüler soma kayıt ve aynı zamanda nöron tanımlanması için büyük önem sinir kayıtları arasındaki ilişki.
  4. Çoğu ekstraselüler amplifikatörler bir kanal eşzamanlı uyarılması ve kayıt izin vermez bu yana, uyarmak ve kayıt soma (soma kanal) stimülasyon modu ve kısa bir akım anodik (Aplysia'nın nöronlar 5 örneğin 6 msn) uygulamak için kullanılan kanalı ayarlamak soma (Şekil 4A, 5A; not okları 1 in iki figür), (örneğin 200 uA) bir düşük akım başlayarak, yavaş yavaş nöron patlayana kadar geçerli artmaktadır.
  5. Nöron patlamaya aktive edildiğinde, biri hemen uyarılması modundan kayıt moduna (; not oklar 2 hem rakamları Şekil 4A, 5A) soma kanal geçmelisiniz. Ancak, yine de, çünkü insan tepkisi gecikmeler soma uyarılması ve kayıt arasındaki gecikme olmayacağını.
  6. Zaman makul miktarda nöron patlarsa, bunu gözlemlemek mümkün olmalıdır tek-için-bir soma kayıt gelen ve sinir (ler) ile ilgili gelen aksiyon potansiyelleri hangi aracılığıyla nöron projeleri (Şekil 4B, 5B; not kesikli çizgiler ), nöron (Şekil 4A, 5A tarafından oluşturulan hem de kuvvetleri; not mavi kutu). Nöron soma kayıt başlamadan önce ateş durursa, daha uzun bir süre için etkinleştirmek için geçerli artırın.
  7. Ekstraselüler sinyal-gürültü oranıkayıtları elektrot konumu ve soma boyutuna bağlıdır. Ekstraselüler kayıt soma boyutu artış ve elektrot-to-soma mesafe azaldıkça daha büyük olacak. Gürültü sadece dar bir aralıkta değişir bu yana, sinyal-gürültü oranı da soma boyutu artar ve elektrot-to-soma mesafe azaldıkça artacaktır. Sinyal-gürültü oranının en yaygın dizi 4:1 ila 8:1 olan.
  8. Motor nöronların bu tür soma konumu, sinir ve kas projeksiyon innervasyon 4,6,7 özelliklerini de esas tespit edilebilir. Sadece iki BN2s BN2s üzerinde faaliyet izlenerek, bukkal kütle bağlı oldukları için, bir kas kasılma gücünün sadece hücre dışı uyarım ile aktive nöron tarafından neden olduğu sağlayabilir.
  9. Örneğin, B3 bukkal ganglion rostral tarafında bulunan I1/I3 kas için büyük bir motor nöron (200-350 gr ağırlığında olan hayvanlarda soma çap olarak 300-400 mikron), (Şekil 3 ' ). Sadece ipsilateral BN2 aracılığıyla projeler ve I1/I3 kasın anterior ve posterior bölümleri hem innerve eder. Çoğu zaman, bunu etkinleştirerek (9 deneyler üzerinden 8) posterior kuvvet daha büyük anterior oluşturur.
  10. Bir nöron belirlendikten sonra, bu etkinlik aşağıda açıklandığı gibi ortaya çıkarılan olan hücre dışı cam elektrot (Şekil 4 ve 5), farklı besleme yolu ile benzer davranış kaydedilebilir. Soma üzerindeki hücre dışı kayıt çok daha spesifik pek çok farklı nöronların aktiviteyi sinir kayıtları, kısa olacaktır.
  11. Egestive benzeri motorlu programları teşvik etmek, bakliyat 19 1-2 dk (2Hz her darbenin 1 msn) sahip olan BN2-bir teşvik. Bu uyarım güvenilir bu ortamda egestive desenler oluşturur. Yeterli akımı ile (örn. 300 uA), desenler stimülasyon süresi boyunca devam edebilir. Bazen kısa bir süre sonra ortaya çıkar bir tane daha model olacakstimülasyon biter.
  12. Ingestive gibi motorlu programları indüklemek için, doğrudan serebral ganglion 15 kılıf üzerine katı karbakol bir kaç kristaller yerleştirin. Biri karbakol maruziyet düzeyini kontrol etmek istiyorsa, Aplysia'nın salin içinde 1 ile 10 mM karbakol bir çözümü kullanın. Yüksek konsantrasyonlarda yanıtları uyardığı olasılığı daha yüksektir. Tekrarlayan desenler genellikle beş dakika içinde başlar ve koşmak başlamadan önce yaklaşık on-onbeş dakika sürebilir.
  13. Karbakol birkaç kez yıkanması ve en az 30 dakika beklettikten sonra, karbakol bir sonraki uygulama daha ingestive gibi motor desenleri indüklemek için serebral ganglion için ilave edilebilir.
  14. Özellikle motor havuzu için birden fazla motor nöronlar belirlendi ve motor programları sırasında karakterize edildikten sonra, bir hızla gelecekteki çalışmalarında bu nöronların (Şekil 6 tanımlanması için çok az bilgi gerektiren bir ölçüde basitleştirilmiş bir tanı yöntemi gelişebilir </ Strong>), örneğin askıya bukkal kitle preparatları veya in vivo. Kriterleri soma büyüklüğü ve konumu, sinir projeksiyon, sinirler üzerindeki birim boyutunu ve motor desenleri sırasında aktivite zamanlaması içerebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekiller 4 ve 5, iki I1/I3 motor nöronlar tanımlamak için kullanılan tipik sonuçları göstermektedir. Şekil 4 egestive gibi ingestive ve benzeri örnekler (Şekil 4C, 4D) ve bir geniş motor nöron, B3 ve soma kayıtları gösterir. Birebir için soma kanal ve B3 soma kayıt özgüllüğü desenleri sırasında sürdürüldüğü anlamına ipsilateral BN2 kanalı (Şekil 4E) show gelen ani. B3 desen orta-geç retraksiyon aşamasında patlar. Şekil 4

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu tür yumuşakçalar (örneğin, Lymnaea, Helix, ve Aplysia), motor havuzları analizi gibi büyük tespit nöronları ile hayvanlarda tipik olarak hücre içi kayıt 1,2,3,4 kullanılarak yapılır. Bu protokol, benzersiz bir hücre dışı tekniği kullanılarak bir motor havuzu için motor nöronlarının belirlenmesi için bir işlem açıklanmaktadır. Bu sürecin bir örneği olarak kuvvet ölçümleri kullanılmıştır. Bir de kas innervasyonu ölçmek için EMG kullanabilirsiniz. Kısaca, bunu yapmak için, protokol EMG kayıt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Teşekkürler

Bu araştırma NIH hibe NS047073 ve NSF hibe DMS1010434 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Isim Şirket Katalog Numarası Yorumlar
Sodyum klorür Fisher Scientific S671 Biyolojik, Sertifikalı
Potasyum klorür Fisher Scientific P217 Sertifikalı ACS
Magnezyum klorür hekzahidrat Acros Organics 19753 % 99
Magnezyum sülfat heptahidrat Fisher Scientific M63 Sertifikalı ACS
Kalsiyum klorür dihidrat Fisher scientifc C79 Sertifikalı ACS
Glikoz (dekstroz) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS Buffer Acros Organics 17263 % 99
Karbakol Acros Organics 10824 % 99
Sodyum hidroksit Fisher Scientific SS255 Onaylı
Hidroklorik asit Fisher Scientific SA49 Onaylı
Tek namlulu kılcal cam AM Sistemleri 6150
Flaming-Brown mikropipet çektirmesi modeli P-80/PC Sutter Aletleri Filament kullanılmış: FT345B
Emaye kaplı paslanmaz çelik tel California İnce Telli 0.001D, kaplama h
Hanehalkı Silikon II Tutkal GE
Duro Hızlı Jel superglue Henkel corp.
Sistemleri model 1700 amplifikatör AM AM Sistemleri Filtre ayarları: I2 sinir / kas için 10-500 Hz; diğer tüm sinirler için 300-500 Hz
Pulsemaster Multi-Channel Stimulator Dünya Hassas Aletler A300
Stimulus Isolator Dünya Hassas Aletler A360
AxoGraph X AxoGraph Bilimsel Kayıtlar için Yazılım
Altın Konnektör Pin Bulgin SA3148 / 1
Altın Bağlayıcı Yuva Bulgin SA3149 / 1
Sylgard 184 Silikon Elastomer Dow Corning
100 x 15 mm kristalleşerek Bulaşık Borcam
Yüksek Vakum Gresi Dow Corning
Pipet İpuçları Fisher Scientific 21-375D
Minutien Pins Güzel Bilim Araçları 26002-10
Modelleme Kil Sargent Sanat 22-4400
Hava Pompası fısılda Tetra 77849
Akvaryum Boru Eheim 7783 12/16 mm
Elite Airstone Hagen A962
Vannas Bahar Makas Güzel Bilim Araçları 15000-08
Dumont # 5 Güzel Forseps Güzel SciencE Araçları 11254-20
Kimwipes Kimberly-Clark 34155

Kaynaklar

  1. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  2. Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
  3. Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
  4. Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
  5. Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
  6. Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
  7. Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
  8. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).
  9. Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791(2010).
  10. Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
  11. Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
  12. Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
  13. Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
  14. Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  15. Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
  16. Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
  17. Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
  18. Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
  19. Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
  20. Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
  21. Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
  22. Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
  23. Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
  24. Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
  25. Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
  26. Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
  27. Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
  28. Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
  29. Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
  30. Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

H cre D Stim lasyonMotor N ron Tan mlamaBukkal GanglionlarVakumlu ElektrotlarCam ElektrotlarKas nnervasyonuAksonal ProjeksiyonKuvvet letimiElektrofizyolojik Kay t
Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.