Genetik olarak kodlanmış optogenetic araçları belirli nöronların noninvaziv düzenlenmesini sağlayan Drosophila Beyin. Bu tür araçlar olan aktivasyon belirli davranışları ortaya çıkarmak veya bastırmak için yeterli nöronlar belirleyebilir. Burada özgürce yürüyüş sinekler hedefli nöron olarak ifade edilir Channelrhodopsin2 aktive etmek için bir yöntem mevcut.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım
Bu makalede
Özet
Özet
Genetik olarak kodlanmış araçlar giderek artan sayıda Drosophila melanogaster 1 belirli nöronların nöral aktivitenin non-invaziv manipülasyon izin verdiği kullanılabilir hale gelmektedir. Bunların arasında en önemlisi parlak bir ışık kullanarak sağlam ve serbestçe hareket hayvan belirli nöronların aktivasyonu veya susturulması etkinleştirmek optogenetic araçları vardır. Channelrhodopsin (ChR2) mavi ışık ile aktive edildiği zaman, bu ifade nöronların depolarizasyon neden, bir ışık aktif katyon kanalı. ChR2 gibi CO 2 kaçınma, hortum uzatma ve dev-fiber aracılı irkilme tepkisi 2-4 gibi belirli davranışlar için kritik nöronlar belirlenmesi için etkili olmuştur. Bununla birlikte, aynı zamanda ChR2 teşvik fotoreseptör uyarmak için kullanılan yoğun ışık kaynağı olarak, bu teknikler, daha önce optogenetic görsel sisteminde kullanılan edilmemiştir. Burada, demo fototransdüksiyon bozar bir mutasyon ile optogenetic yaklaşım birleştirmeksinek optik lob, Foma-1 nöronlarda tezgah duyarlı nöronların bir küme aktivasyonunun nstrate, çarpışmayı önlemek için kullanılan bir kaçış davranışı sürebilirsin. Bu fototransdüksiyon kaskadı önemli bir bileşeni bir boş alleli kullanılan norpA geni tarafından kodlanan fosfolipaz C-β, kör sinekler vermek ve aynı zamanda Foma-1 ChR2 ifade sürmek için gal4-UAS transkripsiyon aktivatörü sisteminin kullanılması nöronlar. Bireysel sinekler mavi LED'ler ile çevrili küçük bir platform üzerine yerleştirilir. LED'ler yandığında, görsel tahrik tezgah-kaçış davranışına benzer bir şekilde, uçuş içine hızlı take-off uçar. Biz bu tekniği kolayca serbestçe sinek hareketli diğer davranışlarını incelemek için adapte edilebilir inanıyorum.
Giriş
Genetik olarak kodlanmış araçlar büyüyen cephanelik Drosophila melanogaster 1 belirli hücrelerde nöral aktivitenin işlemek için geliştirilmiştir. Bu araçlar sağlam ve serbestçe hareket hayvan belirli nöronların noninvaziv aktivasyonu veya susturulması etkinleştirin. Bu zamansal olarak kontrol edilen ve hızlı bir şekilde indüklenen olabilir çünkü bu arasında, Channelrhodopsin2 (ChR2), bir ışık ile aktive olan katyon kanalı, önemli avantajlar sunmaktadır. Zaman ekspres ChR2 hızla depolarize ve 3-5 yükseltilmiş ateş oranları sergilerler parlak mavi (470 nm) ışığa maruz nöronlar. Serbestçe hareket eden hayvanlar belirli nöronların Böyle hed....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Channelrhodopsin Sinekler Oluştur
- Sizin seçtiğiniz gal4 sürücüsü ile Çapraz UAS-ChR2 sinekler, biz optik lobda Foma-1 nöron olarak ifade edilir G105-gal4 kullanın.
- Mavi ışık uyarılması için görsel bir tepki olasılığını ortadan kaldırmak için, iki sinek hatları aw + norpA arka planda bulunmaktadır.
- Sonuç: w + norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- Erişkin eclose uçar sonra, davranışsal tahlil yapmadan önce 3 gün boyunca 10 uM all-trans-retina (ChR2 için gerekli bir ko-faktör) ve ışıktan koruyarak ile desteklenmiş, taze gıda, seçilen kadın koymak.
2. 10 uM All-trans-retinal Geliştir....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Kör ya ChR2 veya tek başına G105 sürücü parlak mavi ışık ile aydınlatma aşağıdaki take-off oranının düşük olduğunu göstermektedir ifade uçar. Kör bu take-off mavi ışık ile aydınlatma nedeniyle spontan vardı ziyade düşündüren, bağımsız aydınlatma (Şekil 2) take-off aynı oranda sergilenen uçar. ChR2 Foma1 nöronlarda eksprese edilir, ancak, mavi ışık ile aydınlatma kaçış yanıt verilmesini sağlar. Test sinekler üzerinde% 50 aydınlatma 1 saniye içinde çıkardı ve 5 saniye içinde% 75 (Şekil 2).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz parlak mavi ışık sinek yürürken serbestçe yıkanan tarafından kaçış davranışları optogenetic stimülasyonu göstermiştir. Bu yaklaşım kolayca serbestçe dolaştıklarını sineklerin diğer davranışlarını incelemek için adapte edilebilir ve sadece biz daha geniş bir alana kullanılan LED diziler döşeme daha büyük platformlar için ölçeklendirilebilir. Kullanıcı terzi, biz tarif ucuz kamera, ya da diğer mevcut kamera sistemleri ya kullanarak, görüntülerin kare hızı ve uzaysal çözünürlüğü ilgi davranışı uygun satın aldı. M.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma Stanford Dekanlık Bursu (SEJdV), Sağlık Müdürü Pioneer Ödülü bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (TRC DP0035350), bir McKnight Vakfı Scholar Ödülü (TRC) ve R01 EY022638 (TRC) tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif | |||
| Retina All-trans | Peşin Bilimsel ve Kimya A.Ş. | R3041 | |
| Ekipman | |||
| Isı 9.2 C / W Sink | Luxeonstar | LPD30-30B | Yüksek 30 mm kare X 30 mm |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Mavi Asi Tri-Star Bankası'ndaki LED | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Sürücü | Luxeonstar | 3021-DE-700 | |
| BuckPuck Sürücü için Kablo Demeti | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Önceden kesilmiş termal yapışkan bant | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Bankası |
| Snap-Loc Soğutma Hortum, ¼ "kimliği | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Soğutma Hortum Bağlantısı | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼ "NPT Erkek |
| Laboratuvar Sınıf Değiştirme Modu Programlanabilir DC Güç Kaynağı | BK Precision | 1698 | |
| Exilim kamera | Casio | EX-FH20 |
Kaynaklar
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
