Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme

27K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50195

⸱

8 Ağustos 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Toplam hücresel RNA, kısa vadeli RNA sentezi ve çürüme değişikliklerin yanı sıra, RNA işleme kinetiğini incelemek için kötü bir şablon sağlar. Burada, 4-thiouridine ile yeni kopyalanan RNA metabolik etiketlenmesi tarif, bu sınırlılıkların üstesinden gelmek için izin veren yeni transkripsiyonu RNA tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve saflaştırma takip etti.

Özet

Tam transcriptome mikroarrayler ve yeni nesil sıralama gelişimi hücresel gen ifadesinin karmaşıklığı anlayışımızı devrim yarattı. Tutulan moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılması ile birlikte, altta yatan kinetik hassas ölçümler giderek daha önemli hale gelmiştir. Burada, bu güçlü yöntemler şablon örnekleri de çalışma, yani toplam hücresel RNA içsel özellikleri nedeniyle önemli sınırlamalar karşı karşıya. Birçok durumda toplam hücresel RNA değişiklikler yeterli çözünürlüğe sahip temel moleküler olayları ve kinetik temsil etmek için ya çok yavaş ya da çok hızlı bir şekilde ortaya çıkar. Buna ek olarak, RNA sentezi, işlenmesi ve çürüme değişiklikler katkısı kolayca ayırt edilmez.

Biz son zamanlarda bu sınırlamaları aşmak için yüksek çözünürlüklü gen ekspresyon profili geliştirdi. Yaklaşımımız 4-thiouri ile yeni transkripsiyonu RNA metabolik etiketleme dayanmaktadıryemek (böylece de 4SU-etiketleme olarak anılacaktır) tiyol-spesifik bir biotinilasyon ve Streptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yeni kopyalanan RNA arasında sıkı bir arıtma takip eder. Bu, omurgalılarda, Drosophila ve maya da dahil olmak üzere bir organizma geniş için de geçerlidir. Biz başarılı, transkripsiyon faktörü faaliyetlerinin gerçek zamanlı kinetik çalışma RNA yarı hayatımızın hassas ölçümler sağlamak ve RNA işleme kinetik yeni bakış açıları elde etmek için 4SU-etiketleme uygulanır. Son olarak, sayısal modelleme altta yatan moleküler mekanizmaları entegre, kapsamlı bir analiz oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

Gen ekspresyon profili hücresel süreçleri ve ilgili karmaşık bir etkileşim ağı incelemek için kullanılan önemli bir araçtır. MRNA bolluk ile ilgili çalışmalar genellikle altta yatan moleküler mekanizmaları, temel anlayışlar elde etmek için tercih edilen yöntem olmuştur. Tam transcriptome mikroarrayler 1 ve RNA (RNA-seq) 2-4 daha yakın, yeni nesil sıralama gelişimi bu yaklaşım hızlandırdı. Bu teknolojilerin hücresel gen ifadesinin karmaşıklığı anlayışımızı devrim olsa da, onların şablon örnek doğal özelliklerine, yani toplam hücresel RNA nedeniyle önemli sınırlamalar karşı karşıya. RNA düzeylerinde İlk olarak, kısa vadeli değişiklikler transkripsiyon oranlarındaki değişimler maç, ancak RNA ilgili transkript yarı ömrü üzerinde doğal olarak bağımlı değildir. Bir transkripsiyon faktörü için kısa süreli bir transkript, örneğin kodlama beş kat indüksiyon, toplam RNA kolayca tespit olacak isebir saat içinde, bir metabolik enzim için uzun ömürlü transkript, örneğin kodlama aynı indüksiyon, neredeyse görünmez kalacaktır. Buna ek olarak, hatta bir kapatma (> 1.000 kat yük atma) bir RNA beş saatlik yarılanma ömrü ile ortalama bir genin transkripsiyon oranı tam sadece sadece iki yönlü tarafından azaltmak için, toplam RNA düzeyleri için beş saat sürer . Bu nedenle, toplam RNA analizi düzenleme fonksiyonları 5 ile transkripsiyon faktörleri ve genler için kodlamak birçoğu kısa ömürlü transkript kadar düzenleme tespiti, yanadır. Ayrıca, düzenlemenin gerçek kinetik kaskad gizlenmiş ve birincil sinyal olaylar ikincil ayırt edilemez. Her ikisi de, sırayla, alt biyoinformatik analizler önemli sapmayla neden olabilir. İkinci olarak, toplam RNA düzeylerinde değişiklikler RNA sentezi ya da çürüme değişikliklere mal edilemez. Ikinci ölçümleri transcripti engelleme hücre invaziv yaklaşımlar, örneğin gerektiriraktinomisin D 6, ve zaman içinde devam eden RNA çürüme genişletilmiş izleme kullanarak. 5 memeli hücrelerinde ortalama mRNA yarı ömrü ile - 10 saat 5,7, en genlerin mRNA düzeyleri sadece iki kat transkripsiyonel tutuklama birkaç saat sonra daha az azalmıştır olacaktır. Bunlar, çok küçük farklar temel matematiksel denklem üslü doğası nedeniyle hücresel genlerin çoğu için mRNA'nın yarı ömür kabaca kesin ölçümler ile sonuçlanabilir. Son olarak, süre toplam hücresel RNA RNA-seq genlerimizin yarısını yaklaşık alternatif yapıştırma olayları 8, temel kinetik hem de tam olarak anlaşılamamıştır kalır RNA işleme doku ve bağlama özgü düzenleme rehberlik dinamik mekanizmaları tabi olduğunu ortaya koydu. Buna ek olarak, RNA, özellikle katkı kodlayıcı olmayan RNA'lar için, belirlenecek kalır, diferansiyel gen ekspresyonu için işlem. Toplamda, bu sınırlamalar için önemli engeller temsilaltta yatan moleküler mekanizmaların biyoinformatik kinetik modelleme.

Yakın zamanda bu sorunların 5,7,9 üstesinden gelmek için, olarak adlandırılan yüksek çözünürlüklü gen ekspresyon profili, bir yaklaşım geliştirdi. Bu, 4-thiouridine (4SU-etiketleme), doğal olarak oluşan üridin türev kullanarak yeni transkripsiyonu RNA metabolik etiketleme dayalı ve hücre büyümesi ve gen ekspresyon minimal girişim (bkz. Şekil 1) 5 ile yeni transkripsiyonu transkript doğrudan erişim sağlar 10-12. Hızla alımı, 4SU-trifosfat için fosforilasyon, ve yeni transkripsiyonu RNA içine dahil edilmesi 4SU sonuçlarına ökaryot hücrelerin maruz kalma. Toplam hücresel RNA izole edildikten sonra, 4SU-işaretli RNA fraksiyonu tiol-biotin ve özellikle yeni kopyalanan RNA arasında bir disülfid bağı oluşturma biyotinile olup. 'Toplam hücresel RNA' ardından nicel ('yeni transkripsiyonu') ve etiketsiz ('öncesi existin etiketli ayrılabilirStreptavidin-kaplı manyetik boncuklar kullanılarak yüksek saflıkta G ') RNA dır. Son olarak, etiketli RNA sadece disülfid bağ yarma bir indirgeyici madde (örneğin, ditiyotreitol) eklenmesi ve Tanelerden yeni kopyalanan RNA bırakarak Tanelerden geri kazanılır.

Yeni transkripsiyonu RNA 4SU maruz kalma süre boyunca her genin transkripsiyonel aktivitesini gösteriyor. Dakika ölçeğinde 4SU-etiketleme böylece ökaryotik gen ifadesinin bir anlık görüntü ve aşağı akım biyoinformatik analizleri (promotor analizi) için ideal bir şablon sağlar. Kararlı durum koşulları kabul edilebilir durumda, oranları yeni transkripsiyonu / toplam, yeni transkripsiyonu / etiketsiz ve etiketsiz / RNA hassas RNA yarı ömrü 7,13 için non-invaziv erişim sağlar. Buna ek olarak, 4SU-etiketleme az 5 dakika (5 dakika 4SU-RNA) sonra arıtılmış bu yeni transkripsiyonu RNA dikkat etmek önemlidir 15 ve 60 dakika 4SU-RNA daha gençtir.RNA-seq ile birlikte tek bir deneysel ortamda 4SU-etiketleme ultra-kısa ve giderek daha uzun hem yaparken, RNA işleme kinetik nükleotid çözünürlükte 9 ortaya çıkar. Son olarak, sayısal modelleme ile birlikte yeni transkripsiyonu ve toplam RNA zaman tabii ki analiz RNA sentezi ve çürüme 14 entegre bir analiz sağlar.

Sonuç olarak, bu yaklaşım, ökaryotik hücrelerde RNA sentezi, işleme ve bozulmanın dinamiklerinin doğrudan analizi sağlar. Bu memeliler, böcekler (Drosophila), amfibi (Xenopus), ve maya 5,15,16 dahil olmak üzere tüm büyük model organizmalarda geçerlidir. Bu mikroarray analizi 5,17, RNA-seq 9,13,14 ile doğrudan uyumludur, ve in vivo 12,15 uygulanabilir. Burada, detaylı metodoloji, etiket izole ve kültürlü memeli hücrelerinde yeni transkripsiyonu RNA arındırmak için. Ayrıca, potansiyometre olarakal sorunlar ve tuzaklar tartışılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. 4-thiouridine ile Metabolik Etiketleme

Deney düzeneği / program ayrıntılı bir plan yapın, hücre kültürü için 4SU eklemek için ne zaman ve örnekleri hasat zaman örneğin. Her durumda arasında en az 5 dakika boyunca Planı. Bir seferde sadece bir durumun hücre tedavisi. Max tutun. 3 - belirli bir zamanda 5 yemekleri. Sıcaklık ve CO2 düzeylerindeki değişiklikler en aza indirmek için mümkün olduğunca çabuk hücreleri tutun. Bu hücresel proteinlere 4SU-etiketli RNA çapraz neden olabilir 4SU eklendikten sonra parlak ışık hücreleri maruz bırakmayın.

Etiketleme başlangıcı

  1. Çözülme 4-thiouridine (4SU) sadece steril bir Falcon tüp içine her bir durum için 4SU kullanımı ve pipet gerekli miktarda önce.
  2. Yemekler kapalı hücre kültür ortamı gerekli miktarda (10 cm tabak başına 5 ml) alın ve 4SU içeren Falcon tüp eklemek ve iyice karıştırın. Çıkarın ve yemekleri kalan orta atın.
  3. yemekleri 4SU içeren orta geri uygulayın.

Etiketleme sonu

  1. Hücrelerinden hücre kültürü ortamı çıkarın. Her plaka için Trizol 5 ml ilave edilir. Çok sayıda zaman noktasında ya da koşullar da dahil olmak üzere karmaşık bir deney için, bu adım en çok iki kişi, orta, Trizol ekleme ve lizat hasat diğer bir kaldırarak yapılır.
  2. Tam bir hücre parçalama, oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir.
  3. Eklendi Trizol ile dikkatli bir şekilde plaka durulama bir 10 ml pipet kullanın. Bu tam hücre parçalama ve örnek kurtarma yardımcı olur. Cilt veya gözlerle temas alırken Trizol son derece tehlikeli olduğu gibi dikkatli olun! Eldeki fenol yanıklar (örneğin polietilen glikol 300 veya endüstriyel metil alkol (70:30) 400) için panzehir var. Polipropilen tüplere örnekleri aktarın. Standart Falcon tüpler) bu yüksek g kuvvetleri karşı değil lütfen unutmayın. Örnekler I Toplam RNA kadar en az bir ay süreyle -20 ° C'de saklanabilirs hazırlanmıştır.

2. Modifiye Trizol Protokolü kullanarak RNA Hazırlık

  1. 1 ml kloroform (ml Trizol başına 0.2 ml) ekleyin ve 15 saniye boyunca kuvvetlice çalkalanır. 3 dakika - 2 saat oda sıcaklığında inkübe edin.
  2. 4 ° C'de 15 dakika 13,000 x g'de santrifüjleyin ° C
  3. Yeni bir 15 ml polipropilen tüpe sulu üst faz (RNA ihtiva eden) aktarın.
  4. RNA ekleme ½ Çöktürme tamponu ve izopropanol hem de reaksiyon hacmi (3 ml süpernatant, örneğin, 1.5 ml RNA Çöktürme tamponu ve 1.5 ml izopropanol ekleme).
  5. İyice karıştırın. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  6. 4, 10 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüje ° C Süpernatant atın.
  7. Kısaca aşağı doğru döndürün (5000 × g 30 saniye) ve 200 ul pipet ile artık izopropanol çıkarın.
  8. % 75 etanol eşit hacim eklemek ve topak ayrılıncaya kadar tüp çalkalanır. Geride kalan bu kadar çok küçük parçalar halinde o kırılma önlemek yapabilir kaldırmal etanol zor.
  9. 4, 10 dakika boyunca 13.000 x g'de santrifüje ° C Süpernatant atın.
  10. Kısaca RNA aşağı Spin ve 200 ul pipet ile kalan etanol çıkarın. 20 ul pipet ile kalan etanol adım ve çıkarın tekrarlayın. Bu iki adım sonra, pelet başka bir kurutma işlemi ifa edilmelidir.
  11. 100 mg beklenen RNA verim başına H 2 O 100 ul ekleyin ve 5 aşağı yukarı pipetleme ve ile iyice karıştırın - 6 kez RNA çözme yardımcı olmak için.
  12. Çözülür ve 65 ısıtılarak denatüre RNA ° C'de 10 dakika (çalkalama) ve hemen buz üzerine yerleştirin.
  13. Üreticinin yönergeleri izleyerek, bir NanoDrop spektrofotometre kullanılarak 260 nm dalga boyunda konsantrasyon RNA ölçün. Bu RNA, en az bir ay boyunca -80 ° C'de muhafaza edilebilir.

3. Yeni Transkripsiyonu RNA tiol özgü biyotinilasyon

  1. 60 ile başlayın - toplam hücresel RNA 80 mikrogram.
  2. Reaksiyon etiketleme oluşturmaktadır. Aşağıdaki Pipetsipariş (başına mikrogram RNA):
    1. 1 ul 10x biyotinilasyon Tampon
    2. 7 ul RNA (nükleaz içermeyen H 2 O seyreltilmiş 1 mg RNA içeren)
    3. 2 ul Biotin-HPDP (1 mg / ml DMF)

Her zaman biotin-HPDP son ekleyin ve pipetleme hemen karıştırın. Biyotin çökeltiler durumda, DMF içeriği% 40 arasında bir konsantrasyona kadar arttırılabilir.

  1. Rotasyonu ile 1.5 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
  2. Kloroform eşit hacimde ekleyin. Şiddetle karıştırın. Aşamalarını başlar ve kabarcıklar yok başlayana kadar 3 dakika - 2 inkübe edin.
  3. 4 ° C de 5 dakika için 20,000 x g'de santrifüjleyin Dikkatli bir şekilde yeni bir tüp içine, üst sulu faz transfer.
  4. Bir kez adımları 3.4 ve 3.5 tekrarlayın. Bu RNA kaybını azaltmak için 2 ml Faz Kilidi Jel Ağır tüplerde bu adımı gerçekleştirmek isteyebilirsiniz.
  5. RNA ayrılması: eklenti 1/10 5 M NaCI ve hacmi eşit hacimdeSu fazı, izopropanol.
  6. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin Süpernatant atın.
  7. Supernatant 10 dakika 4 ° C'de 20,000 azından% 75 etanol, santrifüj eşit bir hacmi x g ekleyin.
  8. Kısaca Spin ve 200 ul pipet ile artık etanol çıkarın.
  9. Kısaca Spin ve 20 ul pipet ile artık etanol çıkarın.
  10. RNA kurumasına izin vermeyin. 50 yeniden askıya - 100 ul H 2 O (1 mcg giriş RNA başına ~ 1 ul). 6 kez - 5 yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın.
  11. RNA bozulma dışlamak için electrophoretical analizi ile RNA kalitesini kontrol edin.

4. 4SU-Esas nokta Blot Analizi (İsteğe bağlı)

4SU ​​birleşme kolayca biyotinile edilmiş RNA dot blot analizi ile tespit edilebilir. Bu sorun giderme ve biotinlenmiş DNA oligo kontrole göre 4SU dahil oranlarının tahmin sağlayan isteğe bağlı bir adımdır. Bu tahlil için, biz rAdım 3.2 4SU-etiketli RNA biyotinilasyon için yerine biotin-HPDP bir iyodoasetil-biotin kullanarak ecommend. 4SU-RNA geri dönüşü olmayan bir biyotinilasyon ile sonuçlanır. Bu nedenle, kolon dayalı yöntemler (örneğin, RNeasy) biyotinile edilmiş RNA çok küçük miktarlarda (örneğin, 5 mg) geri kazanılması için kullanılabilir. RNA, bu tahlil için uygun olan biotin-HPDP biotinli olsa da, elde edilen sinyali (Şekil 3) ve zayıf sinyal-gürültü oranı daha az tercih edilir.

  1. Bölüm 1 ve 2 de tarif edildiği gibi toplam hücresel RNA 4SU-etiketleme ve izolasyonu için protokol takip edin.
  2. Iyodoasetil-biotin ile biotin-HPDP yerine bölümünde 3 açıklanan ve tamamen aşırı iyodoasetil-biotin artıkları çıkarmak için iki kloroform ekstraksiyon gerçekleştirmek olarak Biotinylate RNA 4SU-etiketli.
  3. Açıklanan ya da olgu RNA az miktarda ((örneğin RNeasy) bir sütun tabanlı yaklaşım kullanarak olarak izopropanol / etanol yağış biyotinlenmiş RNA Kurtar <10 mg) Kullanılır.
  4. 10 dakika süre ile sallanan nükleaz içermeyen su içinde Zeta membran inkübe edin.
  5. Nükleaz içermeyen su dışında zar atın ve iki temiz kağıt havlu ve sıkıca basarak arasında membran yerleştirerek aşırı sıvı çıkarın. Hava ile kurutma 5 dakika boyunca zarın güzel noktalar ile sonuçlanacaktır.
  6. Her numune için, buz gibi soğuk nokta benek bağlama tamponu (10 mM NaOH, 1 mM EDTA) kullanılarak 200 ng / ul RNA 20 ul hazırlar. Pipetleme Zeta zara bu seyreltme 5 ul (RNA yani 1 ug) ve aynı zamanda takip eden üç 10-kat seyreltme (örneğin, sırasıyla 100, 10 ve 1 ng RNA) uygulanır. Pipet uçları boş bir raf ile pipetleme eşit olarak dağıtılmış boşluk sağlamak için kullanılabilir. Seçenek olarak ise, üreticinin talimatlarına uygun olarak bir nokta lekesi cihazı kullanın.
  7. Olumlu bir devam olarak 20 ng / ul 20 ug / ml (yani, 100-0,1 ng oligo), değişen konsantrasyonlarda biyotin-etiketli DNA oligo 5 ul uygulayınpipetleme membran rol. Negatif kontrol olarak biotinlenmiş, 4SU-naif örnek kullanın.
  8. Açık havada kurumaya 5 dakika boyunca membran.
  9. Sallama ile 40 ml bloke tamponu içinde 30 dakika boyunca zarın inkübe edin.
  10. 15 dakika (5 ml PBS + 5 ml% 20 SDS + 10 ul streptavidin-yaban turpu peroksidaz) için 1:1,000, streptavidin-yaban turbu peroksidazı 10 mL 'si ile inkübe membran
  11. 5 dakika boyunca 40 ml PBS +% 10 SDS (20 mi PBS + 20 ml% 20 SDS) içinde iki kez membran yıkayın.
  12. 40 ml PBS içerisinde iki kez membran yıkayın 5 dakika boyunca +% 1 SDS (38 ml PBS + 2 ml% 20 SDS).
  13. 40 ml PBS içerisinde iki kez membran yıkayın 5 dakika boyunca +% 0.1 SDS (40 mL PBS + 200 ul% 20 SDS).
  14. Iki temiz kağıt havlu arasında membran yerleştirerek ve sıkıca bastırarak aşırı sıvı çıkarın.
  15. Üreticinin talimatlarına göre ECL kullanarak membrana bağlı HRP gözünüzde canlandırın.
  16. Plastik folyo / torbaya membran yerleştirin, hava kabarcıkları ve karanlıkta 2 dakika süreyle inkübe edin.
  17. Membran maruz1 Film - 5 dk.

5. Streptavidin kaplı Manyetik Boncuk kullanarak Etiketli ve Etiketsiz RNA ayrılması

  1. Isı ° C bir su banyosunda 65 (örnek başına 3 ml) bir yıkama tamponu.
  2. Nükleaz içermeyen H 2 O taze 100 mM ditiyotreitol (DTT) hazırlayın Ultra-ince terazi gözü üzerine yerleştirildi, temiz bir 50 ml Falcon tüpüne DTT toz, 30 mg - 15 şişeden bunu. Nükleaz içermeyen H 2 O gerekli miktarda tartılır ve ekleyin
  3. Isı ° C 10 denatüre dk ve buz üzerinde hemen yer 65 RNA örnekleri biotinlenmiş.
  4. Yer manyetik stand içine sütun μMacs. Biz bir anda birden fazla 12 örnek (- 8 örnekleri uygun olan 6) işlemek için değil tavsiye.
  5. 1 ml oda sıcaklığında tampon yıkama ile ön dengeye Miltenyi sütunlar. Bu yaklaşık 15 dakika sürer.
  6. Bu arada, 50 streptavidin boncuk 100 ul - biyotinile edilmiş RNA 100 ul. Rotasyonu ile 15 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe edin.
    7. < li> sütunları herhangi artık boşaltma başlatılan değilse bu hafifçe bir eldivenli parmak ile sütunun üstüne basarak kolaylaştırılabilir. Bir kez akışını sütunları kolayca tahliye başlamıştır.
  7. Sütunlara RNA / boncuk uygulayın. Akış-size etiketsiz RNA fraksiyonu (bkz. bölüm 7) kurtarmak istediğiniz sürece atın.
  8. 0.9 ml 65 ° C yıkama tampon maddesi (65 ° C'de tampon pipetleme 1 ml'lik pipet uçları shrink). Ile üç kez yıkayın
  9. 0.9 ml oda sıcaklığında yıkama tamponu ile üç kez yıkayın.
  10. Pipet 700 ul Tampon yeni 2 ml tüpler içine RLT (RNeasy MinElute Temizleme Kiti, Qiagen) ve sütunları altına koyun.
  11. Sütununa 100 mM DTT, 100 ul ekleyerek RLT tampon içine yeni kopyalanan RNA Zehir.
  12. 100 mM DTT başka bir 100 ul ekleyerek sonra aynı tüp içine ikinci bir elüsyon turda 3 dk gerçekleştirin.

6. Yeni kopyalanan RNA geri kazanımı

ontent "> üreticinin talimatları izleyerek RNeasy MinElute Temizleme (Qiagen) protokolü ile devam edin. 25 ul nükleaz içermeyen H 2 O ölçün RNA konsantrasyonlarda Zehir bir Nanodrop Spektrofotometre kullanarak. göndermeden önce RNA çözülme ve yeniden dondurmak için ihtiyaç önlemek için bir yüksek verimli test için, hemen yeni transkripsiyonu RNA sonra cDNA hazırlanıyor tavsiye arındırılır. üreticinin talimatları cDNA sentezi için 20 ul cDNA sentezi karışımı yeni transkripsiyonu RNA 2.5 ul kullanın. 1 ile Mah-PCR kontrolleri gerçekleştirin : cDNA karışımı 10 dilüsyonları -80 ° C'de saklayın RNA.

7. Etiketsiz, Sınırsız RNA (İsteğe bağlı) geri kazanımı

Durumda ilişkisiz RNA geri gereken, akış yoluyla (sütunlara RNA-streptavidin boncuk çözüm ekledikten sonra) ve sonraki yağış için ilk yıkama toplamak ve birleştirmek. Genellikle thi olarak ilişkisiz RNA sadece 50% çöktürmek için yeterlidirin başlangıç ​​malzemesinin>% 80 içerir.

  1. Izopropanol eşit hacimde (tuz yıkama tamponu önce, 1 M NaCl içeren olarak ilave edilmesi gerekir).
  2. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin Süpernatant atın.
  3. Supernatant 10 dakika 4 ° C'de 20,000 azından% 75 etanol, santrifüj eşit bir hacmi x g ekleyin.
  4. Kısaca Spin ve 200 ul pipet ile artık etanol çıkarın.
  5. Kısaca Spin ve 20 ul pipet ile artık etanol çıkarın.
  6. RNA kurumasına izin vermeyin. 100 ul H 2 O içinde süspanse 6 kez - 5 yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Çalkalama ile 10 dakika boyunca 65 ° C'de inkübe edilir ve buz ile doğrudan transfer.
  7. RNA bozulma dışlamak için electrophoretical analizi ile RNA kalitesini kontrol edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

1. Başlangıç ​​Malzeme ve Beklenen Verim

4SU-maruz kalma 1 saat (saat) ardından yeni transkripsiyonu RNA yaklaşık 1 temsil - toplam hücresel RNA 4%. Artık hücre büyümesi / çoğaltma için hesaba RNA sentezi gibi bu büyüme-tutuklandı hücrelerde daha düşük olacaktır. Toplam RNA 80 mg - 1 saat etiketleme, biz 60 ile tahlil başlayan tavsiye. Biyotinilasyon adımdan sonra görmek zor olan küçük RNA pelet toplam RNA sonuçların az 30 mikrogram ile başlayan ve bu nedenle kolayca kaybolabilir. Giriş RNA düz...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yeni transkripsiyonu RNA Metabolik etiketleme ölçüde ilgi biyolojik soruya cevap daha uygun şablonlar sunarak mikroarrayler ve RNA-seq gibi yüksek verimli teknolojilerin gücünü artırır. İşbu Protokol kapsamlı optimizasyon yapıldı. Bu yeni transkripsiyonu RNA> 1000 kat zenginleştirme sağlar ve yüksek tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Yeni transkripsiyonu RNA sadece 4SU hücrelerin maruz kalma döneminde gerçek zamanlı transkripsiyonel aktivitesini tasvir gibi bir 4SU-etiketleme deney deneysel...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Biz yazının dikkatli bir okuma için Amie Regan teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma LD ve CCF için DFG hibe FR2938/1-1 için NGFN Artı hibe # 01GS0801, MRC dostluk hibe G1002523 ve NHSBT hibe WP11-05 tarafından desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
4-tiouridinKarbosynthT4509Steril H2O'da 50 mM stok hazırlayın, -20 ° C'de saklayın; 50-500 &mu'luk alikotlarda C; l, kullanılmayan reaktifi atın, tekrar dondurmayın.
TrizolInvitrogen15596026 (100 ml), 15596018 (200 ml)UYARI - AŞINDIRICI ve SAĞLIĞA TEHLİKELİ ! Fenol panzehirine (PEG-Metanol) anında erişim sağlayın; 4 ° C'de saklayın.
KloroformSigma372978UYARI - SAĞLIĞA TEHLİKELİ
IsopropanolSigma650447
Sodyum sitrat, nükleaz içermeyenSigmaC8532Nükleaz içermeyen su kullanarak 1,6 M stok çözeltisi hazırlayın.
5M nükleaz içermeyen NaClSigma71386Stok çözeltisi Nükleaz
içermeyen H2OSigmaW4502Nükleaz içermeyen tüplerde 1 ml alikot yapın.
RNA çökeltme tamponu1.2 M NaCl, nükleaz içermeyen suda 0.8 M sodyum sitrat. Kesinlikle nükleaz içermeyen koşullar altında önceden hazırlanın. Oda sıcaklığında 50 ml'lik şahin tüplerinde saklayınız.
EtanolSigma459844% 80 etanol hazırlamak için nükleaz içermeyen su ile kullanın, -20 ° C'de saklayın.
1 M nükleaz içermeyen Tris Cl, pH 7.5Lonza51237Stok çözeltisi
500 mM nükleaz içermeyen EDTA, pH 8.0Invitrogen15575-020Stok çözeltisi
10x Biyotinilasyon Tamponu (BB)100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA nükleaz içermeyen suda, 1 ml'lik alikotlar yapın.
Dimetilformamid (DMF)SigmaD4551
EZ-Link biotin-HPDPPierce2134150 mg biotin-HPDP'yi 50 ml DMF'de çözerek 1 mg/ml stok çözeltisi hazırlayın. Nazik ısınma çözünürlüğü artırır. 4 & derecede saklayın; 1 ml'lik alikotlarda C.
Faz Kilit Jel Ağır tüpler 2.0 mlEppendorf0032 005.152Kloroform ekstraksiyon aşaması için isteğe bağlı.
Zeta membranBIORAD162-0153
10x Nokta leke bağlama tamponu100 mM NaOH, 10 mM EDTA
Biotin-oligo5'-biotin, 25 nükleotid, herhangi bir dizi
Sodyum dodesil sülfatFisherBPE9738100 ml% 20 stok çözeltisi için, 80 ml PBS pH 7-8'e 20 g SDS ekleyin ve hacmi 100 ml'ye ayarlayın. Tüm yüksek yüzdeli SDS çözeltilerini 20 ° C'nin üzerinde tutun. Ilık çözeltiler hafifçe SDS çökelmelidir.
EZ-Link İyodoasetil-LC-BiotinPierce2133350 mg iyodoasetil-biotini 50 ml DMF'de çözerek 1 mg/ml stok çözeltisi hazırlayın. Nazik ısınma çözünürlüğü artırır. 4 & derecede saklayın; 1 ml'lik alikotlarda C. Geri dönüşümsüz, tiyola özgü biyotinilasyon oluşturur.
Fosfat tampon salinGibco10010-015
Nokta leke engelleme tamponu20 ml% 20 SDS'yi 20 ml 1 x PBS pH 7-8 ile karıştırın ve 1 mM'lik nihai konsantrasyona EDTA ekleyin.
Streptavidin-yaban turpu peroksidaz Vektör LaboratuvarlarıSA5004-20 ° C'de saklayın. 10 ml% 20 SDS'yi 10 ml 1 x PBS ile karıştırın. 20 &mu ekleyin; l Kullanmadan önce Streptavidin-HRP.
ECL reaktifiGE HealthcareRNP2109Üreticinin talimatlarına göre kullanın.
Süper RX, X-RA Film, 18x24 cmFujifilm47410 19236
μ Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Boncukları 4 ° C'de saklayın.
Tween 20SigmaP1379
Yıkama tamponu100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, %0.1 Tween 20 nükleaz içermeyen H2O.
Dithiothreitol (DTT)Sigma43817Nükleaz içermeyen H2O'da 100 mM DTT olarak hazırlayın, kullanmadan önce daima taze hazırlayın.
RNeasy MinElute KitiQiagen74204Sütunları 4 > C, kitin oda sıcaklığında kalan bileşenleri.
1.5 ml vidalı polipropilen tüplerSarstedt72.692.005Dimetilformamid ile uyumlu
2.0 ml vidalı polipropilen tüplerSarstedt72.694.005Dimetilformamid
15 ml tüplerBD Falcon352096Dimetilformamid 50
ml tüplerile uyumlu BD Falcon352070Dimetilformamid ile uyumlu
Aksi belirtilmedikçe tüm çözeltiler/reaktifler oda sıcaklığında saklanmalıdır.
Equipment
UV/VIS spektrofotometresiThermo ScientificNanoDrop 1000Veya eşdeğeri. Düşük ses seviyesi kullanın (1-2 & mu; l) aşırı numune kaybını önlemek için düşük RNA konsantrasyonlarının ölçümleri için.
Polipropilen 15 ml santrifüj tüpleriVWR International525-0153Standart 15 ml'lik tüplerin aksine, bunlar 15.000 &# 215'e kadar tolere eder; g
Yüksek hızlı santrifüjBeckman CoulterAvanti J-25Veya 13.000×'e ulaşabilen eşdeğer ekipman; g
Yüksek hızlı rotorBeckman CoulterJLA-16250Veya 13.000×'e ulaşabilen eşdeğer ekipman;
g 15 ml tüpler için adaptörlerLaborger & # 228; te Beranek356964Veya 13.000×'e ulaşabilen eşdeğer ekipman; g
Soğutmalı masa üstü santrifüjEppendorf5430 RVeya eşdeğeri.
TermomikserEppendorfThermomixer kompaktVeya eşdeğeri.
Manyetik standMiltenyi Biotec130-042-109Bir stand 8 &mu tutar; Macs sütunları.
Subanyosu HibesiSUB Aqua 5Veya eşdeğeri.
Ultra ince ölçekliA & DGR-202Veya eşdeğeri.
E-Gel iBase Güç SistemiInvitrogenG6400UKRNA jelleri için; veya eşdeğeri.
E-Gel EX %1 agaroz prekast jellerInvitrogenG4020-01RNA jelleri için; veya eşdeğeri.
ile uyumlu

Kaynaklar

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

RNA lemeRNA Bozunumu4 Tiouridin aretlemeTiyol Spesifik BiyotinilasyonStreptavidin Manyetik BoncuklarYeni Transkribe Edilmi RNA Safla t rmaQ RT PCR AnaliziYeni Nesil Dizileme
Hücre Kültürü RNA sentezi, İşleme ve Çürüme Yüksek Çözünürlük Gen İfadesi Profil için Yeni Transkripsiyonu RNA Metabolik Etiketleme
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.