Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu

21K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/50200

⸱

13 Mart 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

Bu makalede

Özet

Bu makale, birincil hücre kültürleri ve nasıl tümör hücrelerinden eritrositler ve fibroblastların kirlilikler çıkarmak için taze olarak elde edilen melanom doku hazırlanmasını tarif etmektedir. Son olarak, biz nasıl tarif CD133 + Farzedilen melanom kök hücreler CD133 doğru sıralanır - Manyetik Aktif Hücre Ayırma (MACS) kullanarak toplu.

Özet

Mevcut melanom bugün için daha iyi tedaviler seçenekleri rağmen, ileri malign melanom hastalarında hala progresyonsuz ve genel sağkalım için kötü bir prognoza sahiptir. Bu nedenle, translasyonel araştırma malign melanom için hedefli tedaviler geliştirmek için ileri moleküler kanıtlar sağlaması gerekir. Melanom ile ilgili geçmişte, onkojenik mekanizmalar yoğun yerleşik hücre hatları çalışıldı. Bireysel genetik profillerine dayalı daha kişiselleştirilmiş tedavi rejimleri için yolda, biz hasta türevi hücre hatları yerine jenerik hücre hatları kullanmayı öneriyoruz. Birlikte özellikle hasta takibi üzerine yüksek kalitede klinik verilerle birlikte, bu hücreler daha melanoma ilerleme arkasında moleküler mekanizmaları anlamak için vesile olacaktır.

Burada disseke taze tümör dokusu primer melanom kültürlere kurulması rapor. Bu işlem, tek bir hücre içine kıyma ve doku ayrışma, yeniden içerireritrositler ve fibroblastlar gibi primer kültür ve hücrelerin melanom kökenli güvenilir doğrulama ile kontaminasyonların moval.

Son raporlar ortaya koydu melanomlar, tümörlerin çoğunluğu gibi, limana sadece metastatik devlete karşı tümör gelişimini ve ilerlemesini yakıt gibi kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu. Melanom CSC kimlik ve izolasyon için önemli belirteçler biri CD133 olduğunu. Primer melanom kültürlere ait CD133 + rulmanları yalıtmak için, değiştirilmiş ve Manyetik-Aktif Hücre yüksek sıralama saflıkta sonuçlanan Miltenyi gelen Sıralama (MACS) prosedürü ve CD133 + rulmanları ve CD133 canlılığı optimize - dökme, ekili ve fonksiyonel analiz edilebilir bundan sonra.

Giriş

Kutanöz malign melanom cilt kanseri en sık görülen, ama en ölümcül türüdür. Artan bir insidans, ölümleri 1,2 ilişkili malign deri tümörlerinin% 75 malignite ve hızlı yayılması bir yüksek dereceli, şimdi melanomlar hesabı nedeniyle. Primer tümör, kemoterapi, radyoterapi, immünoterapi ve metastas melanom kombine kemoterapi ve immünoterapi cerrahi eksizyon yanında melanom tedavisinde 3,4 için state-of-the-art stratejilerdir. Ancak, malign melanom kemoterapötiklerin zayıf yanıt (% 5-12) 5,6 ve Hazır vemurafenib 7 ile tedavi gibi yeni hedefli tedaviler vadeden BRAF V600E gen mutasyonunun yararı taşıyan melanom hastalarının yalnızca% 50-70 ile karakterizedir sağkalımı, melanom Tümörgenez mekanizmaların daha iyi anlaşılması gereklidir.

Geçmişte, köklü ticari bu mekanizmaların incelenmesilikle mevcut hücre çizgileri kullanıldı. Kanser başlangıcı ve ilerlemesindeki moleküler olayları incelemek için daha yeni yaklaşımlar tümör dokusunun doğrudan elde primer kültürlerinde kullanmak - bir strateji rulman manifoldu faydaları: araştırmacı hasta ve doku seçimi üzerinde tam denetime sahiptir. Örneklenen hücreler ustaca seçilen tümör dokusu elde, tüm heterojenite ile tümörü andıran ve takip hastanın verileri ve ayrıntılı patoloji kültürünün özelliklerini orijinal tümör 8 ile karşılaştırıldı izin vermek için kullanılabilir.

Buna karşılık, kanser araştırma ilgili model sistem olarak oluşturulmuş hücre hattını kullanmak tartışılmaktadır. Zaten 1987 yılında Osborne ve arkadaşları farklı laboratuvarlarda 9 MCF-7 insan meme kanseri hücre hatları arasında önemli biyolojik farklılıklar açıklanmıştır. Altkültür sırasında RNA ekspresyonunda Bu geniş genomik kararsızlık ve değişkenlik işbirliği olduHiorns ark nfirmed. ve hücre hatları böylece insan kanser 10 modelleri gibi kurulan kültürlerin doğrudan alaka zayıflaması, kültür gelişmeye emin delil destekleyici veriler sağladı.

Büyük ölçüde yıllar boyunca ihmal edilen bir diğer önemli göz, hücre hatları çok sayıda HeLa ile kirlenmiş olduğunu ilk göstererek yirmi yıl önce çizildi ilgisiz 'false' hücreleri ile kültürlerin kontaminasyon veya büyümesi riski olduğunu hücreleri 8,11. 'Yanlış' hücre hatları verilerin yanlış yorumlanmasına son zamanlarda tekrar literatürde açık olarak ortaya çıkmıştır. DNA profili ve moleküler sitogenetik bir arada kullanarak, McLeod ve ark. 252 yeni tümör türevli insan hücre hatları, Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri (DSMZ), Alman Collection tevdi yaklaşık% 18 oranında intraspecies olduğu bulunmuştur ya da çapraz türler arası olduğunu göstermiştir -kirletici 12,13.

Bu sorunları önlemek için ve yukarıda belirtilen avantajlardan yararlanmak için, biz yeni eksize metastaz düşük-geçiş melanom hücre hatları kurmaya karar verdi.

Sağlam hücre ayırma ve analiz teknolojileri eşzamanlı karakteristik yüzey proteinleri hücre ölüm ve yıkım sınırlayan ise tek hücreli preparatlar elde edilecek gerektirir. Tek hücre süspansiyonları içine dokuların otomatik ayrışma için benchtop enstrüman Miltenyi tarafından imal GentleMACS Dissociator olduğunu. Antijen epitoplarının korunması ve hücre kaybını azaltma süre GentleMACS C tüp ve optimize edilmiş ayrışma çözeltiler, kapalı bir sistem içerisinde tümör dokusunda etkili ve yumuşak bir ayrılma ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman elde edilir. Enstrüman özel uygulamalar ve teminatlar melanom dokusunun 14 tek hücre süspansiyonları standardize hazırlık çeşitli için optimize edilmiş, önceden ayarlanmış programları sunmaktadır.

tümörlerin çoğunluğu sadece tümör başlatılması ve kapasite kendini yenileyen sergilerler denilen kanser kök hücreleri (rulmanları), küçük bir subpopülasyonu liman ortaya çıkanlar raporlar. Derinin dermis melanosit üreten kök hücrelerinin tanımlanması UVA ışınlarına maruz malign transformasyon 15 için bu hücreleri hazırlamak çünkü bu hücrelerin melanom kanser kök hücreleri (rulmanları) kökeni olabileceği hipotezini doğurmuştur. Bu tür bir genetik lezyon sonucu, tümör ve kök hücre özelliklerinin bir kombinasyonu liman hücreler olacaktır.

Melanom rulmanları ve alt sınıfı için önerilen anahtar belirteçlerin biri CD133 16-20 olduğunu. CD133 (ayrıca Prominin 1 olarak da bilinir), pentaspan transmembran glikoproteinler üyesi, hematopoetik kök hücreler, endotelyal progenitör hücreleri, nöronal ve glial kök hücreleri 21-23 olarak ifade edilir. CD133 ekspresyonu ile korelasyonasimetrik hücre bölünmesi 24, ve CD133 ve glikosilatlı epitop 25 hücre farklılaşması üzerine aşağı regüle olduğu gösterilmiştir. Son zamanlarda, CD133 + melanom hücrelerinin kendini yenileme ve tümör-inisiyasyon kapasitesi 19,20 olduğu gösterilmiştir.

CD133 + olası melanom rulmanları fonksiyonunu incelemek için, değiştirilmiş ve CD133 yüksek derecede zenginleştirilmiş ve canlı popülasyonları + ve CD133 elde Miltenyi Biotech gelen Manyetik-Aktif Hücre Ayırma (MACS) sistemi optimize - hücreleri.

Matheu ark gösterildiği gibi Manyetik boncuk tabanlı hücre ayırma ya negatif seçim için izin verir. 26 veya pozitif seleksiyon Burada göstereceğimiz gibi. Pozitif seçimi sırasında özellikle hedef hücre tipi, örneğin CD133 eksprese eden hücrelerin, manyetik bir karşı yüksek düzeyde özgül antikorlarla konjuge olan microbeads, 50-nm Süperparamanyetik parçacıkları ile etiketlenmiştirözel hücre yüzeyi antijenine. Etiketsiz hücreleri akmasına ise ayrılık sırasında, manyetik etiketli hücreleri, ayırıcı manyetik alanında sütun içinde korunur. Yıkama adımları takiben, sütun ayırıcı manyetik alan kaldırılır ve hedef hücrelerin sütundan elüt edilmiştir. LS veya MS sütunları yüksek saflıkta etiketli ve etiketsiz hücre fraksiyonları pozitif seleksiyon sonucu sırasında kullanılır. Diğer taraftan, negatif seleksiyon için kullanılan LD kolonlar, etiketli fraksiyonunun biraz daha düşük bir saflık ile sonuçlanır. Bunların matris ambalaj yoğun olması nedeniyle bu sütunlarda debi sütununda tuzağa, etiketsiz hücrelerin daha yüksek bir risk düşük sonuç olduğunu. LD sütunları nedenle istenmeyen bir hücrenin alt populasyonun sıkı tükenmesi için kullanılmalıdır. Pozitif seçim incubatio aşağıdaki mikro-küreler ile doğrudan (mikro-küreler bağlanmış antikor) veya dolaylı manyetik etiketleme (kuluçka ile gerçekleştirilebilirN birincil antikor ile birlikte). Spesifik MACS mikro-küreler ya da prostat melanom 27 gibi primer tümör hücrelerinin çok sayıda hücre tiplerinin pozitif seçim için kullanılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Birincil hücre kültürü, fibroblast tükenmesi ve CD133 manyetik hücre sıralama tümör dokusu, karakterizasyonu ikinci birincil tek hücrelerin hazırlanmasını da içeren deney genel düzeni + ve CD133 - melanom hücrelerinin Şekil 1 'de gösterilmiştir.

1. Örnek Toplama

  1. Sonraki adımlar dikkate alınarak önce etik kurul onayı için kontrol edin.
  2. Steril PBS cerrahi OR ekibine% 1 Penisilin-Streptomisin final konsantrasyon ve el ile desteklenmiş bir 50 ml tüp hazırlayın.
  3. 4 ° C'de cerrahi hücre kültürü laboratuarına tümör dokusunun hızlı ulaşım Organize

2. Tümör Dokusu Primer Melanom Tek hücre hazırlanması

  1. Steril koşullar altında tüm adımları uygulayın.
  2. Tümör rezeksiyonu önce, bir ayrışma karışımı hazırlamak gerekmektedir. 2-4 g doku başına 10 ml ayrışma karışımı gereklidir. Karışım immedia kullanılabilirlarına ya da daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de 10 ml alikots içinde saklanmıştır.
    1. 150 mM sodyum klorid içeren bir çözelti hazırlayın. Çözümü netleşene kadar bir girdap kullanarak karıştırın. Eğer bir 0.22 um filtre kullanılarak steril gerekli-Süzülen madde sodyum klorür çözeltisi.
    2. DNaz I tartılır ve 10 mg / 150mm sodyum klorür ml DNaz I içeren bir solüsyon hazırlanır. Çözümü netleşene kadar alt üst edilerek karıştırılır.
    3. PBS içinde 100mg/ml Kollajenaz IV içeren bir solüsyon hazırlayın. Çözümü netleşene kadar alt üst edilerek karıştırılır. Kolajenaz çözeltisi alikotlar birkaç ay boyunca -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
    4. % 1 Penisilin-Streptomisin, 1 mg / ml kollajenaz IV, ve 0.1 mg / Quantum 263 orta ml DNase I, bir son konsantrasyon ile ayrışma karışım hazırlayın. Bir girdap kullanarak karıştırın. İsteğe: 1.5 ug / ml amfoterisin B'nin bir nihai konsantrasyon için ayrışma karışımına ekleyin cilt amfoterisin B çözeltisi elde edilen melanom doku kullanıldığında
  3. Pre-sıcak req37 disosiyasyon karışımı, PBS ve Kuantum 263 orta uired miktarda ° C.
  4. Steril bir Petri kabı yerleştirin tümör dokusu. Doku aşırı çözüm aspire ve 500 ul dissosiyasyon karışımı ekleyin. Taze, steril neşter kullanılarak 2-4 mm küçük parçalar halinde doğrayın tümörü.
  5. Transferi 2-4 gr 5 ml dissosiasyon karışımını içeren GentleMACS C Tüp içine tümör dokusu kıyılmış. Ek 4.5 ml disosiyasyon karışımı ile Petri durulayın ve GentleMACS C Tüp kalan doku parçaları ekleyin.
  6. GentleMACS C tüpü kapatın ve GentleMACS Dissociator bir kol üzerine ters takın. GentleMACS programı "h_tumor_01" çalıştırın.
  7. Dissociator gelen GentleMACS C tüpü ayırın ve 37 az 30 dakika örnek inkübe ° C yerleşti dokusu parçalanmakta süspansiyonu her 5 dk yüksek çalışma hızı (12 rpm) veya manuel olarak tüp çevirerek MACSmix Tüp Rotator kullanarak sürekli rotasyon altında .
  8. T kol üzerine baş aşağı GentleMACS C boru takınO GentleMACS Dissociator ve GentleMACS programı "h_tumor_02" çalıştırın.
  9. Dissociator gelen GentleMACS C tüpü ayırın ve 37 az 30 dakika örnek inkübe ° C yerleşti dokusu parçalanmakta süspansiyonu her 5 dk yüksek çalışma hızı (12 rpm) veya manuel olarak tüp çevirerek MACSmix Tüp Rotator kullanarak sürekli rotasyon altında .
  10. GentleMACS Dissociator bir kol üzerine baş aşağı GentleMACS C tüpü takın ve GentleMACS programı "h_tumor_03" çalıştırın.
  11. Dissociator, tekrar süspansiyon örnek GentleMACS C tüp ayırın ve bir 50 ml tüp üzerine yerleştirilmiş bir 70 mikron hücre süzgeci için hücre süspansiyonu uygulanır. Filtrenin tıkanma oluşursa komple süspansiyon koştu kadar steril bir filtre ucu ile hücre süspansiyonu karıştırın.
  12. 5 ml Kuantum 263 orta hücre süzgecinden durulayın.
  13. İsteğe bağlı: Eğer hala Kuantum 263 orta ve uygun bir hücre kültürü dis tohum onları filtre, tekrar süspansiyon parçaları kalan doku parçaları varsah. 37 parça inkübe ° C ve% 5 CO2.
  14. Hücre süzgecinden atın ve sindirilmiş hücre süspansiyonu ile 50 ml tüp kapatın. 300 x g'de 5 dakika süreyle hücre süspansiyonu santrifüjleyin ve supernatant atın.
  15. İsteğe bağlı: hücre pelletini nedeniyle eritrositler 500 ul PBS çift damıtık su, tekrar süspansiyon hücre pelletini 10x çözümü 01:10 sulandırarak 1x Kırmızı Kan Hücresi Lizis Çözüm hazırlamak yüksek miktarda ve 5 ml 1x Kırmızı Kan Hücresi Lizis ekleyebilir, kırmızı görünüyorsa Çözüm. 10 dk için oda sıcaklığında Vortex 5 saniye ile inkübe edin. 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve supernatant atın.
  16. Quantum 263 ve tohum uygun hücre kültürü şişesi içinde hücreleri ile tümör hücrelerinin yeniden süspanse edin. 37 Kültür tümör hücrelerinin ° C ve% 5 CO2 ve% 80 izdiham ulaşmak rutin olarak geçit hücreleri.

3. Primer Hücre Kültürü ve Fibroblast tükenmesi Karakterizasyonu

  1. Fenotipik bir microsco kullanılarak primer hücre kültürü analizpe.
  2. Primer hücre kültürü küçük bir miktar (0.5x 10 6 hücre) Hasat ve neoplastik-, melanom-, kök hücre ve stroma hücre işaretleyici genler için primerler ile RT-PCR işlemi gerçekleştirmek. Analiz etmek için en önemli genler CD90 (fibroblast işaretleyici), TYR (melanom / melanosit işaretleyici), CD133 (kanser kök hücre belirteci), CD83 (olgun dendritik hücreler için marker) ve bir temizlik gen (örn. HPRT ya GAPDH) vardır.
  3. RT-PCR sırasında mikroskopik analizi ve CD90 yüksek ifade fibroblast ile primer melanom kültürünün yüksek kontaminasyon saptandı varsa, Miltenyi gelen Anti-Fibroblastlar microbeads ve D sütunları kullanarak fibroblastlar tüketmek gerekir.

4. Manyetik Hücre CD133 arasında Ayırma + ve CD133 - LS sütunlar kullanma Melanom Hücreleri

  1. PBS içinde 2 mM EDTA,% 5 FCS ihtiva eden tampon MACS hazırlayın. 0.22 mikron Steritop-GP Filtre Ünitesi kullanarak eviren ve steril-süzüntü tampon ile karıştırın. 4-8 ° C Hissedilen tamponKullanmadan önce ve degas.
  2. 37 Pre-sıcak Accutase, PBS ve Kuantum 263 orta ° C.
  3. PBS ile 80% konfluent hücreleri yıkayın. Accutase uygun miktarda ekleyin ve hücrelerin kültür yüzeyden koparak kadar inkübe edin. Quantum 263 ortamı kullanılarak bir 50 ml tüp içinde hücreler toplayın.
  4. Hücre sayısı belirleyin ve az 5 dakika boyunca hücrelerinin gerekli sayıda (2x 10 9 hücrelerin azami sayıda LS Sütun başına yüklenmiş olabilir. Hücre hattı belirli optimum numaralarını tespit edilmeli ve oldukça düşük olabilir Miltenyi protokolüne göre.) Santrifüj 300 xg ve 4-8 ° C'de Tamamen süpernatant aspire.
  5. 350 ul MACS tamponu ile 1x 10 8 hücre azami (yüksek hücre numaraları buna göre aşağıdaki tüm MACS tamponu büyütmek, FCR Engelleme Reaktif, CD133/1-Biotin ve anti-Biotin microbeads birimler için) tekrar.
  6. 100 ul FCR Engelleme Reaktif ekleyin.
  7. 50 ul CD133/1-Biotin ekleyin. 4-8 bir vorteks ve inkübe kullanarak iyice karıştırın ° C fya da 10 dk.
  8. 300 xg ve 4-8 ° C sıcaklıkta 5 dk için 10 ml MACS tampon ve santrifüj ekleyerek yıkayın hücrelerini Tamamen süpernatant aspire.
  9. Yıkama adımı (4.8) tekrarlayın
  10. 400 ul MACS tamponu ile tekrar süspansiyon hücre pelletini.
  11. 100 ul anti-biotin mikro-küreler ekleyin. 15 dakika boyunca 4-8 ° C'de bir vorteks ve inkübe kullanarak iyice karıştırın.
  12. Bu arada, manyetik ayırma için MACS ayırıcı hazırlamak. MACS Ayırıcı Çoklu Stand QuadroMACS takın. QuadroMACS bir manyetik alanda ön sütun kanatlarıyla LS sütun gerekli sayıda yerleştirin. Her sütun altında her bir LS kolon ve uygun bir toplama tüpü (15 ml, 50 ml) içine bir ön ayırma filtresi (30 um Naylon filtre) yerleştirin. 3 ml MACS tamponu ile durulama filtre ve sütun hazırlayın. Flow-through atın.
  13. 300 xg ve 4-8 ° C sıcaklıkta 5 dk için 10 ml MACS tampon ve santrifüj ekleyerek yıkayın hücrelerini Tamamen süpernatant aspire.
  14. 500 ul hücreler süspanseMACS Pre-Ayırma Filtre ile LS kolona hücre süspansiyonu tampon ve uygulamak.
  15. Sütun başına 3 ml MACS tamponu ile üç kez yıkayın. Sütun haznesi boşaldığında Sadece yeni bir tampon ekleyin.
  16. Hücre fraksiyonu - toplanan toplam atık etiketsiz CD133 içerir.
  17. Pre-Ayırma Filtre atın, ayırıcı gelen sütunu kaldırmak ve uygun bir toplama tüpü üzerine yerleştirin.
  18. 5 ml MACS tamponu uygulayın. Hemen sıkıca sütuna pistonu iterek etiketli CD133 + hücreler dışarı floş.
  19. Negatif fraksiyonunun saflığı arttırmak için, QuadroMACS yerleştirilen yeni bir LS dengelenmiş sütun üzerine hücre süspansiyonu uygulanır. Fraksiyon - atık CD133 içerir.
  20. Sütunlar atın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Tümör dokusu tek-hücrelerinin hazırlanması

Şekil 2 (A) ve (B) mekanik ayrışma sonra 2-4 mm parçalar halinde önce bir geç evre melanom hastasının rezeke lenf nodu metastazı örneğidir. Bir 70 mikron naylon ağ gözünden doku ve süzme enzimatik ayrılma sonrasında, hücreler peletlenmiş ve süpernatan atılır. Bu aşamada biz Şekil 2C hücre pelet kırmızımsı bir renk ile belirtilen eritrositler ile yüksek kirlilik gözlenmiştir. Daha sonra, biz açık kahverengi renk

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Tümör hücre pelet eritrosit kontaminasyonu kaldırmak için biz son derece Miltenyi gelen kırmızı kan hücre lizis çözüm kullanmanızı öneririz. Geleneksel Ficoll yoğunluk gradyan santrifüj üzerine eritrositlerin parçalayıcı avantajları, daha hızlı ve daha basit olmasıdır. Ayrıca, Ficoll ve kırmızı kan hücreleri ve tümör hücreleri kaybı ile kirlilikler önlenir. Çok uzun beklerken normalde tümör hücrelerinin Overgrow beri primer hücre kültürü fibroblastların büyümesini gözlemlemek zaman onlar derhal çıkarılmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Yazarlar bu işi desteklemek ve eleştirel bir yazının okunması için M. Dietel ve Dirk Schumacher ederim.

Bu sonuçlara yol açan araştırma hibe anlaşması n altında Yenilikçi İlaçlar Girişimi Ortak Taahhüt ° 115234, Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ve EFPIA şirketlerin 'in mali katkı oluşmaktadır hangi kaynaklardan destek aldı Ayni katkı. Bu çalışma aynı zamanda Berliner Krebsgesellschaft (BKG) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif
Accutase PAA Laboratories GmbH L11-007
Amfoterisin B çözeltisi 250 ug / mL deiyonize su içinde Sigma-Aldrich Inc A2942-50ml
Anti-fibroblastlar mikro-küreler Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133 / 1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Kollajenaz IV Sigma-Aldrich Inc C5138
DNaz I Applichem GmbH A3778.0050
Ca, Mg olmadan D-PBS PAA Laboratories GmbH H15-002
Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA), Sigma-Aldrich Inc E-7889
FBS Üstün Biochrom S0615
Dolaylı CD133 Mikro-Boncuk Kiti insan Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Kapsar: CD133 / 1 (AC133)-Biotin, anti-Biotin microbeads ve FCR Engelleme Reaktif
Penisilin-Streptomisin, sıvı (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Kuantum 263 PAA Laboratories GmbH U15-815
Kırmızı Kan Hücre Lizis Solüsyonu (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Ekipman
Hücre süzgeci (70 mikron) BD Biosciences 352350
GentleMACS C Tüpler Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
GentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Ayırıcı Multi Standı Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Ayırma Sütunlar 25 LS Sütunlar Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix Tüp Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1KG
Pre-Ayırma Filtreler Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Ayırıcı Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo-şırınga filtreleri (0.22 mikron, PES) Carl Roth GmbH & Co KG P668.1
Steritop-GP Filtre Birimin'den 500 ml Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

Kaynaklar

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409(2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952(2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Melanoma Kanser Kök HücreleriCD133 Pozitif HücrelerManyetik Aktif Hücre AyıklamaPrimer Melanoma KültürüFibroblast EksiltmeEritrosit GidermeTümör Dokusu DissosiyasyonuHücre Ayıklama SaflığıKişiselleştirilmiş Tıp Yaklaşımı
Hasta Türetilen Hücre Kültürü ve CD133 İzolasyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.