Method Article

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis Caenorhabditis elegans 'Locomotion

DOI:

10.3791/50226

May 2nd, 2013

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Içinde isteğe bağlı hareket ikna etmek için bir yarı-otomatik mikro-elektro-akışkan yöntemi Caenorhabditis elegans Tarif edilmektedir. Bu yöntem mikroakışkan kanalları içinde hafif elektrik alanlar ("electrotaxis") yanıt solucanlar nörofizyolojik fenomen dayanmaktadır. Mikroakışkan electrotaxis nöronal sağlığı etkileyen faktörler için ekrana bir hızlı, duyarlı, düşük maliyetli ve ölçeklenebilir tekniği olarak hizmet vermektedir.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nematod Caenorhabditis elegans için hastalıkla ilişkili gen ve yollar yanı sıra yetiştirme kolaylığı onun korunması biyomedikal araştırmalar için çok yönlü bir model organizmadır. Çeşitli C. elegans hastalık modelleri gibi dopaminerjik (DA) nöronlar 1 dejenerasyon içeren Parkinson hastalığı (PD), nörodejeneratif hastalıkların da dahil olmak üzere, bildirilmiştir. Transgenlerin ve nörotoksik kimyasal hem de nörodejenerasyonun ve sinir-koruyucu genler ve bileşikler için ekranlar 2,3 temelinde soruşturma sağlayan, DA ve nörodejenerasyonunun solucanlar buna bağlı olarak hareket kusurlar ikna etmek için kullanılmıştır.

C gibi düşük ökaryotlarda Ekranlar elegans nöronal sinyal etkileyen bileşikler ve genleri tanımlamak için verimli ve ekonomik bir yol sağlar. Geleneksel ekranlar genellikle elle yapılan ve görsel kontrol atacak, dolayısıyla, zaman-eksileriniuming ve insan hataları eğilimli. Ayrıca, hücresel seviyede analiz en odak hareket ihmal ederek, bu hareket bozuklukları için özellikle önemli bir parametredir.

Biz C. kontrol ve rakamlarla yeni bir mikroakışkan tarama sistemi (Şekil 1) geliştirdik elegans 'hareket mikro içinde elektrik alan uyaranlara kullanarak. Bir Doğru Akım (DC) alanında sağlam katot doğru hareket ("electrotaxis") 4-talep neden olduğunu göstermiştir. Alanın kutup değiştirme solucan hızlı bir şekilde de yönünü tersine çevirmek için neden olur. Ayrıca dopaminerjik ve diğer duyusal nöronlarda kusurları yüzme yanıt 5 değiştirebilir göstermiştir. Bu nedenle, nöronal sinyal anormallikleri bir okuma-out olarak hareket kullanılarak belirlenebilir. Hareket cevap doğru hız, vücut bükme frekans ve ters zaman yüzme gibi parametreleri bir dizi kullanarak ölçülebilir.

4 ile karşılaştırıldığında daha hızlı hareket. Bu bulgular bize pasif yaş ve fenotip 6 ile solucanlar sıralamak için yeni bir mikroakışkan cihaz tasarımı yol açtı.

Ayrıca darbeli DC solucanlar tepki test edilmiş ve Akım (AC) elektrik alanları Alternatif var. C. hem de çeşitli İş döngülerinin Pulsed DC alanlarında etkili oluşturulan electrotaxis elegans ve kuzeni C 7 briggsae. Başka bir deneyde, 1 Hz ila 3 kHz arasında frekanslarda simetrik AC alanları kanal 8 içine solucanlar immobilize.

Microfluidic ortamda elektrik alan uygulanması electrotaxis testin hızlı ve otomatik yürütme sağlar. Bu yaklaşım faktörler için yüksek verimli genetik ve kimyasal ekranlar kolaylaştırmak için vaat ediyornöronal fonksiyonu ve canlılığı etkileyen.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Usta Kalıp İmalat için Fotolitografi

  1. 30 saniye sonra 30 saniye ve metanol için aseton içinde silikon in 3 batırın. 5 dakika boyunca dH 2 0 su ile durulayın.
  2. Bir N2 darbe silahla gofret yüzeyini kurulayın. 2 dakika süreyle 140 ° C sıcak bir plaka üzerinde gofret ısıtın.
  3. Plazma silikon (1 dk, 50 B) yüzeyi okside eder.
  4. 3 ml SU-8 100 fotorezist (; 1.750 rpm 40 saniye) ile Spin-kat gofret yüzeyi.
  5. 65 sıcak bir plaka üzerinde önceden fırında kaplı gofret ° C 10 dakika, daha sonra 95 ° C üzerinde 2 dakika sıcaklık rampa. Ek olarak 1 saat boyunca bu ayar koruyun.
  6. İstenen kanal tasarımı içeren bir photo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Solucan izleme yazılımı, vahşi tip en genç yetişkin nematod electrotaxis ve pozisyon ve hız çıkış temsili bir video Yardımcı video 1 ve Şekil 3 'de gösterilmiştir. Hareket analiz yazılımı kendi alanında kutup yönünü ve kutup değiştirme sırasında tanımıyor, bunun yerine, bu bilgileri kaynak video alınmalıdır. Bu video bir ses veya görsel işaret kullanarak ya da deneysel koşullar ve manipülasyon yazmak yapılabilir.

Yabani tip (N2) ve transjenik hayvanların (NL.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlk Chuang ve arkadaşları 11,12 dielectrophoretic manipülasyon çalışmaları Gabel ve arkadaşları ve bina tarafından tanımlanan davranış fenomen yararlanarak, bizim mikroakışkan tabanlı electrotaxis tahlil hareket olarak kullanarak solucanlar nöronal aktivite soruşturma için, kolay sağlam ve duyarlı bir yöntem sağlar bir çıkış. Hareket parametrelerin analizi farklı genotipleri arasında kantitatif karşılaştırılması sağlar. Birlikte Mikrokanallı imalat ve elektrik alan uygulama hassas bir kontrol ortam ve hareket.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroakışkan electrotaxis testi teknoloji Amerika ve Kanada ABD'de patent için dava açılmıştır.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar mali destek için kendi Erken Araştırmacılar Ödülü Programı aracılığıyla Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Kurumu, Kanada Araştırma Sandalyeler Programı, Sağlık Araştırma Kanada Enstitüleri ve Araştırma ve Yenilik Bakanlığı Ankara teşekkür etmek istiyorum.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AsetonCALEDON Laboratuvarları1200-1-30
MetanolCALEDON Laboratuvarları6700-1-30
İzopropanolCALEDON Laboratuvarları8600-1-40
SU-8Microchem Corp.Y131273SU-8 100
SU-8 GeliştiriciMicrochem Corp.
92x16mm Petri KabıSarstedt82.1473.001
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitiDow CorningElastomer baz ve sertleştirici içerir
Fonksiyon üreteciTektronix Inc.Model AFG3022B
AmplifikatörTrek Inc.Model 2210-CE
Şırınga pompasıHarvard Aparatı70-4506Model 11 ELITE
Ocak GözüFisher Scientific11675916QModel HP131725Q
: Y020100

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
  2. Kuwahara, T., Koyama, A., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic ElectrotaxisC Elegans LocomotionElectric Field StimulationMicrochannel DesignPDMS MoldingWorm Tracking SoftwareSwimming Speed AnalysisBody Bend FrequencyReversal Time MeasurementNeurodegenerative Disorder Screening

Related Articles