Astar uzantısı (SHAPE) tarafından analiz yüksek verimli seçici 2 'hidroksil asilleme tek nükleotid çözünürlükte binlerce nükleotid birkaç yüz ile RNA'lar yapılarını belirlemek için bir teknoloji sondalama yeni kimyasal, ters transkripsiyon, kapiler elektroforez ve ikincil yapı tahmini yazılımı kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yüksek verim SHAPE kullanarak RNA İkincil Yapısı Tahmin
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Biyolojik süreçlerinde RNA işlevini anlama RNA yapısı ayrıntılı bir bilgi gerektirir. Bu sonuna doğru, dublaj metodoloji, veya SHAPE "astar uzantısı ile analiz yüksek verimli seçici 2 'hidroksil asilleme", tek nükleotid çözünürlükte RNA ikincil yapı tahmini sağlar. Bu yaklaşım, tercihen sulu çözelti içinde RNA tek sarmallı ya da esnek bölgeler asil ile kimyasal tarama maddeler kullanır. Bir kimyasal modifikasyon Yer modifiye RNA ters transkripsiyon ile tespit edilir ve bu reaksiyonun ürünleri, otomatik kapiler elektroforez (CE) ile fraksiyone edilmiştir. Ters transkriptaz ŞEKİL reaktifleri ile değiştirilmiş olanlar RNA nükleotid duraklar yana Sonuçta elde edilen cDNA kütüphanesi dolaylı olarak tek kapandı RNA bağlamında mahsur bu ribonükleotidler eşler. ShapeFinder yazılımı kullanarak, otomatik CE tarafından üretilen electropherograms işlenmiş ve nu dönüştürülürcleotide tepkime tablolar kendilerini RNAStructure (v5.3) tahmini algoritması kullanılan sözde enerji kısıtlamaları dönüştürülür. Siliko RNA ikincil yapı tahmininde ile sondalama SHAPE birleştirerek elde edilen iki boyutlu RNA yapıları tek başına her iki yöntemi kullanarak elde edilen yapılara göre çok daha doğru olduğu tespit edilmiştir.
Giriş
Yapıştırma, çeviri, virüs çoğaltma ve kanser düzenlenmesinde yer alan katalitik olmayan kodlama RNA'lar işlevlerini anlamak için, RNA yapısının detaylı bilgi 1,2 gereklidir. Ne yazık ki, RNA katlama doğru tahmin müthiş bir meydan okuma sunuyor. Klasik tarama maddeler muzdarip toksisite, eksik nükleotid kapsamı ve / veya deney başına 100-150 nükleotidleri ile sınırlı verim gibi birçok dezavantajları. Çıplak ikincil yapı tahmini algoritmaları benzer, dezavantajlı etkili enerjik benzer yapıları arasında ayırt etmek için kendi yetersizlik kaynaklanan yanlışlıklar nedeniyle vardır. Özellikle büyük RNA'lar, aynı zamanda X-ışını kristalografisi ve şekilse....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
RNA 3 'ucu Primer tasarımı ve uzatma
Yüksek verimli şekli ile uzun RNA'lar analiz etmek için, primer hibritleşme sitelerinin bir dizi de (i) ve (ii) (iii) / RNA 20-30 nt uzunluğunda, ve, ~ 300 nt ile ayrılmış olduğu şekilde seçilmelidir Bu siteler DNA tavlanmasıyla üretilmiştir DNA hibridi> 50 ° C arasında bir erime sıcaklığına sahiptir beklenen Böyle bir tespit çoğu zaman kullanılamaz RNA yapının bazı önceden bilme gerektirir bulunmasına rağmen Buna ek olarak, son derece yapılandırılmış olması için tahmin edilmektedir RNA segmentleri kaçınılmalıdır. Bu siteler hibridize DNA primerleri sonra stabil dimer ya da intrastrand ikincil yap....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
RNA mevcudiyetinde, HIV-1 devir tepki elemanı (RRE) ve bir 3 'terminal yapısı kaseti 4 bunun 37' de ısıtma, soğutma ve inkübasyon tarafından katlanmış ve bundan sonra in vitro transkripsiyon ve doğrusallaştırılmış bir plasmidden elde edilmiştir ° C ihtiva eden MgCl2. RNA NMIA maruz bırakıldı ve daha sonra 3 'terminal yapısı kaseti hibridize bir 5'-uç-etiketli DNA primeri transkripsiyonu ters. Sonuçta ortaya çıkan şekil cDNA kütüphanesi, bir araya kontrolü ve sekans.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada yüksek verimli SHAPE için ayrıntılı bir protokol, her boyutta RNA'lar için tek nükleotid çözünürlük sekonder yapı tayini sağlayan bir teknik size sunmak. Ayrıca, ikincil yapı tahmini algoritmaları ile deneysel SHAPE veri bağlantısı tek başına ya yöntemiyle mümkün olandan daha yüksek doğruluk derecesi ile RNA 2D modellerin üretimi kolaylaştırır. Floresan-etiketli primerlerin ve otomatik CE kombinasyonu tek bir deneyde uzun RNA sekanslarının, çözünürlük kolaylaştırmak geleneksel jel bazlı ŞEKİL göre önemli avan.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
S. Lusvarghi, J. Sztuba-Solinska, KJ Purzycka, JW Rausch ve SFJ Le Grice Ulusal Kanser Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri, ABD İntramural Araştırma Programı tarafından desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| N-metilisatoik anhidrit (NMIA) | Yaşam teknolojileri | M25 | Susuz DMSO |
| 1-metil-t-nitroisatoik anhidrit (1M7) | bkz. ref. 22 | ||
| Üst simge III Ters Transkriptaz | Yaşam teknolojileri | 18080044 | 10.000 adet |
| Termo sekelaz döngüsü dizileme kiti | Affymetrix | 78500 | |
| Kullanıcı tarafından sağlanan malzemeler | |||
| >İlgilenilen | reaksiyon başına 6 pmol (tespit limiti cihaz tarafından belirlenecektir) | ||
| Dört adet 5' etiketli primer seti (Cy5, Cy5.5, WellRed D2 ve WellRed D1/Licor IR800) | Primerler RNA'yı tamamlayıcı niteliktedir ve ters transkripsiyon ve dizileme reaksiyonlarında kullanılır. Listelenen floroforlar Beckman Coulter 8000 CEQ için idealdir. Primerler evde satın alınabilir veya sentezlenebilir. | ||
| DNA şablonu | DNA, reaksiyonları sıralamak için kullanılır ve incelenen RNA'nın dizisini içermelidir - varsa herhangi bir 3'terminal uzantısı dahil. Uygulanabilir olduğunda, RNA transkripsiyon şablonunu kullanmak genellikle uygundur. | ||
| Buffers | |||
| >10x RNA renatürasyon tamponu | 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M KCl, 1 mM EDTA | ||
| 5X RNA katlama tamponu | 200 mM Tris-HCl pH 8.0, 25 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 650 mM KCl. (Bu tampon duruma bağlı olarak değiştirilebilir (örn. pH, EDTA, Mg, RNaz inhibitörü | ||
| 2.5X RT karışımı | 4 & mu; l 5X tampon, 1 & mu; l 100 mM DTT, 1.5 & mu; l su,1 & mu; l 10 mM dNTP'ler, 0.5 & mu; l Üst Simge III. 5X tampon belleği ve 100 mM DTT'nin SuperScript III (Invitrogen) satın alındığında sağlandığını unutmayın. | ||
| GenomeLab Örnek Yükleme Çözümü (Beckman Coulter) | Dikkat: Birden fazla donma-çözülme döngüsünden | ||
| EQUIPMENT | |||
| Kapiler elektroforez | Beckman | CEQ8000 | |
| Thermocycler | değişir | ||
Kaynaklar
- Scott, W. G., Martick, M., Chi, Y. I. Structure and function of regulatory RNA elements: ribozymes that regulate gene expression. Biochim. Biophys. Acta. 1789, 634-641 (2009).
- Moore, P. B., Steitz, T. A. The roles of RNA in the synthesis of protein. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
