Yöntem makalesi

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

DOI:

10.3791/50273

⸱

3 Nisan 2013

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin , 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Medical College of Wisconsin

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteinlerin lokalizasyonu ve dağıtım onların hücresel fonksiyonları anlamak için önemli bilgiler sağlar. Elektron mikroskobu üstün çözünürlük uzaysal (EM), belirli bir antijen aşağıdaki immünohistokimya hücre içi lokalizasyonu belirlemek için kullanılabilir. Sürdürmek antijenite EM araştırmalarda özellikle zor olmuştur süre yapısal bütünlüğünü koruyarak merkezi sinir sistemi (MSS), dokular için. Burada, çalışma MSS yapılar ve antijenleri korumak ve sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronlarda sinaptik proteinleri karakterize etmek için kullanılan bir yöntemle kabul.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunoelectron mikroskopi Subselüler düzeyde biyolojik moleküllerin okumak için güçlü bir araçtır. Gibi kolloidal altın gibi elektron-yoğun işaretleri birleştiğinde antikorlar çeşitli dokularda 1 spesifik antijenlerin lokalizasyonu ve dağılımı ortaya çıkarabilir. İki en yaygın olarak kullanılan teknikler öncesi ve sonrası gömme gömme teknikleri vardır. Ön gömme İmmünogold-elektron mikroskobu (EM) teknikleri, doku içine gömülü önce antikor penetrasyonu izin permeabilize gerekir. Bu teknikler yapılar fakat antikorun kötü penetrasyon (genellikle sadece ilk birkaç mikrometre) bir önemli dezavantajı, 2 'dir korumak için idealdir. Antijenleri daha kolay erişilebilir yerlerde etiketleme sabit dokuların bölümlerinde yer alır, çünkü post-gömme etiketleme yöntemleri bu sorunu önleyebilirsiniz. Yıllar boyunca, bir sayı değiştirme immunoreaktivitesi geliştirmek ve ultrastrüktürel korumak için post-gömme yöntemleri geliştirdik Doku fiksasyonu EM çalışmalarının önemli bir parçasıdır. Fiksatifler kimyasal yerinde dokuları kilitlemek için makromoleküller çapraz bağlar. Sabitleştirici seçimi yapısal koruma, aynı zamanda antijenite ve kontrast sadece etkiler. Osmium tetroksit (Oso 4), formaldehid ve glutaraldehid merkezi sinir sistemi (MSS) fiziksel ve kimyasal işleme sırasında yapısal hasar özellikle yatkındır dokular dahil olmak üzere, yıllardır standart fiksatif olmuştur. Ne yazık ki, 4 Oso yüksek bir reaktiviteye sahip olduğu ve zayıf ve yetersiz etiketleme ile sonuçlanan, antijenler 6 maskelemek için gösterilmiştir. Kimyasal sabitleme önlemek için alternatif yaklaşımlar dokuların donma içerir. Ancak bu teknikleri pahalı enstrümantasyon gerçekleştirmek ve ihtiyaç zordur. Bu sorunların bazıları ele almak ve CNS doku etiketleme, Phend ark geliştirmek. uranil asetat (UA) ve tannik aci ile Oso 4 değiştirilird (TA) ve başarıyla antijen saptama ve beyin ve omurilik dokularının 7 yapısal koruma duyarlılığı artırmak için ek modifikasyon tanıttı. Biz sıçan beyin dokusu için bu osmiyum-ücretsiz post-gömme yöntemi benimsemiş ve sinaptik proteinleri tespit etmek ve incelemek için İmmünogold etiketleme tekniği optimize ettik.

Biz burada sıçan hipokampal CA1 piramidal nöronları sinaptik proteinlerin ultrastrüktürel lokalizasyonu belirlemek için bir yöntem mevcut. Biz organotipik hipokampal kültürlü dilim kullanabilirsiniz. Bu dilimler hipokampusun trisynaptic devresi korumak ve dolayısıyla sinaptik plastisite çalışmak için özellikle yararlıdır, bir çok mekanizma öğrenme ve hafıza rol oynadığı düşünülmektedir. Doğum sonrası 5 ve 6 fare / sıçan yavrular Organik tip hipokampal dilimleri 8 önceden tarif edildiği gibi hazırlanmış, ve akut devirme veya overexpress ekzojen proteinler için özellikle kullanışlı olduğu saptanmıştır. Biz daha önce ch için bu protokolü kullandıkneurogranin (Ng), sinaptik fonksiyon 8,9 düzenlenmesinde kritik bir role sahip bir nöron-spesifik protein aracterize. Biz de kalmodulin (CaM) ve Ca 2 + / CaM-bağımlı protein kinaz II (CaMKII) 10 ultrastrüktürel lokalizasyonu karakterize etmek için kullanmıştır. Sonuç olarak gösterildiği gibi, bu protokol dendritik omurga ve omurga 8 dağıtım karakterize yardımcı olmak için Ng etkili etiketleme iyi bir ince yapı koruma sağlar. Ayrıca, burada açıklanan işlemden nöronal fonksiyonları içinde yer alan birçok diğer proteinler okuyan geniş uygulanabilirliği olabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tespit

Fiksatifler kanserojen vardır; eldiven giyin ve bir davlumbaz fiksatif anlaştım. Aksi belirtilmediği sürece, bütün inkübasyonlar, buz üzerinde gerçekleştirilir ve bütün çözümler kullanımdan önce filtre edilmelidir. Elektron mikroskobu dereceli reaktifleri kullanın.

1. Gün

  1. Sonra deneysel koşullar (örneğin, viral enjeksiyon, ilaç tedavisi) içinde organotipik hippokampal dilimler ile zar yerleştirin, bir 60 x buz gibi soğuk 0.1 M fosfat tampon maddesi (Sorensen en fosfat tamponu), pH 7.3 içeren 15 mm polistiren Petri kabı. 1 Ekle - doğrudan dilimleri üstünde 0.1 M fosfat tampon 2 ml onları soğuk tutmak için.

KRİTİK ADIM: Her zaman taze hazırlanmış tamponlar ve fiksatif kullanın. Tampon pH istenilen aralıkta olduğundan emin olun. Bunu yapmak için bir başarısızlık hücresel yapılar zarar verebilir.

  1. Dilim CA1 disiplinidir yalıtmak için, kullanmakyavaşça CA1 hücre tabakası (Şekil 1) paralel DG yanında dilim boyunca kesmek için tek neşter. Sonra dikey CA3 disiplinidir ve subiculum kaldırmak için kalan dilim kesti. Doku üst yüzeyine tanımlamak için dilim bir köşe kesin.

NOT: ilgi protein hiçbir viral teslimat gerekli durumda ortam buz tampon durulayın hafif ile kaldırıldıktan sonra, tüm doku dilim sabit olabilir. Bu, daha sonra CA1 kesmek tarafından takip edilir.

KRİTİK ADIM: sonra ızgaralar düzgün kesit için sırayla doku topside takip edin.

  1. Dikkatle neşter arkasına kullanarak membrandan doku kaldırmak. Yavaşça 0.1 M fosfat tamponu ihtiva eden bir 12-kuyucuklu plakaya doku aktarmak için bir Pasteur pipeti kullanarak.
  2. Plaka kuyudaki tampon çıkarın ve ekleyin 500 & mu; l - 1 aşağıdaki gibidir buz fiksatif ml (pH 7.3):% 0.1 pikrik asit,% 1 paraformaldehid, 0.1 M fosfat tamponlu% 2.5 lik glutaraldehit. 4 de 2 saat inkübe ° C.

NOT: Pikrik asit Kuru iken patlayıcı olabilir. Ağzı kapalı bir kapta su ile ıslatılmış tutun. Kuru ve iyi havalandırılan bir yerde saklayın.

  1. Kuyudan fiksatif çıkarın ve 0,1 M fosfat tamponunda örnekleri 3 kez (20 dakika her) yıkayın.
  2. 0.1 M maleat tampon, pH 6.0 'de% 1 tannik asit (w / v)' de 40 dakika süreyle inkübe edin.
  3. Maleat tamponu (20 dk her) iki kez durulayın.
  4. Karanlıkta maleat tampon içinde% 1 uranil asetat (w / v) 'de 40 dakika süreyle inkübe edin. Uranil asetat ışığa duyarlıdır ve radyoaktif. Erime sırasında Parafilm ile beher kaplayın ve 4 ° C'de karanlıkta kullanılmamış tampon depolamak
  5. Maleat tamponu (20 dk her) iki kez durulayın.
  6. % 0.5 platin klor içinde 20 dakika inkübemaleat tampon içinde ide (w / v).
  7. Maleat tamponu (20 dk her) iki kez durulayın. 4'te örnekleri Mağaza ° C de daha fazla işlem için hazır olana kadar.

2. Dehidrasyon ve Katıştırma

Propilen oksit kanserojen. Bir davlumbaz içinde çalışarak solumaktan kaçınınız. Su hiçbir iz yoktur mutlak,% 100 saflıkta etanol kullanın. Dehidratasyon için farklı konsantrasyonlarda üretmek için bu mutlak etanol seyreltin.

2. Gün

  1. % 50 etanol içinde 5 dakika için inkübe edin ve daha sonra% 70 etanol içinde 5 dakika için.
  2. % 70 etanol içinde taze hazırlanmış% 1 p-fenilendiamin (PPD), oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
  3. % 70 etanol içinde üç kez yıkayın.
  4. % 80 etanol içinde 5 dakika için ve daha sonra% 95 etanol içinde 5 dakika için inkübe edin.
  5. % 100 etanol içinde iki kere 5 dakika her biri inkübe edin.
  6. Vidalı kapaklı cam şişelerde hazırlayın ve onlar temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun. Cam şişe için dilimler aktarın vebasit ve açık her flakon etiketleyin.
  7. Propilen oksit: 1:1 etanol içinde 5 dakika için inkübe edin.
  8. % 100 propilen oksit içinde iki kere 5 dakika her biri inkübe edin.
  9. Propilen oksit ile 1:1 'lik bir karışım yapmak için her bir şişeye reçine (EPON) ekleyin. Yavaşça 2 saat boyunca karıştırın. Gömme engelliyor olabilir kabarcıklarını engellemek için çok sıkı şişeleri sallamayın.
  10. Propilen oksit, ve 2 saat boyunca karıştırılır, 3:1 karışım yapmak için reçine ekleyin.
  11. 100% reçine aktarın ve inkübe O / N.

3. Gün

  1. 60 Aclar plastik ve 24 saat süre ile tedavi tabakaları arasında sandviç örnekleri ° C.

3. Kesit ve Izgaralar Bağlanış

4. Gün

  1. Yarı ince (0,5 mikron) bölümleri kesip 1% toluidin mavi + örneklerin doğru yönlendirmeyi belirlemek için% 1 boraks ile leke.
  2. Ince kesitler (60 nm) Kes ve nikel ızgaralar, ızgara başına bir bölümüne monte.

4. İmmünohistokimya

Tüm tamponları ve su kullanılmadan önce filtre edilmelidir.

5. Gün

  1. Düz bir yüzeye temiz Parafilm parçası üzerinde% 1 Tween-20/phosphate tampon (T / PB), pH 7.5, bir damla (~ 50 ul) yerleştirin. Yavaşça kenarından temiz forseps ile ızgara pick up ve tampon bölümünde aşağı ve RT 10 dakika inkübe üzerinde yüzer.
  2. Kağıt filtre bölümü tarafı yukarı koyarak ızgara fazla sıvıyı boşaltın ve ardından RT 15 dakika için T / PB 50 mM glisin üzerinde yüzer.

KRİTİK ADIM: kaçınmak için aşırı 'carry-over' bir çözüm damlacığından inkübasyonlar sırasında sonraki çözümleri, yavaşça her çözüm değişim arasında 1. filtre kağıdı üzerine ızgara kenarına dokunarak fazla sıvıyı boşaltın. Ayrıca EM kolları arasında sıkışıp herhangi bir çözüm nazikçe çıkarmaya forseps kolları arasında filtre kağıdı bir şerit ile ıslanma tarafından taşıyıcı tutarak forseps ise ensubölümleri tamamen kurumaya yok çalacak.

  1. Filtre kağıdı ile ızgara kurutun ve daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika için T / PB ikincil antikor hayvan dan% 2.5 BSA ve% 2.5 serum ihtiva eden çözelti engelleme üzerinde yüzer.
  2. 4 ° C'de RT veya O / N birincil antikor (T / PB) ile inkübe En uygun süre, sıcaklık ve inkübasyon yanı sıra antikor konsantrasyonu, deneysel olarak tespit olması gerekir.
  3. Izgara T / PB ile üç kez (2 dakika her) yıkayın.
  4. Oda sıcaklığında 1 saat için ikincil antikor (10 nm altın ile birlikte 01:20 anti-tavşan veya anti-fare) ile inkübe edin.
  5. T / PB ile üç kez (2 dakika her) yıkayın.
  6. 5 dk için T / PB içinde% 2 glutaraldehid ile Postfix'i.
  7. Sonra T / PB ve üç kez (2 dk her) filtrelenmiş su ile üç defa (2 dk her) yıkayın.
  8. 10 dk için su içinde% 2 uranil asetat ile inkübe edin.

Izgara lekelenme iken, placin göre bir CO2 serbest boşluk hazırlamakBir cam Petri kabı merkezinde Parafilm ga parçası. Sonra havada CO2 absorbe Parafilm etrafında çanak NaOH 4-6 pelet yerleştirin. Birkaç dakika için üst kapalı tutun. Pasteur pipeti kullanın ve hızla cam Petri kabındaki Parafilm için Reynold kurşun sitrat çözeltisi küçük bir hacim aktarın. Odasına CO2 yeniden giriş aza indirmek için Pasteur pipeti eklemek için yeterli üst açın.

NOT: Reynold kurşun sitrat çözeltisi yapmak için, mikrodalga fırında deiyonize 100 ml su kaynatın ve hava geçirmez bir kapta soğumaya bırakın. Tıpa ile 50 ml hacminde bir şişede, 1.33 g kurşun karışımı nitrat, 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde sallama ile 1.76 gr sodyum sitrat ve kaynamış su, 30 ml. Daha sonra 30 dakika boyunca aralıklı olarak çalkalanır. Bu bulutlu çözelti için, 1 M sodyum hidroksit 8 ml eklemek ve yavaş yavaş şişeye bir kaç kez ters. Çözüm belli olacak. Haşlanmış wa 50 ml çözüm getirinter. Sızdırmayacak şekilde kapalı çözüm saklayın. Çökelti belirirse, atmak ve yeni bir olun.

  1. Üç küçük bardak sıcak, taze kaynamış deiyonize su hazırlayın. İlk behere ızgara daldırma ve 30 saniye süreyle etrafında yavaşça girdap tarafından uranil asetat yıkayın. Diğer iki bardak bu adımı yineleyin.
  2. Reynold kurşun sitrat çözeltisi damla ızgara yerleştirmek için yeterli Cam Petri kabı üst açın. Mümkünse kurşun sitrat üzerine nefes önlemek ve çökelti oluşumunu önlemek için bunu yaparken, bir maske. 10 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Izgara kaldırmak için yeterli üst açın. Kurşun sitrat üzerine solumaktan kaçının. Sıcak, taze kaynamış damıtılmış su ile üç bardak sırayla batırarak ızgara üç kez yıkayın. Filtre kağıdı, bölüm kadar bir parça ızgara kurumasını bekleyin. Örnek şimdi elektron mikroskobu için hazır hale gelir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2B CA1 piramidal hipokampal nöronlar dendritik omurga endojen Ng moleküllerinin dağılım bir örneğini göstermektedir. Hipokampusun CA1 bölgesinde (Şekil 2A'da görüldüğü gibi) içeren ultra-ince (60 nm) dokuları ile Nikel ızgaraları% 1 içinde kapalı sonra anti ile inkübasyondan önce% 2.5 BSA ve% 2.5 serum ile bloke edilmiş T / PB, 50 mM glisin, -Ng antikor. T / PB ile yıkandıktan sonra, ızgaralar sonra 10 nm altın birleştiğinde anti-tavşan sekonder antikor kaplıydı. Son olarak, ızgar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, biz sıçan hipokampal dilim kültürlerde dendritik dikenler okumak beyin ve omurilik dokularının için Phend ve Weinberg yöntemi benimsemiştir. Hipokampal CA3-CA1 bölgesinde dendritik dikenler nöronal fonksiyonları düzenleyen önemli roller oynamaktadır proteinlerin geniş bir çeşitlilik içeren hassas yapılarıdır. Sunulan yöntem makul etiketleme verimliliği ve omurga içindeki spesifik antijenlerin dağılımı karakterize için yararlıdır iyi tekrarlanabilirlik izin, iyi ultrastrüktürel korunması (Şekil 2A)

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz ifşa etmek başka bir şey var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hipokampal dilim kültürlerin hazırlanması için Matthew Floransa teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, ABD Ulusal Yaşlanma Enstitüsü ve NZG Alzheimer Derneği bağışları ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
60 x 15 mm polistiren Petri kabıFalcon351007
Tek kullanımlık neşterEXELINT29552
Hücre kültürü ekleriMilliporePICM03050
10 nm Keçi anti-tavşan altınElektron Mikroskobu Bilimleri25108
Anti-Nörogranin antikoruMilliporeAB5620
100% Pikrik asitElektron Mikroskobu Bilimleri19550
%96 ParaformaldehitAkros OrganiklerAC41678-0030
%25 Glutaraldehit (EM sınıfı)SigmaG5882
Uranil asetatElektron Mikroskobu Bilimleri22400
p-FenilendiaminSigmaP6001
Platin (IV) klorürSigma379840
Tanik asit ElektronMikroskobu Bilimleri21710

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
  2. Stirling, J. W. Immuno- and affinity probes for electron microscopy: a review of labeling and preparation techniques. J. Histochem. Cytochem. 38, 145-157 (1990).
  3. Phend, K. D., Weinberg, R. J., Rustioni, A. Techniques to optimize post-embedding single and double staining for amino acid neurotransmitters. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 40, 1011-1020 (1992).
  4. Berryman, M. A. Effects of tannic acid on antigenicity and membrane contrast in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 40, 845-857 (1992).
  5. Akagi, T., et al. Improved methods for ultracryotomy of CNS tissue for ultrastructural and immunogold analyses. J. Neurosci. Methods. 153, 276-282 (2006).
  6. Stirling, J. W. Ultrastructual localization of lysozyme in human colon eosinophils using the protein A-gold technique: effects of processing on probe distribution. J. Histochem. Cytochem. 37, 709-714 (1989).
  7. Phend, K. D., Rustioni, A., Weinberg, R. J. An osmium-free method of epon embedment that preserves both ultrastructure and antigenicity for post-embedding immunocytochemistry. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 43, 283-292 (1995).
  8. Zhong, L., Cherry, T., Bies, C. E., Florence, M. A., Gerges, N. Z. Neurogranin enhances synaptic strength through its interaction with calmodulin. Embo J. 28, 3027-3039 (2009).
  9. Zhong, L., Kaleka, K. S., Gerges, N. Z. Neurogranin phosphorylation fine-tunes long-term potentiation. Eur. J. Neurosci. 33, 244-250 (2011).
  10. Zhong, L., Gerges, N. Z. Neurogranin targets calmodulin and lowers the threshold for the induction of long-term potentiation. PloS one. 7, e41275(2012).
  11. Horisberger, M., Vauthey, M. Labelling of colloidal gold with protein. A quantitative study using beta-lactoglobulin. Histochemistry. 80, 13-18 (1984).
  12. Bendayan, M. A review of the potential and versatility of colloidal gold cytochemical labeling for molecular morphology. Biotech. Histochem. 75, 203-242 (2000).
  13. Racz, B., Weinberg, R. J. Spatial organization of coflin in dendritic spines. J. Neuroscience. 138 (2), 447-456 (2006).
  14. Posthuma, G., Slot, J. W., Geuze, H. J. Usefulness of the immunogold technique in quantitation of a soluble protein in ultra-thin sections. J. Histochem. Cytochem. 35, 405-410 (1987).
  15. Howell, K. E., Reuter-Carlson, U., Devaney, E., Luzio, J. P., Fuller, S. D. One antigen, one gold? A quantitative analysis of immunogold labeling of plasma membrane 5'-nucleotidase in frozen thin sections. Eur. J. Cell Biol. 44, 318-327 Forthcoming.
  16. Yokota, E., Kawaguchi, T., Kusaba, T., Niho, Y. [Immunologic analysis of families with complement receptor deficiency]. Nihon. Rinsho. 46, 2040-2045 (1988).
  17. Kehle, T., Herzog, V. Interactions between protein-gold complexes and cell surfaces: a method for precise quantitation. Eur. J. Cell Biol. 45, 80-87 (1987).
  18. Bozzola, J. R., Lonnie, Ch. 2. Electron Microscopy. 30, Second Edition, Jones and Bartlett Publishers. (1992).
  19. Cho, K. O., Hunt, C. A., Kennedy, M. B. The rat brain postsynaptic density fraction contains a homolog of the Drosophila discs-large tumor suppressor protein. Neuron. 9, 929-942 (1992).
  20. Hunt, C. A., Schenker, L. J., Kennedy, M. B. PSD-95 is associated with the postsynaptic density and not with the presynaptic membrane at forebrain synapses. J. Neurosci. 16, 1380-1388 (1996).
  21. Gispen, W. H., Leunissen, J. L., Oestreicher, A. B., Verkleij, A. J., Zwiers, H. Presynaptic localization of B-50 phosphoprotein: the (ACTH)-sensitive protein kinase substrate involved in rat brain polyphosphoinositide metabolism. Brain Research. 328, 381-385 (1985).
  22. Biewenga, J. E., Schrama, L. H., Gispen, W. H. Presynaptic phosphoprotein B-50/GAP-43 in neuronal and synaptic plasticity. Acta Biochim. Pol. 43, 327-338 (1996).
  23. Maunsbach, A. A., Bjorn, Ch. 16. Biomedical Electron Microscopy Illustrated Methods and Interpretations. , Academic Press. 383-426 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

G mme Sonras TeknikElektron MikroskobisiDoku FiksasyonuUranil AsetatTannik AsitOrganotipik KesitlerDendritik Dikenler

İlgili makaleler