Bu yüksek verimli robot transfections ve bir ev yapımı çift ışıma lusiferaz deneyi kullanılarak transkripsiyon düzenleyiciler belirlenmesi için hızlı ve ucuz bir tarama yöntemi sunulmaktadır. Bu protokol, hızlı bir şekilde binlerce gen için doğrudan yan yana fonksiyonel veriler üreten ve ilgi duyulan herhangi bir geni hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bir ev yapımı Çift kızdırma Lusıferaz Testi kullanarak yüksek verim Fonksiyonel Taraması
Bu makalede
Özet
Özet
Bu alfa-sinüklein, Parkinson hastalığı ile ilişkili bir genin transkripsiyonel düzenleyici belirlemek için hızlı ve ucuz bir yüksek verimli tarama protokol mevcut. 293T hücreleri, bir tek gen başına oyuk mikro biçimde, bir arada lusiferaz haberci plazmidleriyle, bir dizilmiş ORF sentezleme kütüphanesinden plazmid ile transfekte edilir. Ateşböceği lusiferaz aktivitesi, bir iç kontrol yapısı (Renilla lusiferazı yönlendiren bir hCMV promotörü) ekspresyon normalize alfa-sinüklein transkripsiyon, üzerine her bir kütüphane genin etkilerini belirlemek için 48 saat sonra test edilir. Bu protokol, 96 kuyulu formatta aseptik sıvı taşıma yapan bir biyo-güvenlik kabini içinde bulunan bir tezgah üstü robot tarafından kolaylaştırılır. Bizim otomatik transfeksiyon protokol yüksek verimli bir kitaplık üretimi veya lentiviral konjugat olarak eşsiz bir kütüphane plazmidlerin çok sayıda üç transfections gerektiren diğer fonksiyonel eleme protokollere kolayca uyarlanabiliryardımcı plazmidin ortak bir set ile nction. Ayrıca, ucuz ve geçerli bir alternatif sunmak PTC124'ün, EDTA, ve önceki Renilla lusiferaz ölçümü ateş böceği lusiferaz aktivitesini bastırmak için pirofosfat kullanan ticari olarak temin edilebilen, çift lusiferaz reaktifler için. Bu yöntemler kullanılarak, 7670 insan genleri elenir ve alfa-sinüklein 68 regülatörleri belirlenmiştir. Bu protokol, diğer ilgi genleri hedef kolayca değiştirilebilir olduğunu.
Giriş
Temel genetik düzenleyici unsurları ve onlara hareket faktörleri belirlemek için yeteneği çok sayıda biyolojik süreçlerin keşif için esastır. Bununla birlikte, bu spesifik sinir hücresi popülasyonları gibi nadir hücre tiplerinde gen ekspresyonunu düzenleyen faktörlerin tanımlanması, zor olabilir. Burada, alfa-sinüklein (SNCA) 'nin yeni transkripsiyon düzenleyici belirlenmesi için bir protokol mevcut, Parkinson hastalığı ile ilişkili ve substantianigra dopaminerjik nöronların ifade edilen bir gen, orta beyin bölgesini pars compacta. Biz, 293T hücrelerinde alfa-sinüklein ifade yapısızlaştırmak bir yüksek verimli, çift-lusiferaz, in vitro raportör ekran kul....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneysel bir bakış için Şekil 1'e bakınız.
1.. Alpha-Sinükleinin Destekleyici İçeren Reporter Plazmidleri hazırlayın
Alfa-sinüklein geni (Şekil 2) Düzenleyici elemanlar intron 2 3 boyunca yukan NACP (amiloid peptidinin non-A beta bileşen) dinükleotid sekansı tekrar 1,2 yaklaşık 10 kb, kapsar. Biz, bu bölgenin bir kısmını içerir Bizim muhabir yapı. Biz büyüme için gerekli olan 2 özel prosedürler intron içeren plazmidler, aşağıda özetlenen bulundu. Lusiferaz plazmidleri pGL4.10 ve pGL4.75 (Şekil 3), Promega'dan ticari olarak mevcuttur....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Tipik Lusiferaz değerleri, K: R, oranlar ve tek bir yarım plaka için indüksiyon değerleri Şekil 4'te gösterilmiştir iyi H2, bir 32-kat indükleyici olarak isabet not edin.. Aşırı toksisite (örneğin, iyi E3), ya da kötü transfekte edildi kuyuları neden olan genler, hem ateşböceği ve Renilla lusiferazlarm düşük değerler üretmek, ama ortalama bir indüksiyon değer olacaktır. PGL4 omurgası ile etkileşim yoluyla olabilir lusiferaz aktivitesi, non-spesifik indüksiyon neden olan genler, bir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Alfa-sinüklein Lewy 4, bu hastalık için patognomonik olarak hücre içi dahil olanlar bir bileşeni olarak, Parkinson hastalığı (PD) olarak işaret edilmiştir. Çok sayıda genom-geniş dernek çalışmaları sporadik PH 5,6,7 riski ile alfa-sinüklin tek nükleotid polimorfizmleri bağlantılı var. Sporadik PH daha az yaygın olsa da, ailesel PD aynı zamanda çoğaltılması ve alfa-sinüklein mahalinin 9,10,11 arasında triplication olarak, alfa-sinüklin 8 mutasyonların neden olabilir, bir fenome.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Bu çalışma lisanslama BacMamreagents (ABD patent 5731182) elde gayrimaddi tarafından desteklenmiştir.
Teşekkürler
Bu DNA tarama kütüphanesinin hazırlanması için MGH DNA Core John Darga ederiz. Perkin Elmer Christopher Chigas bizim VVallac 1420 luminometrede için çok değerli bir destek sağladı. Steven Ciacco ve Agilent Martin Thomae Bravo robot için destek sağladı. Biz cömertçe dual-kızdırma lusiferaz tahlil protokolü sağlamak için NIH Ron Johnson ve Steve Titus teşekkür ederim.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| QIAQuick PCR Arıtma Kiti | Qiagen | 28106 | |
| PureLink Hızlı Jel Ekstraksiyon Kiti | Invitrogen | K2100-12 | |
| PureLink PCR Mikro Kit | Invitrogen | K310250 | |
| PureLinkHiPure Plazmid Miniprep Kiti | Invitrogen | K2100-03 | |
| PureLinkHiPure Plazmid Maxiprep Kiti | Invitrogen | K2100-07 | |
| Bravo Robot | Agilent-Filtreli | ||
| Robot Pipet Uçları | Agilent | 19477-022 | |
| Filtresiz Robot Pipet Uçları | Agilent | 19477-002 | |
| Şeffaf tabanlı 96 kuyulu Plakalar | Corning | 3610 | |
| Rezervuarlar | Axygen | RES-SW96-HP-SI | |
| Polistiren V Tabanlı 96 Kuyulu Plaka | Greiner | 651101 | |
| Polipropilen V Tabanlı 96 Kuyulu Plaka | Greiner | 651201 | |
| Yapışkan Plaka | CryoStuff | #FS100< | |
| Phusion DNA Polimeraz | New England Biolabs | M0530L | |
| BAC 2002-D6 | Invitrogen | 2002-D6 | |
| Buzağı Bağırsak Alkalin Fosfataz | Roche | 10713023001 | |
| T4 DNA Ligaz | New England Biolabs | M0202L | |
| pGL4.10 | Promega | E6651 | |
| pGL4.74 | Promega | E6931 | |
| ElectroMAX Stbl4 Yetkili Hücreler | İnvitrojen | 11635-018 | |
| Alt Klonlama Verimliliği DH5 & alpha; Fenol | Invitrogen | 18265-017 | |
| DMEM | 31053-028 | ||
| Optifect | Invitrogen | 12579017 | |
| Siprofloksasin | CellGro | 61-277-RF | |
| Tris-Hidroklorür Tozu | Sigma | 93287 | |
| Tris-Baz Toz | Sigma | 93286 | |
| Triton X-100 Saf Sıvı | Fisher | BP151-100 | |
| DTT | Invitrogen | 15508-013 | |
| C & # 8211; nzyme A | Nanolight | 309 | |
| ATP | Sigma | A6419 | |
| Luciferin | Invitrogen | L2912 | |
| h-CTZ | Nanolight | 301 | |
| PTC124 | SelleckBiochemicals | S6003 |
Kaynaklar
- Chiba-Falek, O., Nussbaum, R. L. Effect of allelic variation at the NACP-Rep1 repeat upstream of the α-synuclein gene (SNCA) on transcription in a cell culture luciferase reporter system. Hum. Mol. Genet. 10 (26), 3101-3109 (2001).
- Chiba-Falek, O., Touchman, J. W., Nussbaum, R. L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
