Yöntem makalesi

Bireysel piramidal nöronlar High Fidelity optogenetic Kontrolü için Bir Yöntem In vivo

DOI:

10.3791/50291

⸱

2 Eylül 2013

 ,  , 
1Institute for Behavioral Genetics, University of Colorado Boulder, 2Department of Psychology and Neuroscience, University of Colorado Boulder

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetik ve optik birleştirmek nörobilim araçlarının son gelişmeler, mekansal ve zamansal çözünürlük görülmemiş bir düzeye ile nöral devre faaliyet üzerinde kontrol sağlayan, "optogenetics" olarak adlandırılır. Burada prefrontal korteks ve subicular piramidal nöronların genetik tanımlanmış alt kümelerinin optogenetic manipülasyon ile vivo kayıtta entegre etmek için bir protokol sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optogenetic yöntemler türlerin geniş bir yelpazesinde davranışların çeşitli bir dizi yatan nöral devre aktivitesini ortaya çıkması için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Mikrobiyal orijinli optogenetic araçları (örneğin, channelrhodopsin-2, ChR2) veya sessizlik (örneğin, halorhodopsin, NpHR) davranışsal ilgili zaman dilimi zarfında sinirsel aktivite ingenetically tanımlı hücre tiplerini aktive edebiliyoruz ışığa duyarlı zar proteinlerden oluşur. İlk dorsal subikulum ve sıçan prefrontal korteks prelimbic bölgeye ChR2 ve NpHR transgenlerin adeno-ilişkili virüs aracılı verilmesi için basit bir yaklaşımı göstermektedir. ChR2 ve NpHR genetik olarak hedeflenebilir olduğu için, yüksek zamansal hassasiyetle heterojen doku içinde gömülü nöronlar (yani, piramidal nöronlar) spesifik popülasyonlarının elektriksel aktivitesini kontrol etmek için, bu teknolojinin kullanılmasını tarif eder. Biz burada, donanım, özel yazılım açıklamakvivo hazırlanmasında bir anestezi içinde Transdüksiyona piramidal nöronların eş zamanlı ışık teslimat ve elektrikli kayıt için izin kullanıcı arayüzü ve prosedürler. Bu ışık duyarlı araçları bilgi işlem ve davranışlara farklı hücre tiplerinin nedensel katkılarını tanımlamak için fırsat sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zamansal olarak kesin moda bir sinir devresi içindeki bir hücre tipinin etkinleştirmek veya susturmak için yeteneği nöral devreleri duygu ve biliş altta yatan farklı bilgi türlerini işlemek nasıl anlamak için önemlidir. Bozulmamış sinirsel aktivite üzerinde deney kontrol vermeyen loss-/gain-of-function araçlarını (örneğin, elektrik stimülasyonu, farmakolojik modülasyonu, lezyon) istihdam vardır ya bir zamansal veya mekansal ölçekte, nöronların belirli popülasyonlarının kontrolü için seçici gereklidir. Doğrudan bu teknolojik zorlukları ele, genetik kodlanabilen ışığa duyarlı araçları geliştirme ve uygulama iyi tanımlanmış davranışsal olaylar sırasında select hücre tiplerinin elektriksel aktivitesini kontrol etmek sinirbilimcileri sağladı. Bu ışığa duyarlı proteinlerin bir çok ışık-geçişli katyon kanal channelrhodopsin 2-(CHR2) 1 ve hafif odaklı klorür pompası, halorhodop ile, mikrobiyal kökenligünah yaygın kullanımı (NpHR) 2,3.

Optogenetik önemli bir avantajı, heterojen beyin bölgelerinde genetik hedef spesifik hücre popülasyonlarına yeteneğidir ve tekniği başarılı bir model organizmaların bir dizi (insan olmayan primatlar için omurgasız) 4-6 uygulanmıştır. Birçok optogenetic transgenik hayvanlar olarak üretilir ve 7,8 ticari olarak temin edilebilir, ancak kurulması transjenik soy, yoğun emek gerektirir ve maliyeti engelleyici olabilir edilmiştir. Burada bir rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörü kullanılarak sıçan prelimbic korteks ve dorsal subikulum olarak CaMKIIα promotörün kontrolü altında ChR2 ve NpHR genlerin viral aracılı teslim için bir protokol açıklar. Ön beyin içinde, CaMKIIα ifade glutamaterjik piramidal nöronlar 9 özeldir. AAV yaygın nedeniyle göreceli üretimi ve patojenisite eksikliği kolaylığı, hem de temel araştırma için kullanılan güçlü ve persiBu vektörlerin 10 ile elde edilmiştir stent transgen ifadesi. Ayrıca biz anestezi kafa sabit sıçanlarda eşzamanlı ışık teslim ve kayıt için adımlar ve donanım anahat.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.. Virüs Depolama ve Hazırlama

  1. Kemirgen beyin opsin genleri teslim için çoğaltma-beceriksiz AAV vektörlerin kullanımı Biyogüvenlik Seviye 1 (BSL1) için onaylanmış ve mevcut ABD Hükümeti yayın, Mikrobiyoloji ve Biyomedikal Laboratuvarlarda Biyogüvenlik, belirtildiği gibi uygun koruma ve taşıma prosedürleri gerektirir (Hastalık Kontrolü sitesi için Merkezleri http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm ).
  2. -80 ° C derin dondurucuda bir Sınıf II Biyogüvenlik Kurulu ve mağaza küçük çalışma kısma üreticinin viyalden tekrarlanan donma-çözülme döngüleri, pipet virüs önlemek için.
  3. Önce stereotaktik enjeksiyon için, bir kısım buz üzerinde çözülme ve ardından kısa bir süre tezgah üstü santrifüj ile aşağı dönmesine izin verin.
  4. Yavaş yavaş bir Hamilton şırınga, cam ya da mineral ve silikon yağı bir iğne ile küçük bir miktar dolgu.Emin şırınga varil görünür hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Bir mikropüskürtücü pompa içine şırınga takın ve dikey stereotaksik kol (yani stereotaksik manipülatör) doğrudan pompa takın.
  5. Iğne ucu virüs kısım tüpün dibine değene kadar steryotaksik kolunu indiriniz. Virüs istenen hacmi (1 ul enjeksiyon için 1.5 ul) çekmek için mikroenjektör pompa kontrolörü kullanın.
  6. Virüs ile temas eden tüm malzeme ve yüzeyler klorin çamaşır suyu (% 10) gibi bir dezenfektan ile dekontamine edilmelidir.

2. Cerrahi ve Virüs Enjeksiyon

  1. Bir ketamin ile anestezi hayvan (fare, 125 mg / kg, ip) - ksilazin (rat, 10 mg / kg, ip) kokteyli. Anestezi etkinliğini ölçmek için, bir ayak tutam refleks tepki için kontrol edin ve gerekirse ketamin ek doz verir. Standart aseptik cerrahi yöntemler kullanılarak, bir stereotaksik aparat (David Kopf olarak içine hayvan yerleştirinALETLER).
  2. Küçük cerrahi makas veya neşter ile hayvan kafatası üstüne deri yoluyla bir orta hat kesi olun. Yavaşça bağ dokusu ayrı ve küçük bir kemik kazıyıcı ile kafatasının üst temizleyin.
  3. Hayvanın baş z Bregma ve lambda koordinatları için böyle eşit düzeyde olduğunu doğrulayın. Böyle Stereotaksik Koordinatlarla Rat Beyin (George Paxinos ve Charles Watson, Academic Press, 2007) veya Fare Beyin Stereotaksik Koordinatlar (Keith BJ Franklin ve George Paxinos, Academic Press gibi bir beyin atlas hedef beyin bölgesi için steryotaksik koordinatlarını belirlemek , 2007). Bir cerrahi kalem ile enjeksiyon amaçlanan sitesi işaretleyin.
  4. Dikkatlice ince bir el matkap kullanarak hedef alan üzerinde kafatası ve matkap kafatasının alt ulaştığında durdurun. Ekstra ince forseps bir çift kullanarak, dura açığa çıkarmak için inceltilmiş kemiği kaldırmak.
  5. Hedef üzerinde şırınga iğnesi vardır yerleştirinBir ve dura dokunana kadar iğne düşük ve z koordinat hesaplamak için bu nokta kullanın. Uygun z konumuna ulaşana kadar çok yavaş beyin içine enjeksiyon iğnesi indirin. Bu protokolde, medial prefrontal korteksin prelimbic bölge veya dorsal subikulum bregmaya (-6.0 mm anterior (bregmaya 2.7 mm ön, orta hatta, ve dura den -2.2 mm yanal ± 0.5 mm), yanal 3,0 mm ± orta hat ve dura) den -2.0 mm'lik bir yetişkin Sprague Dawley erkek sıçan (yaklaşık 275 gr) hedeflenmektedir.
  6. 0.1 ul / dk 'lık bir hızda virüs enjekte edilir. Enjeksiyon tamamlandıktan sonra beyin yüzeyine virüsün geri akışını önlemek için bir iğne çekilmeden önce 10 dakika bekleyin.
  7. Cilt mühür ve yaraya uygulamak antibiyotik bağlanmış bir iğne ile bir dikiş dikiş kullanın.
  8. AAV vektörleri ChR2 ve NpHR fonksiyonel ifadenin zamanı ders deneysel tasarım ve viral titreye bağlı olarak değişecektir. Bu deney için, in vivo kayıtları 18-21 gün sonrası enjeksiyon yapılmıştır.

3. Işık Teslimat ve ChR2 veya NpHR-ifade nöronlar vivo Kayıt olarak

  1. Süper yapıştırıcı kullanarak bir cam kapiller tüp (Fisher Scientific) için bir tungsten elektrot (~ 1-1.5 MQ, mikropiliye) takın.
  2. Etanol ile bir modlu optik fiber (200 mikron çaplı karot, Thorlabs) ve temiz lif ucu çıplak ucu açığa bir fiber sıyırma aleti (Thorlabs) kullanın. Çok hafif bir kama şeklindeki elmas bıçakla (Thorlabs) ile fiber ucu puan ve dikkatlice (ince forseps ile örneğin) fazla lif çıkarın. Elyaf skor kolayca klivaj gerekir.
  3. 200 mW tek diyot lazer (çıkış noktası üzerinde PC bağlantısı için fiber FC ucunu www.Lumiphy.com istenen dalga boyu ile). Lazerler ile çalışırken uygun koruyucu gözlük her zaman yıpranmış olduğundan emin olun.
  4. L ölçünbir optik güç ölçer (kullanarak optik fiberin ucunda aser yoğunluk www.Lumiphy.com ). In vivo kayıtları için, 20-100 mW / 2 mm kadar küçük bir ışık şiddeti güvenilir bir nöronal etkinlik, sırasıyla, ChR2 veya NpHR aracılı aktivasyonu veya susturulması uyandırabilir.
  5. Kılcal tüp içine optik fiber yerleştirin. Yaklaşık 500 mikron tungsten elektrot ucu yukarıda lif ucu yerleştirin ve elektrot ve lif düz böylece ucuna yakın birkaç noktada iki kez ince bir dikiş ipliği kravat. Elektrot ucu ve en yakın düğüm arasındaki mesafe hedef bölgeye yerleştirilmesi için yeterince uzun olduğundan emin olun.
  6. Adımda yukarıda 2.1 ve 2.2 'de olduğu gibi hayvan hazırlayın. Optrode (konumlandırma için kafatasında yeni bir temiz küçük bir pencere yapmak için bir kılavuz olarak ilk kraniotomi kullanın www.Lumiphy.com ). D küçük bir kesi yapmakura ince bir iğne ile.
  7. Dikkatli bir mikromanipülatör (Narishige) ile transduse bölgeye pencereden kafatası ve beyin içine optrode indirin. Daha sonra, açık-cevap veren bir hücrenin ortaya çıkıncaya kadar 10-50 um adımlarla yavaşça optrode önceden.
  8. Özel bir yazılım kullanıcı arabirimi (NeuroLux Pro www.Lumiphy.com LabVIEW (National Instruments) yazılı) tek diyot lazer kontrol etmek ve devam eden nöral aktiviteyi görselleştirmek ve kaydetmek için kullanılır. Kaydedilmiş sinyalleri süzülmüş bir Examp-20K (Kation Scientific) amplifikatör bant-pass (0,3-8 kHz), ve dijital tahta (NI USB-6009) için National Instruments analog yakalanır. NeuroLux Pro kullanıcı arabirimi analog girişlerin seçimi ve dijital çıkışa (nöronal ve TTL sinyal için iki kanal seçin) verir. Kullanıcı örnekleme hızını (20 kHz), bazal dönemi (pre-ışık), ve post-ışık dönemi tanımlayabilir. Kullanıcı TTL lazer uyanm tanımlayabilirdarbe genişliği, frekans ve stimülasyon döneminde (frekansı 20 Hz ve stimülasyon süresi 500 msn ise, tanımlanan darbe genişliği ile 10 lazer darbeleri teslim edilir) üzerine. Kullanıcı ayrıca sürekli ışık dağıtımı tercih (örneğin, Şekil 1). Olabilir Tekrarlanan kayıtları için, kullanıcı da darbe trenlerin sayısını ve trenler arasındaki aralığı tanımlamak olabilir. Veri ya da diske kayıt olmadan elde edilebilir.
  9. Kayıt sonra, hayvanlar, ketamin / ksilazin kokteyli ile anestezi uygulanır ve transcardially optrode yerleştirme ve opsin ifadesini doğrulamak amacıyla, fizyolojik tuzlu su ve paraformaldehit (% 4) ile perfüze edildi.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 nöronal aktivitenin aynı anda kayıt için kullanılan ve ışık nabız parametreleri (yani darbe frekansı, darbe genişliği, uyarılması dönemi) kontrol özelleştirilmiş yazılım LabVIEW ortamında geliştirilen (Pro NeuroLux) (National Instruments) bir ekran gösteriyor. Yazılım programı tek diyot lazer üzerinde kontrolü için TTL darbeleri üreten bir dijital veri toplama cihazına bir komut sinyali gönderir. Ayrıca yazılım programı görüntüler ve saklar kaydedildi nöronal aktivite ve teslim TTL sinyaller. Bu sinyaller, tanımlanmış bir örnekleme oranı (örneğin, 20 kHz) de satın alma cihaz üzerinden sayısallaştırılmış. Kaydedilmiş sinyalleri bir ikili dosyada iki boyutlu çift duyarlıklı dizi olarak kaydedilir.

Şekil 2, bir fiber optik bağlanmış bir tungsten elektrot oluşan özel optrode gösterir. Bir fiber optik üçünde ince dikiş ipliği kullanarak elektrot sabitlenmiştirpuan. Gerekirse, süper yapıştırıcı bunları yapıştırmak için kullanılabilir. Ancak elektrot lifin birkaç kez, ışık iletimi tekrar edilebilir, ancak tekrarlanan kullanımı ile parçalanır ve bölünür ve temizlenmiş ya da beyin içine her ekleme ile değiştirilmesi gerekir, çünkü kalıcı elektroda fiber optik sabitleme kaçının.

Gerçek ChR2 ve NpHR ifade ettiğini belirten geliştirilmiş sarı floresan protein Şekil 3 gösteri floresan görüntüleri Sol paneller,. Bu fotoğraflar temsili sıçan dorsal subikulum içinde NpHR ifade (Şekil 3A) ve prelimbic kortekste ChR2 ifade (Şekil 3B) gösterebilir. Viral ifade (örneğin bazı floresan), sol, kıvrımlarının (Şekil 3A gözlendi) dorsal subikulum ve prelimbic korteks çoğunlukla sınırlıydı. Elektrodun (ince parça, ok ucu) ve fiber optik (kalın parça, ok) izleri de gözlenmiştir.

Şekil 4'ün s = "jove_content"> Sol panel ChR2. Şekil 4A, prelimbic sıçan için 10 msn mavi ışık darbeleri ile 20 Hz teslimat tepki olarak ChR2 tetiklenen aksiyon potansiyellerinin bir örnek izidir prelimbic sıçan korteksinde belirli zamansal çapalama uyardığını göstermektedir cortex. Raster arsa (Şekil 4B), altı temsil nöronlarda ChR2 kaynaklı aktivasyonunu gösterir. Kaydedilen tüm nöronlar ile mükemmel doğruluk ışık uyarılmış smaç gösterdi. CHR2 aksine, NpHR hızlı ve geri dönüşlü prelimbic sıçan korteksinin (Şekil 4'ün sağ panel), in vivo aktivitesi kendiliğinden susturulur. Şekil 4C gösteren bir örnek iz olduğunu altında NpHR ifade prelimbic korteks sürekli 532 nm aydınlatma (10 s) CaMKllα organizatörü in vivo spontan tek ünite aktivitesini ortadan kaldırır. Prelimbic piramidal hücre aktivitesinin tam susturulması zaman kilitli 10 sn sürekli ışık teslimat için olduğunu unutmayın. Düşüker raster arsa (Şekil 4D) altı temsilci nöronlarda NpHR kaynaklı sessizleştirilmesini gösterir. Hem in vivo kayıtlar mikrobiyal opsin genlerin AAV aracılı teslim 18-21 gün önce meydana geldiği, yetişkin Sprague-Dawley sıçanlarından elde edilen tipik örnekleridir.

Şekil 5, bir sıçan prelimbic piramidal nöron tekrarlanan ChR2 uyarılması sonucunu göstermektedir. Mavi ışık nabız (10 msn) 5 sn (100 bakliyat toplam) için 20 Hz teslim edildi. Işık uyarılmış çivilenmesi gerilim izleri art arda 2 saat kayıt oturumu (61 tekrarlar toplam) sırasında her 2 dakikada elde edildi. Bu tekrarlayan uyarma protokolünü kullanırken bile, ChR2 ışık teslim yanıt istikrarlı ve sağlam smaç bağlı.

Şekiller 6 ve 7 NpHR kaynaklı fotoindirgeyici ve sıçan subicular nöron aktivitesinin ChR2 odaklı fotoaktivasyon sonuçlarını göstermektedir. Durumda prelimbic kortekste olduğu gibi, NpHR ve ChR2 başardıkışık kaynaklı zamanlı kilitli engellenmesini ve yüksek ölçüde tekrarlanabilirliği ile opsin transdüksiyona subicular nöronların aktivasyonu aracılık eder.

figure-results-1
Şekil 1. Eşzamanlı ışık teslimat ve elektrofizyolojik kayıt için NeuroLux Pro yazılım arayüzü ekran görüntüsü. Resimde iz sürekli 532 nm ışık teslimat 10 saniye yanıt sıçan prelimbic piramidal hücre spontan aktivite NpHR kaynaklı susturulması gösterir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-results-2
Şekil 2. Özel optrode Yüksek güç görüntüsü. Bir fiber optik cam kılcal borunun bir tungsten elektrot bağlı ve dikiş ipliği kullanılarak elektrotuna sabitlenir sokulur. Betw merkez-merkez mesafesieen elektrot ucu ve lif ucu yaklaşık 500 mikron.

figure-results-3
Şekil 3,. Viral ifade ve optrode yerleştirme. (Sol) Fotoğraflar temsilcisi dorsal subikulum içinde NpHR ifade (A) ve prelimbic korteks (B) ChR2 ifade göstermektedir. Her fotoğraf çekildikten konumunu temsil eder (Sağ) şematik. Her fotoğrafta ok ve ok tungsten elektrot konumu ve fiber optik işaret, sırasıyla. ALT: subikulum, DG: dentat girus, PL:. Prelimbic korteks büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-results-4
Şekil 4. ChR2 veya NpHR transdüksiyonlu sıçan prelimb In vivo elektrofizyolojik kayıtlaric cortex. (A) mavi (473 nm) ışık darbeleri (10 msn, mavi bar) 20 Hz teslim yanıt ChR2 tetiklenen aksiyon potansiyelleri Örnek izleme. (B) altı temsilci nöronlarda ChR2 kaynaklı smaç gösteren Raster arsa. Her birim aktivitesi, bir nokta olarak çizilmiştir. (C) sürekli yeşil (532 nm) ışık aydınlatma (10 sn, yeşil bar) sırasında spontan aktivite NpHR kaynaklı baskı örneği iz. (D) altı temsilci nöronlarda NpHR kaynaklı susturulması gösteren Raster arsa. Her birim faaliyet bir nokta olarak çizilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-results-5
Şekil 5,. In vivo sıçan prelimbic piramidal nöron tekrarlayan 20 Hz ChR2 odaklı yükseliyor. (A) ışık uyarılmış çivilenmesi izleri Voltajazaman noktalarında, 0, 30, 60, 90 de elde edilen, kayıtların başlangıcından sonra 120 min. (B) ışık kaynaklı aktivasyonunun 61 tekrar (2 dakika arası test aralığı, 120 dakika toplam) gösteren Raster arsa. Her birim faaliyet bir nokta olarak çizilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-results-6
Şekil 6. NpHR transdüksiyonlu sıçan dorsal subikulum In vivo elektrofizyolojik kayıtlar. (A) NpHR ifade dorsal subikulum 10 sn sürekli 532 nm aydınlatması (yeşil çubuk) spontan aktivitesini ortadan kaldırır gösteren örnek iz. Yukarıdaki iz, iki kaydedilen birimlerinin (B) ortalama dalga şekilleri. Amplitüd eşik iki ayrı nöronlar belirlenmesi için kullanılmıştır. (C) beş tekrarını gösteren Raster arsaBu birimlerin NpHR kaynaklı susturulması s. Her birim aktivitesi, bir nokta olarak çizilmiştir.

figure-results-7
Şekil 7. In vivo sıçan dorsal subicular nöronun tekrarlayan 20 Hz CR2-odaklı yükseliyor. (A) zaman noktaları 0, 30, edinilen spike ışık uyarılmış izleri Voltaja 60, 90, 120 dakikalık kayıtların sonra gerçekleşebilir. Ankastre: Bu hücrenin tipik patlama aktivitesi. (B) ışık kaynaklı aktivasyonunun 61 tekrar (2 dakika arası test aralığı, 120 dakika toplam) gösteren Raster arsa. Her birim faaliyet bir nokta olarak çizilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekniklerinin geniş bir dizi kemirgenler farklı beyin bölgelerine mikrobiyal opsin genleri genetik hedefleme için kullanılabilir. Viral gen verici hücre tipi spesifikliği olan ChR2 ve NpHR ifade aracılık için nispeten ucuz ve hızlı bir yaklaşım sağlar. AAV vektör sistemleri depolama, patojenli eksikliğine ve uzun vadeli gen ifadesini 10 üretme kabiliyetini esnasında stabil, yüksek üretim titreleri nedeniyle optogenetic deneylerde kullanılmak için ortak bir seçimdir. Hücre tipi özel promotörler ile opsin yapıları çoğu, Pennsylvania Üniversitesi (bir vektör çekirdek tesislerinden AAV serotiplerinin çeşitli ticari olarak temin edilebilir http://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore ) ya da üniversite Chapel Hill Kuzey Carolina ( http://genetherapy.unc.edu ). AAV teknolojiye bir dezavantajıhücre-spesifik hedefleme için kullanılabilir transgen kaset büyüklüğüne bir kısıtlama yerleştirir sınırlı paketleme kapasitesi (~ 4.7 kb). Bir alternatif olarak, daha büyük bir ambalajlama kapasitesi lentiviral vektörler, daha büyük bir promoter dizilerinin kontrolü altında hedef opsin karşılamak mümkün bulunmaktadır.

Bir optrode kullanımı geçici olarak hassas ışık teslimat ile kombinasyon halinde elektrofizyolojik sinyallerin güvenilir bir tespiti sağlar. Yukarıda tarif edildiği gibi, ancak, yeterli bakım yapısında gereklidir. Bölünmüş optik fiber kırılgan olduğu için, çok sıkı dikiş ipliği bağlama elyaf kırılmasına neden olabilir. Verilen ışık elektrot ve kalite empedans düşer, çünkü optrode tekrar kayıt için kullanılabilir olsa da, elektrot ve optik fiber ekleme işleminden önce temizlenir (veya el optik fiber çıplak ucunun durumunda klivaj) olmalıdır tekrarlanan kullanımı ile.

Ele sırasındactrophysiological kayıtları bu optrode yavaş yavaş gelişmiş olması önemlidir. Burada kullanılan optrode yaklaşık 350 um kalınlığa sahiptir (tungsten elektrod: 125 um, optik elyafın çekirdek: 200 um) ve hızlı düşürülmesi beyin dokusu hareketine neden olabilir. Işık kaynaklı eserler de özellikle kayıt ve ışık dağıtım set-up 11-12 ile düşünülebilir. Bizim deneysel durumda ışık kaynaklı objeyi bulundu, ancak, transduse beyin alanının dışında kayıtları potansiyel açık eserler için bir kontrol olarak kullanılabilir. Kayıt işlemi sırasında başka bir husus, özellikle uzun süreli kayıtlar için, ChR2 veya NpHR ifade nöronlar değişikliklerin gözlenmesi için gerekli ışık yoğunluğudur. Güçlü lazer yoğunluğu ve uzun lazer aydınlatma doku hasarı ve / veya sonraki teslim ışık 12-13 azalan bir cevap neden olabilir. Davranışsal deney için bir kontrol viral vektörün kullanımı atılmaya için gereklidirg elyaftan teslim ısı nedeniyle herhangi bir etki. Ticari olarak temin edilebilen optogenetic yapıları çoğu için opsin gen sekansı kaldırıldı birbirini tamamlayan kontrol yapıları vardır.

Bu ChR2 bazı deneysel sorular 14-15 için daha uygun olabilir, diğer susturma opsins birlikte geliştirilmiştir geliştirilmiş özellikleri ve kinetik değişkenler ile tasarlanmış olduğu dikkate alınmalıdır. Örneğin, hedeflenen mutagenesissin yoluyla kurulan yeni bir ChR2 varyant, "Cheta", orijinal ChR2 14 yukarıda (en az 200 Hz kadar) frekanslarda yüksek sadakat nöronal smaç sürebilirim adlandırılır.

In vivo ışık teslimat ve nöronal tepkilerin eş zamanlı kayıt kombinasyonu genetik hedefli hücre popülasyonları ve ilgili zaman kilitli davranışsal olaylar desenli aktivite arasındaki nedensel ilişkileri kurulması önemli bir adımdır. Prosedürler ve haBurada özetlenen rdware, kemirgenlerde in vivo baş sabit kayıtları için optogenetics uygulanması için basit bir yaklaşım sağlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Uyuşturucu (NIDA) hibe R01 DA24040 (DCC), University of Colorado Yenilikçi Tohum Grant (DCC) ve NİDA eğitim hibe T32 DA017637 (MVB) Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Şırınga Hamilton7653-0110 μ l
Çıkarılabilir İğneHamilton7803-0331 ölçer, eğimli uç
Mikroenjektör PompaDünyası Hassas AletlerUMP3
Pompa Kontrol CihazıDünyası Hassas AletlerSYS-MICRO4
Silikon YağıAlfa AesarA12728
Lazer Koruyucu GözlükKentekKMT-4501
Çok Modlu Fiber OptikThorlabsBFL37-200200 & m çaplı çekirdek, 200 &mu için 0.37 NA
Fiber Sıyırma AletiThorlabsT12S21; m çaplı çekirdek çok modlu fiber
Optik Güç ÖlçerLumiphy LLCwww.lumiphy.com
PhotodetectorNewport818-SL/DB
Mavi Lazer (445-473 nm, 100-200 mW)Lumiphy LLCa href="http://www.lumiphy.com" target="_blank">www.lumiphy.com 200 & MU'ya bağlı; FC/PC adaptörlü m çok modlu fiber
Yeşil Lazer (532 nm, 100-200 mW)Lumiphy LLCwww.lumiphy.com200 &mu'ya bağlı; FC / PC adaptörlü m çok modlu fiber
Tungsten / Fiber OptrodeLumiphy LLCwww.lumiphy.comLumitrode
Cam Kılcal BoruFisher Scientific22-362-566
Hidrolik MikromanipülatörNarishigeMO-22
AmplifikatörKatyon BilimselExAmp-20K
Veri Edinme CihazıNational InstrumentsNI USB-6009
Kayıt için Kemirgen Baş DesteğiLumiphy LLCwww.lumiphy.com
Küçük Hayvan Stereotaksik ÜnitesiDavid Kopf InstrumentsModel 963
, <

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  2. Han, X., Boyden, E. S. Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity with single-spike temporal resolution. PLoS One. 2 (3), e299(2007).
  3. Zhang, F., Wang, L. P., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).
  4. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  5. Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450 (7168), 420-424 (2007).
  6. Han, X. Optogenetics in the nonhuman primate. Prog Brain Res. 196, 215-233 (2012).
  7. Zhao, S., Ting, J. T., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  8. Madisen, L., Mao, T., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-activation and silencing. Nat Neurosci. 15 (5), 793-802 (2012).
  9. Benson, D. L., Isackson, P. J., Gall, C. M., Jones, eg Contrasting patterns in the localization of glutamic acid decarboxylase and Ca2+/calmodulin protein kinase gene expression in the rat central nervous system. Neuroscience. 46 (4), 825-849 (1992).
  10. McCown, T. J. Adeno-associated virus (AAV) vectors in the CNS. Curr Gene Ther. 5 (3), 333-338 (2005).
  11. Cardin, J. A., Carlen, M., et al. Targeted optogenetic stimulation and recording of neurons in vivo using cell-type-specific expression of Channelrhodopsin-2. Nat Protoc. 5 (2), 247-254 (2010).
  12. Cardin, J. A. Dissecting local circuits in vivo: Integrated optogenetic and electrophysiology approaches for exploring inhibitory regulation of cortical activity. J Physiol Paris. 106 (3-4), 104-111 (2012).
  13. Tsunematsu, T., Kilduff, T. S., et al. Acute optogenetic silencing of orexin/hypocretin neurons induces slow-wave sleep in mice. J Neurosci. 31 (29), 10529-10539 (2011).
  14. Gunaydin, L. A., Yizhar, O., et al. Ultrafast optogenetic control. Nat Neurosci. 13 (3), 387-392 (2010).
  15. Chow, B. Y., Han, X., et al. High-performance genetically targetable optical neural silencing by light-driven proton pumps. Nature. 463 (7277), 98-102 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kanalrodopsin 2HalorodopsinViral Vekt r letimiStereotaktik EnjeksiyonFiber Optik ElektrotE Zamanl Kay tIn Vivo ElektrofizyolojiI k letimi

İlgili makaleler