Yöntem makalesi

Bir

18.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50332

⸱

12 Haziran 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, University of Heidelberg

Bu makalede

Özet

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay tarif In vitro modeli. Gradyan santrifüj, negatif boncuk izolasyon ve belirli bir hücre kültürü koşulları kullanılarak, monosit türevli histiositlerinden fenotipik ve fonksiyonel çalışmalar için oluşturulabilir.

Özet

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücre tipi temsil etmektedir. Makrofaj biyoloji okuyan fare modellerinde sıçangil ve insan monosit türevli histiositlerinden arasındaki fenotipik ve fonksiyonel farklılıklar muzdarip. Bu nedenle, burada primer insan makrofaj oluşturmak ve okumak için bir in vitro model tarif eder. Kısaca, bir kol damarından çekilerek periferik kan yoğunluk gradyan santrifüj işleminden sonra, monositler negatif manyetik boncuk ayırma kullanılarak periferik kan mononükleer hücreler izole edilmiştir. Bu monositler sonra makrofaj değişimi ya da polarizasyon farklı indüklemek için özel koşullar altında altı gün boyunca kültüre edilmiştir. Model kullanımı kolaydır ve fare ve insan arasında türe özgü farklılıklardan kaynaklanan sorunlar circumvents. Ayrıca, ölümsüzleştirilmiş hücre çizgilerinin kullanımı daha in vivo koşullarda daha yakındır. Sonuç olarak, burada açıklanan model macrophag incelemek için uygun bire biyoloji, hastalık mekanizmaları ve yeni tedavi hedefleri belirlemek. Olsa da tamamen ölüm sonrası elde edilen hayvan veya insan dokularıyla çapraz olmayan değiştirme deneyleri, burada açıklanan model hastalık mekanizmalarını ve çeşitli insan hastalıkları için son derece uygun olabilir terapötik hedeflerin tanımlanması ve doğrulamasını sağlar.

Giriş

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücresel bileşeni temsil etmektedir ve birçok akut veya kronik enflamatuar süreçleri 1 katkıda bulunur. Makrofajlar, ateroskleroz ya da kanser 2 gibi birçok enflamatuar hastalıklarda önemli bir rol oynamaktadır. Makrofajlar plastisite yüksek derecede göstermek ve yerel micromilieu 3 bağlı olarak farklı fenotipleri kabul edebiliyoruz. Böylece, makrofaj farklılaşma ve heterojen okuyan birçok hastalığın patofizyolojisi bilgimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavi hedefleri ve yeni tedavilerin geliştirilmesi tespitine imkan vermek.

Birçok durumda, kemirgen modelleri belirli hastalıkların patofizyolojisi araştırmak için kullanılır. Ancak, fare modelleri ile makrofaj biyoloji okuyan birçok eksiklikleri eşlik ediyor: (1) perip lökosit alt numaraları oranı (yani monosit ve granülosit)fare veya insanların Heral kan önemli ölçüde fare ve insan patofizyolojisinde monositlerin farklı roller düşündüren değişir. (2) sağlık ve hastalık 4 sırasında fonksiyonu önemli farklılıklar öne fare ve insan periferik kan monositler arasında gen önemli farklılıklar vardır. (3) insan duruma fare modellerinde bulguların transferi oldukça zor hale insan miyeloid hücrelerde yok fare monositler ve makrofajlar (F4/80, LYC, vb.) Tanımlamak için kullanılır işaretleri bir dizi.

Bu nedenle, insan hastalıklarında makrofaj farklılaşması ve heterojen anlaşılması artırmak amacıyla, insan makrofaj çalışma modelleri kullanmak gerekir. Dolayısıyla, burada kullanımı kolay ve farklı makrofaj po ile sonuçlanan, çeşitli koşullar altında in vitro olarak insana ait monositlerden türetilmiş makrofaj çalışma sağlar insan birincil makrofaj nesil bir modeli tanımlamaklarization türleri. Çeşitli çalışmalarda, böylece makrofaj biyoloji ve 5-7 insan ateroskleroz için potansiyel alaka analiz etmek için monosit türevli primer insan makrofajlarda in vitro modeli kullandık.

Olsa da tamamen ölüm sonrası elde edilen hayvan veya insan dokularıyla çapraz olmayan değiştirme deneyleri, burada açıklanan model hastalık mekanizmalarını ve çeşitli insan hastalıkları için son derece uygun olabilir terapötik hedeflerin tanımlanması ve doğrulamasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Protokol

  1. Aşağıdaki gibi tamponlar hazırlamak:
    1. Hücre izolasyonu için tampon hazırlayın: "tampon yıkayın" PBS içinde =% 0.02 EDTA (kullanımı 0.5 M EDTA).
    2. Monosit izolasyonu için tamponu hazırlayın: "durulama MACS tamponu" =% 0.5 BSA (250 mg) + 2 mM EDTA (200 ul) + PBS (50 mL) eklenmiştir. Degas tampon.
    3. "FACS tampon" PBS =% 10 FCS ve "sabitleme tampon" PBS =% 1 PFA: hücrelerin FACS boyaması ve depolama tamponu hazırlayın.
  2. Bir kol damardan 30 ml tam kan çizin. Antikoagulan olarak EDTA kullanın.
  3. Aşağıdaki gibi hücre (Histopaque) izole:
    1. Iki steril 50 ml tüpler (no poli-stiren) hazırlayın.
    2. PBS 1.1 ile birlikte, adım 2 kan sulandırmak.
    3. + 25 ml tam kan / PBS tüp başına 25 ml histopaque ekleyin. Histopaque ve kan karışmaz emin olun.
    4. RT, hiçbir fren az 30 dakika 400 x g'de santrifüj.
    5. Plazma ve atın aspire.
    6. Temiz 50 ml küvetin içine opak arayüzü ve pipet aspiree.
    7. PBS içinde% 0,02 EDTA, 20 ml ilave edilir.
    8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de santrifüj
    9. Süpernatant atın.
    10. PBS içinde% 0,02 EDTA, 10 ml ilave edilir.
  4. Şöyle hücreleri hesaplama:
    1. 10 sn için vorteks ile iyice karıştırın.
    2. 200 ul hücre süspansiyonu + 300 ul PBS içinde% 0.02 EDTA + Tripan mavisi (200-500 cells/10 kareler, aksi seyreltme faktörü değiştirmek) 500 ul alın.
  5. Aşağıdaki gibi monosit olumsuz izolasyonu gerçekleştirin:
    1. 10 dakika, 120 x g için adım 3.10 'da elde edilen hücreler santrifüj. Süpernatant atın.
    2. 10 ml PBS +% 0.02 EDTA ve 10 dakika 120 x g'de santrifüj eklenerek hücre pelletini 2x yıkayın.
    3. 1 ml 10X PBS ekleyin, 3 saniye boyunca 9 ml steril su ekleyin.
    4. PBS +% 0.02 EDTA ile bir kez daha yıkanır ve 10 dakika 120 x g'de santrifüj edilir.
    5. Santrifüj sırasında sayın.
    6. 5 x 10 7 / ml 'de EasySep tamponu içinde seyreltilir.
    7. 50 ml / ul monosit zenginleştirme horoz eklekuyruk.
    8. 10 dakika 4 ° C'de inkübe edin
    9. 30 saniye vorteks boncuk.
    10. 50 ul / ml 'boncuk ekleyin.
    11. 5 dakika 4 ° C'de inkübe edin
    12. 2.5 ml'lik bir hacme tamamlamak için EasySep tamponu ile doldurun. Çözüm şimdi kahverengimsi görünür.
    13. Cazibe merkezi haline koymak.
    14. Oda sıcaklığında 2.5 dakika bekleyin. Bu süre boyunca, manyetik boncuk bağlı olmayan monositik hücreler tüp duvarı taşımak ve orada yapışır.
    15. Taze steril tüpe bağlayıcı olmayan monositler ile tampon dökün. Bu çözüm beyazımsı görünüyor.
    16. PBS +% 0.02 EDTA ile bir kez yıkayın ve 10 dakika, 120 x g santrifüj.
  6. 0.5 x 10 6 / cm 2 lik bir yoğunlukta bir plastik çanak ya da çok katlı plaka plaka hücreleri. Kültür ortamı / 1 x 10 6 hücre 1 ml ilave edilir.
  7. 6-14 gün için ilgi çekici koşullar altında kültürü hücreleri.
  8. Taze medya (Ayrıntılar için bakınız Tablo 1) ile medyanın% 50 yerine 3 gün sonra medya değiştirin.
  9. MRNA izolasyon, akım sitometri, Batı blot, vb için altı gün hasat hücreleri sonra.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan protokolü kullanarak, rutin 25.1 x 10 6 ± 2.2 x 10 6 monocytes/100 ml kan (26 bağımsız deneylerden ortalama ± standart hata, Şekil 1A) edinin. CD14 için akış sitometrisi ile boyama ile saptandığı gibi monosit saflık rutin olarak% 95'ten daha fazla (97.1 ± 0.4%, 3 bağımsız deney, Şekil 1B ortalama ± standart hata) 'dir. Tripan mavi boyama ile saptandığı haliyle taze izole edilmiş monositlerin, hücre canlılığını% 95 (veriler gösterilmemişti...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin temel hücre tipini temsil etmektedir. Ateroskleroz veya kanser 2 de dahil olmak üzere, pek çok enflamasyonlu hastalıkların önemli bir rol oynamaktadır. Böylece, makrofaj biyoloji okuyan birçok hastalığın patofizyolojisi üzerinde bilgilerimizi artırmak için gerekli olan ve yeni tedavilerin geliştirilmesi izin vermek.

Birçok çalışma, fare modelleri eksprese uygulamak veya ilgi bazı genlerin eksik. Monosit türevli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması ifşa etmek zorunda değilsiniz.

Teşekkürler

Biz mükemmel teknik yardım için Nadine Wambsganss teşekkür ederim. Bu çalışma CAG İnovasyon Fonu FRONTIER (Heidelberg Üniversitesi) bir hibe ile Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1) bir hibe ile ve kısmen desteklenmiştir

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
50 ml santrifüj tüpü (steril)Fisher055398
D-PBS (1X), sıvı (kalsiyum veya magnezyum içermez)Invitrogen14190-250
EDTASigmaT9285
BSASigmaA-8806
FCSInvitrogen
EasySep İnsan Monosit Zenginleştirme KitiKök Hücre Teknolojileri19059
EasySep MıknatıslıKök Hücre Teknolojileri18000
FACS tüpleriFisher352008
Makrofaj-SFM (1X)İnvitrojen12065-074
Penisilin-streptomisinSigmaP-4458
Nutridoma-SPRoche11011375001
insan M-CSF 10 & mu; gPeprotech300-25
Hücre Kültürü Plakaları 6 kuyuluFisher07-200-80

Kaynaklar

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656(2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668(2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Monosit zolasyonuYo unluk Gradyan Santrif jlemeNegatif Boncuk zolasyonuMakrofaj PolarizasyonuAk SitometrisiKantitatif PCROkside LDL Al mM1 M2 Mark rleriPeriferik Kan Monon kleer H creleri

İlgili makaleler