Ventrikül beyin omurilik sıvısı (BOS) embriyo erken beyin gelişimi sırasında nöroepitelyal ve serebral kortikal progenitör hücreler banyoları. Burada biyolojik işlevini araştırmak amacıyla farklı yaşlardaki kemirgen embriyolardan ventriküler BOS yalıtmak için geliştirilen yöntem açıklanmaktadır. Ayrıca, bizim serebral kortikal eksplant diseksiyonu ve kültür ortamı veya BOS minimum hacimlerde eksplant büyüme sağlar kültürü tekniği göstermek.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dissected Serebral Kortikal Eksplantlarından ile kullanım için Kemirgen Embriyolar arasından Beyin Omurilik Sıvısı İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
BOS gelişimi boyunca ve yetişkinlikte dinamik değişen proteom karmaşık bir sıvıdır. Embriyonik gelişim sırasında, doğmakta olan BOS anterior nöral tüpün kapanması üzerine amniyotik sıvıdan ayırır. BOS hacmini sonra ventriküller ve koroid pleksus oluşturmak BOS astar nöroepitelyal progenitör hücreler olarak izleyen gün boyunca artar. Gelişmekte olan beyin ve omurilik nöral kök hücrelerin embriyonik BOS kişileri apikal, ventriküler yüzeyi. BOS gelişmekte olan beynin genişlemesi için hayati sıvı basıncı sağlar ve zamansal özgü şekilde nöral progenitör hücrelere faktörleri teşvik önemli bir büyüme dağıtır. BOS fonksiyonunu incelemek için, kan veya gelişmekte telencephalic dokudan kirlenme olmadan embriyonik BOS saf örnekleri izole etmek için önemlidir. Burada kullanılabilecek ventriküler embriyonik CSF nispeten saf örnekleri izole etmek için bir yöntem açıklanmaktadırkütle spektrometrisi, protein elektroforezi, ve birincil hücre ve eksplant kültürünü içeren deneysel testler geniş bir yelpazede. Biz medya veya BOS azaltılmış hacimli gelişen kortikal dokusunun büyümesi için gözenekli polikarbonat membran kortikal eksplantlar teşrih ve kültür nasıl gösterilmektedir. Bu yöntem ile, deneyler, hedef hücreler üzerindeki CSF proteom biyolojik aktivitesini incelemek için çeşitli yaşlardan itibaren CSF ya da koşullar kullanılarak gerçekleştirilebilir.
Giriş
BOS gelişmekte nöroepitelyumda 1-6 banyoları ve gelişmekte olan beyinde 8-12 için ipuçları teşvik gerekli basıncı 7 ve büyüme sağlayan karmaşık bir sıvıdır. Beyin gelişimi boyunca BOS incelenmesi, biz geliştirme 6,9 çeşitli aşamalarında sıçan veya fare embriyoları gelişmekte ventriküler BOS yalıtmak için teknikler geliştirildi. Izolasyon Önceki yöntemler cam mikro-iğne kullanarak ve bir mikro-enjektör 1,2 kullanarak BOS izole dahil. Bizim yöntem, ucu gelişmiş doku penetrasyonu için ultra ince noktası oluşturmak için çekilmiş olan bir cam mikro-kapiller pipet kullanır. Ventriküler CSF toplama basınç hafif değişikl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Embriyo İzolasyon / Hazırlık
Bu teknik, fare ya da sıçan için de kullanılabilir. Bu protokolü biz BOS toplama tekniği ve fare embriyonik beyin kortikal eksplant diseksiyonu göstermektedir. Biz sıçanlarda karşı genel teknikler içinde var fareler için herhangi bir önemli farklar hakkında görüş bildirir. Embriyonik yaş evreleme sistemi için, E1 fareler için fiş günü olarak sınıflandırılır ve E0.5 fareler için fiş günü olarak sınıflandırılır.
- Sylgard Silikon Elastomer bir mikro-diseksiyon çanak hazırlayın. Sylgard 184 Silikon Elastomer A ve Bölüm B Kısım A ve Kısım B ağırlıkça veya hacimce 10:1 oranında karıştırılmaktadır iki bi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
BOS koleksiyonu açık, şeffaf sıvı boyun eğmek zorundadır. Aspirasyon ve Eppendorf tüp bir kırmızı veya sarı renklendirilmiş akışkan tarafından gösterildiği gibi, kandan kirlenme hiçbir kanıt olmamalıdır. Ayrıca aspirat ve Eppendorf tüp dokusunun hiçbir kanıt olmamalıdır. BOS santrifüj edildiğinde, bir de herhangi bir kirlenme olduğunu sağlamak için mikroskobik BOS değerlendirir. Kontaminasyon belirtileri varsa, BOS atılmalıdır. Biri E14.5 fare çöp bakıldığında biri 10-15 ul BOS toplama tahmin edebilirsiniz. Tabl.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Ventriküler CSF toplama için açıklanan yönteme hücresel analizler 9 Bir dizi protein kararlı kompozisyon ve etkinlik ile tutarlı embriyonik CSF nispeten saf örnekleri vermiştir. İyi bir toplama tekniği ve on E14.5 fare DKBKS ile, bir BOS 10-15 ul toplamak için bekleyebilirsiniz ve E16 sıçan bir çöp gelen bir BOS 50-90 ul hakkında toplamak için bekleyebilirsiniz. Bu toplama tekniği dikkatli gözlem, santrifüj, ve hücresel enkaz veya kan renklendirmek herhangi bir kanıt ile numunelerin atarak, kan ve doku kaynak.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Teşekkürler
Biz NIH (Ödül numaraları MKL için R00 NS072192, CAW için AS.L. için HD029178 ve 2 RO1 NS032457) destek için müteşekkiriz. MKL Boston Çocuk Hastanesi'nden Kariyer Geliştirme Bursu / Harvard Tıp Okulu Shore Kardeşlik ve Alfred P. Sloan Vakfı Fellow of sahibidir. CAW Howard Hughes Tıp Enstitüsü Araştırmacısı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif / Malzeme Adı | Şirket | Katalog Numarası | Yorumlar |
| Wiretrop II kılcal iğneler | Drummond Bilimsel | # 5-000-2020 | |
| Sylgard | Ellsworth Yapıştırıcılar | # 184 SIL ELAST kiti | |
| Aspiratör tüp montajı | Sigma | # A5177-5EA | |
| Tek filtresi | Venturi veya yerel eczane | mevcut değil | Standart sigara filtresi |
| Roundstock oftalmik bıçağı (15 derece bıçak bıçak) | Dünya Precision Instruments, Inc | # 500250 | |
| 35mm cam dipli kültür çanak | Mattek Corp | # P35G-1.5-14-C | |
| Platin-iridyum tel | TriTech Araştırma | # PT-9010-010-3ft | |
| Nuclepore Parça-Etch Membran | Whatman | # 09-300-57 | |
| Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi | Fisher Scientific | # SH30031.FS | |
| İridektomi Makas | Güzel Bilim Araçları | # 15000-02 |
Kaynaklar
- Dziegielewska, K. M., Evans, C. A., Lai, P. C., Lorscheider, F. L., Malinowska, D. H., Mollgard, K., Saunders, N. R. Proteins in cerebrospinal fluid and plasma of fetal rats during development. Developmental Biology. 83 (1), 193-200 (1981).
- Gato, A., Martin, P., Alonso, M. I., Martin, C., Pulgar, M. A., Moro, J. A.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
