Fonksiyonel Motifler ve Bağlama Ortaklar peptid bazlı Kimlik

Summary

Exosomes HIV-1 Nef salgılanmasını altında yatan mekanizmaları incelemek için teknikler tarif edilmiştir. Nef ve protein transfeksiyon elde edilen özel kısa peptitler yapısı, işlevi, ve Nef en Salgı Değişiklik Bölgesi bağlayıcı ortakları belirlemek için istismar edildi. Bu prosedürler birçok mekanik çalışmalar genel ilgisi var.

Abstract

Bizim örneğimizde, HIV-1 Nef, tam uzunlukta proteinler bulunur motifleri türetilmiş spesifik bir kısa peptitler, bunların biyolojik fonksiyonu muhafaza, aynı zamanda rekabetçi tam uzunluktaki protein fonksiyonunu inhibe değil sadece. 20 Nef tarama peptidler, her biri komşu 10 amino asit uzunluğunda ve üst üste gelen 20 amino asit, bir dizi apoptoz, endüksiyon sorumlu NEF motifleri tanımlamak için kullanıldı. Bu apoptotik motifleri içeren peptidler, tam uzunluktaki Nef proteini ile karşılaştırılabilir düzeyde apoptoza neden olmuştur. Nef en salgılanması Değişiklik Bölgesi (SMR) elde edilen ikinci bir peptid, exosomes yılında Nef en salgı (exNef) dahil hücresel proteinlerle etkileşim yeteneği korudu. Bu SMRwt peptid Nef, en SMR motifi özellikle bağlanan hücresel proteinlerin izole edilmesi için ko-immünopresipitasyon deneylerde "yem" bir protein olarak kullanılmıştır. Protein transfeksiyon ve antikor inhibe fiziksel etkileşimi bahsi bozmak için kullanılanween Nef ve mortalin, izole edilmiş SMR bağlayıcı proteinlerin biri, ve bu etki, bir floresan bazlı exNef salgılama tahlili ile ölçüldü. SMR motifi bağlanan hücresel protein için tam uzunlukta Nef outcompete SMRwt peptid yeteneği, bu exNef salgılanması ilk inhibitörünün etkisi. Bu nedenle, tam uzunlukta proteinler bulunur motifleri türetilmiş spesifik bir kısa peptidlerin eşsiz özelliklerini kullanan burada tarif edilen teknikler kullanılarak, tek bir protein işlevsel motiflerin belirlenmesi ve patojenik fonksiyonları peptit bazlı inhibitörlerinin geliştirilmesi hızlandırabilir.

Introduction

Antiretroviral tedavi ile birlikte, batı dünyasında AIDS salgını yavaşladı, ama kısıtlandığını değil, ve HIV yayılmasını dünya çapında önemli bir sağlık yük olmaya devam edilmiştir. Marjinal etkili RV144 Tay deneme dışında, HIV aşı bugüne kadar enfeksiyondan korumak için başarısızlık göstermiştir. Böylece, ek, potansiyel terapötik hedefler araştırma hala garanti edilir.

CD4 T hücre tükenmesi ile birlikte, kalıcı genel immün aktivasyon HIV enfeksiyonunun bir özelliğidir. Bu Kronik Bağışıklık Aktivasyon (CIA) hücre yenilenmesini, aktif ve ayırt lenfositik alt popülasyonlar, hücresel yorgunluk ve yaşlanma ve Aktivasyon Bağlı Hücre Ölümü (AICD) ^1,2,3 ile T hücreleri ve B hücrelerinin öldürülmesi artar yol açar ve iyi hastalığın ilerlemesi ^{4,5,6,7,8,9,10,11,12} en güçlü belirleyicileri biri olarak kurulmuştur. Bununla birlikte, mekanizma CIA ve CD4 yatanHIV enfeksiyonunda tükenmesi T-hücresi tam olarak aydınlatılmış kalır.

Bizim laboratuvar ve diğerlerinden kanıt HIV protein Nef (Negatif Düzenleme Faktörü) HIV-1 ile infekte hücreleri ^13,14 den exosomes kendi salgı neden neyin hastalığın ilerlemesi için bir model (Şekil 1) götürdü. Bu Nef-içeren exosomes (exNef) enfekte CD4 + T-hücreleri de dahil olmak üzere ^15,16 hücre soylarının bir dizi apoptoza neden olur. Alternatif olarak, monositlerde / makrofajlar exNef değiştiren gen ekspresyonu, örneğin sitokin ifade ve programsız immün aktivasyon bir devlet neden görünüyor. Bu delil vücut CIA ve CD4 T hücre tükenmesi exNef için önemli bir rol göstermektedir.

Exosomal ticareti yolu exNef salgısının mühendislik roman inhibitörleri yararlı olacaktır işlemek için Nef yeteneğini altında yatan mekanizmaların anlaşılması. ExNef salgısının inhibisyonu CD4 + T-hücre deplesyonu düşecektirve CIA sürücü HIV / AIDS patogenezinde bu.

HIV / AIDS hastalığın ilerlemesi ve bu model üzerine inşa sonraki veri için bizim modeli neden kanıt toplamak için, bize exNef salgılanması genetik analiz için izin yeni maddeler ve yöntemler geliştirmiştir ve belirlemek başlar hücresel protein çıkıyor. İlk çalışmada, Nef proteini bekleme hücrelerde apoptozu indükler ve Nef-transfekte edilmiş ve HIV bulaşmış hücrelerden hücre dışında ¹⁵ serbest olduğu bulundu. SDF-1α (alternatif yapıştırma alfa faktörü-1 kaynaklı stromal hücre) türetilen peptitler daha önce çok tam uzunluktaki molekülün ¹⁷ bağlayıcı ve sinyal aktivitesi korudukları gösterilmiştir edilmiştir. Biz Nef peptidler tam protein apoptotik aktivite bazıları ve bu peptidler mutlaka Nef apoptotik alanı (ler) içeren olacağını korumak yönünde söylentiler. Bu peptidlerin tespit ve dolayısıyla Nefapoptotik etki (ler), böylece NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı 20, HIV-1 Nef tarama peptidler bir dizi elde edilmiştir. Bu 20-AA peptitler, komşu 10 amino asit üst üste binen her biri, son amino asidi, yani, N20 açıklıklı Nef, amino asitler 1-20, N30 açıklıklı Nef, amino asitler 11-30, vb ¹⁶ sayısına göre adlandırılır. Bu hücrelerdeki tam uzunluktaki Nef proteini apoptosis, iki ayrı 10-AA etki çakışan peptidlere özgü T-hücrelerinin, hücre dışında açığa bulundu. Bu Nef-apoptotik türetilmiş peptidlerin sonraki analiz fiziksel olarak bu peptidlerin rekabetçi CXCR4 ve doğal ligandı SDF-1α arasındaki bağlanmayı inhibe izin bağlanma kinetiği ile T-hücrelerinin yüzeyi üzerinde kemokin reseptörü CXCR4 ile etkileşme kabiliyeti olduğu ortaya çıkmıştır. Son olarak, CXCR4 ile Nef-apoptotik türetilen peptidleri 'etkileşimi apoptoza yol açan, bu T-hücrelerinde, bir stres yanıtı neden olduğu bulunmuştur. Bu kanıt bize quic izinkıy haritası Nef fonksiyonel etki, bu tür alanin tarama mutagenez gibi standart DNA mutajenik teknikleri kullanılarak çok daha uzun almış bir süreç. Ayrıca, bu kısa bir Nef-türevli peptitler, tam uzunluktaki protein ile apoptotik etki biyolojik fonksiyonu muhafaza ettiğini gösterdi.

Nef, hücre dışı bir rolü tespit ettikten sonra, T-hücrelerinin, yani, apoptoz, böylece Nef hücrelerinden salgılanan ne kadar daha iyi bir anlayış aranır. Nef, mutasyona uğramış yapıların bir dizi kullanarak, HIV Nef, hem N-terminal bölgelerinde yüksek ölçüde korunmuş Nef proteini motifleri eşlenir ve exNef salgılanması ¹³ için kritik olan Rhesus macaque eşdeğer SIV _Mac ​​(Maymun bağışıklık eksikliği Virüsü) Nef,. Bu motiflerinden biri, Salgı Değişiklik Bölgesi (SMR, 66VGFPV70), beş amino asitlerin herhangi birini büyük ölçüde exNef salgısı azaltılması veya tamamen kaldırılması bir alanin yerine, özellikle kritik oldu. Aktif Motif C üzerinden hücrelerine verildiği zamanhariot proteini dağıtım reaktifi, bir FLAG peptid dizisi (SMRwt) bağlı olan bir peptid ihtiva eden SMR ¹⁸ hücre Nef-transfekte edilmiş ve HIV ile enfekte hem de exNef sekresyonunu inhibe ettiği bulunmuştur. Peptidler ile önceki deneyimlere dayanarak, biz moleküller ve exNef salgılanması Nef SMR rolü altında yatan mekanizmaları aydınlatmak için bu peptid kullanmaya karar verdi.

Bizim "yem protein" olarak SMRwt peptid kullanarak, enfekte edilmemiş T hücre lizatları ¹⁸ SMR hücresel bağlama ortakları co-immünopresipitasyon. FLAG peptid dizisi Anti-Flag afinite reçinesi kullanılarak SMRwt peptid yakalamak için uygun bir sap sağladı. SMRwt peptid mutasyon alanin tek bir valin exNef salgısının inhibisyonu kaldırılması için yeterli olduğunu daha önceki bulgu biz SMR için özel olmayan eş immunoprecipitated proteinler ekarte etmek için kullanılan uygun, son derece özel kontrol peptid (SMRmut) tespit. S sahip olan bir peptit kullanılarakyerine tam uzunluktaki protein daha ilgi çekici pecific etki bize Nef ¹⁹ diğer etki bağlanan hücresel faktörleri onlarca tarama geçebileceğinden.

Bir kez bir sonraki mantıklı adım tespit hücresel bağlama ortakları biyolojik fonksiyonu ¹⁸ için önemli olduğunu göstermekti, SMR-bağlama ortakları tespit. Bunu gerçekleştirmek için standart bir prosedür biyolojik fonksiyonu hedef protein özel miRNA veya siRNA ve daha sonra tahlil etkisini kullanarak demonte protein düzeyleri etmektir. Bu durumda, bir SMR-bağlayıcı protein olarak, bu hedef üretimini azaltarak, hedef mRNA translasyonunu önlerler MiRNA demonte, gerçekleştirilir. Hedef proteinin bu azalma, dolaylı bir etkisi olduğunu, ve muhtemelen de hedeflenen bir proteinin Sonuç olarak içeri bir rol oynayan biyolojik fonksiyonu üzerinde gecikmiş bir etkiye sahiptir, aynı zamanda doğrudan bölgesinin aktivitesini kesintiye olup olmadığını belirlemek için, daha az yaygın antikor engellenmesi tekniği uygulanmıştırHedef proteinin biyolojik fonksiyonu azaltır veya ortadan kaldırır. Bu işlemde, antikorlar, hedeflenen bir proteinin karşı yükseltilmiş Arabası reaktifi kullanarak hücre içine transfekte edildi ve hedef protein işlevi ya da onun sitesinden kenetleme bu, ya da ilgili bağlama alanı bloke ile doğrudan etkileşim vardır. Bu prosedür sayesinde hedef proteinin inhibisyonu doğrudan fonksiyonunu bozan ve daha da biyolojik işlevi olan hedef proteinin önemini teyit RNA demonte işlemleri tamamlayabilir.

Chariot Reaktif hücrelere peptidler ve proteinler teslim etkili iken, bu süreci zaman alıcı ve, deney türleri sınırlar örneğin uzun süreli veya tekrarlanan maruz kalmaların ve in vivo hayvan çalışmalarında yapılabilir ki. Sonuç olarak, pasif hücreleri tarafından alınabilir bir peptid oluşturmak için SMRwt peptid (SMRwt-CPP) ¹⁸ bir hücre delici peptid (CPP) dizisi eklendikültür ortamından. Bu sürüm inhibe exNef salgılanması da eski kadar etkili oldu.

Bu yayınlanan deneylerden elde edilen kanıtlar, rekabetçi inhibisyonu yoluyla tam uzunluktaki protein işlevini antagonize etmek için, ve bu motiflerin bağlayan proteinlerin izole edilmesi için özel bir fonksiyonel motifini ihtiva eden küçük peptidlerin yeteneğini göstermektedir. Bir bu teknikler birçok deneysel protokolleri yararlı olması gerektiğini beklenebilir. Ayrıca, birçok hücresel süreçlerin mühendislik yeni peptid inhibitörleri etkili olmalıdır, CPP dizilerine bağ ile daha da arttırılabilir bir işlevi kapsar.

Protocol

I. Biyolojik Analiz Kısa peptidler kullanımı

I.1. Peptidler kullanarak Haritalama Biyolojik Fonksiyonel Motifler

1. Nef, tarama peptidler olan hücreler Tedavisi
   1. Ilgi bölgenin tarama peptidler bir dizi tedarik. Deneyler, 20mer peptid, 10 amino asit çakışması ile, tüm HIV-1 Nef proteini (205 aa) kapsayan, AİDS için Reaktif Programı elde edilmiştir. Aşağıdaki gibi peptidler ayrı ayrı analiz edilir:
   2. 10 ng / hücre kültürü ortamı ile peptid ml ilave edilir.
   3. Jurkat hücre kültürleri için plaka başına kültür ortamı 10 ml ilave edilir.
   4. 37, 24 saat süre ile kültür inkübe ° C.
2. Apoptoz Terminal deoxynucleotidyltransferase aracılı dUTP biotin Nick Son Etiketleme (TUNEL) testi
   1. 1X PBS ile hücre yıkayın ve 1X PBS, pH 7.4 içinde% 4 paraformaldehid ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca düzeltin.
   2. 10 1X PBS ile yıkanır ve% 0.1 ile geçirgenliği Triton X-100Oda sıcaklığında verilebilmektedir.
   3. 1X PBS ile hücreler iki kez yıkayın.
   4. Bilgisayar kontrollü mikroskop sisteminde Epifloresans tarafından boyanan hücreleri saymak.

I.2. Peptitler kullanılarak rekabetçi bir inhibisyon Analizi

1. Chariot Protein Teslim Reaktif Kiti kullanarak peptidler Eş transfeksiyon
   1. Reaksiyon karışımı, transfeksiyon başına 100 ul son hacim olması için, wtNef-gfp plazmit DNA'sı 1 ug ve yabani-tip SMR etki türetilen peptidler ya da SMR motifi içindeki tek tek amino asitler alanin yerine içeren peptidler ya da 100 ng seyreltik 1X PBS.
   2. Steril su ile 100 ul son hacim olması için Arabası Reaktif bir 1/10 seyreltme 6 ul seyreltilir ve seyreltilmiş DNA peptid karışımı ile bir araya getirmektedir.
   3. Arabası / DNA-peptid kompleksi oluşumuna izin vermek için 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
   4. 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ile pelet 3 x 10 ⁵ Jurkat hücreleri.
   5. 1X PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve Chariot / DNA-peptid kompleksi tekrar süspansiyon.
   6. Süspansiyonuna serum içermeyen RPMI 1640 ortamında 400 ul ilave edin ve 2 saat boyunca 37 ° C'de kültür plakaları içinde inkübe hücreleri.
   7. Her plaka için% 10 FBS ihtiva eden taze RPMI 1640 ortamı içinde 1 ml ilave edilir, ve 37, 48 saat boyunca hücrelerin inkübe ° C
   8. Hasat hücreleri ve floresan mikroskop ile transfeksiyon verimliliği belirler.
2. Peptid inhibisyonu Nef-GFP floresan levha okuyucu ile salgılanması deneyi
   1. Toplanan hücreler, hücre içermeyen koşullandırılmış ortam toplamak, ve 96-çukurlu siyah mikrotitre plakasının her bir kuyu için 100 ul transfer.
   2. Dalgaboyu 485 nm ve emisyon dalga boyu göreceli floresan birimlerinde 515 nm ile bir Tecan GENEios florimetresi üzerinde medyada ölçü GFP floresan.
   3. Kontrol olarak, GFP floresans seviyesini (hücrelerden ortam Nef-GFP ile birlikte transfekte edildi ve bir peptid karıştırılmış ayarlama)% 100.
   4. Hücrelerden ortam Nef-GFP salgılama değişiklikleri belirlemek için çeşitli SMR peptidler ile ko-transfekte edilmiş GFP floresans seviyesi ile karşılaştırın.

I.3. Yem olarak peptidler kullanarak Motif bağlayıcı ortakların izole

1. SMR peptidler ile birlikte immunoprecipitation
   1. 37% 10 FBS ihtiva eden RPMI 1640 ortamı içinde Jurkat hücrelerinin büyümesini, T-75 doku kültür şişesi içinde ° C arasında ve 4, 20 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj ile topak hücrelere ° C Transfeksiyon etkinliğini belirlemek, bir floresan mikroskop altında plaka yerleştirerek, çekim, ve daha sonra toplam ve etiketli hücreleri saymak ve yüzde etiketli hücreleri belirler.
   2. 1 mi 1X PBS içinde hücre pelletini ve bir 1.5 ml Eppendorf tüpüne aktarılır. 1 dakika için 1000 xg mikrosantrifüj. Nazik pipetleme tarafından 1 ml α-FLAG Lizis tampon pelletini tekrar. Lisis tamponu: 50 mM Tris Karışım • HCl, pH 7.4, 150 mM sodyum CHLoride [NaCl], 1 mM fenilmetilsülfonil florid, memeli hücre ve doku özleri ile kullanım için [PMSF] ve 10 ml / ul proteaz inhibitör kokteyl ile birlikte, 1 mM EDTA,% 1 Triton X-100, [Pic, Sigma]. Kullanmadan hemen önce olun.
   3. Diferansiyel olarak 5 dakika boyunca 2,000 x g'de mikrosantrifüj süspansiyonlar ve pelet, 10 dakika hücre artıkları ve DNA sırası ile, 13.000 xg'de. Süpernatant (bundan sonra "lizat" olarak anılacaktır) toplayın.
   4. Lisatı, protein, 1 mg ve SMRwt veya SMRmut peptid Anti-Flag M2 bağlantı jeli (, Sigma bundan sonra "reçine" olarak adlandırılır), 20 ul ya 1 mg ekleyin. Burada kullanılan SMRwt ve SMRmut hem peptidler gömülü bir BAYRAK etiketi dizisi olduğunu unutmayın. Eş-IP tamponu içinde 1 mL (α-FLAG lizis tamponu eksi PMSF ve PIC) bir son hacme kadar karışım getirin. Uç üzerinde uç dönme ile bir gece süreyle 4 ° C de inkübe karışımı. Negatif bir kontrol olarak, ya da peptid yokluğunda reçine ile lizat inkübe edin.
   5. Pellet 5.000 microcentrifugation tarafından reçine - 30 sn için 8.000 xg. Reçine örnek kullanmadan önce 2 dakika razı ve sonra süpernatant aspire izin verin. Herhangi bir reçine aktarmak için dikkatli olmak, dar uç pipet, ya da Hamilton şırınga ile süpernatantı. Dar uç pipet uçları kısmen kapalı kadar plastik bir pipet açılması çimdik forseps kullanılarak yapılabilir. 500 ul yıkama tamponu (50 mM Tris • HCl, pH 7.4, ve 150 mM NaCl). Ile reçine dört kez yıkayın Yıkama tamponu 50 ul 3X FLAG peptidin 15 mg (Sigma) ile ilişkili hücresel protein akıtılır ve oda sıcaklığında 30 dakika için döner / çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
   6. Laemmli numune tamponu (Bio-Rad) içinde kaynatılarak ve ardından aseton çökeltme ile, sıvı kısımlar konsantre ediniz. Bir% 4-20 Tris-HCl, Ölçütleri prekast jele (Bio-Rad) üzerinde SDS-PAGE ile protein ayırın. Coomassie Parlak Mavi R-250 (Bio-Rad) ile jel leke. Not: kütle spektrometresi tanımlama deneyleri için ( Şekil 4A), her bir durum (SMRwt, SMRmut ya da herhangi bir peptid, Co-IP) dört kat olarak gerçekleştirilmiştir ve tüm dört gelen sıvı kısımlar çoğaltır / toplam proteinin girişi, 4 mg arasında bir toplam önce aseton çökeltilmesine havuzlandı edildi durumu).
2. Nef-GFP protein ile birlikte immunoprecipitation
   1. % 0.02 Tween 20 (PBS-T) ile 1X PBS içinde 1 ml anti-GFP monoklonal murin 2 ug ile Dynabeads Protein G manyetik boncuk (Invitrogen) 50 ul karıştırın. 4, 1 saat boyunca, 1.5 ml Eppendorf tüp uç üzerinde uç dönme ile karışım inkübe ° C.
   2. Manyetik açılan süpernatan bunu takiben izin veren bir 1.5 ml MagnaSphere Teknolojisi Manyetik Ayırma Sehpası (Promega Corp, Madison, WI) tüpe koyarak arabellekten boncuk ayırın. Nazik pipetleme ile PBS-T, 1 ml anti-GFP kaplı boncuklar yıkayın.
   3. M 15 1X RIPA 1 ml + tampon Nazik pipetleme ve inkübasyon ile Nef-GFP transfekte Jurkat hücreleri lysebuz üzerinde. + RIPA tamponu: 10X RIPA Liziz Tamponu, pH 7.4, [Millipore, Bedford, MA], steril su içinde 1:10 seyreltilmiş,% 0.02 sodyum azit [Sigma], ve% 0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS], 1 mM PMSF, 10 ul / ml PIC kullanmadan önce hemen ekledi.
   4. Pelet 10 dakika boyunca 2,000 x g'de microcentrifugation tarafından hücre artıkları. Süpernatant (bundan sonra "lizat" olarak anılacaktır) toplayın.
   5. Anti-GFP kaplı boncuklar ile lisatı, protein, 1 mg ekleme, 1X RIPA tamponu + 1 ml nihai hacme getirmek, ve 4 ° C sıcaklıkta 1 saat süreyle uçtan üzerinde uç dönme ile karışım inkübe Not: peptid rekabet çalışmaları için, lisatı, protein, 1 mg önce anti-GFP kaplı boncuklar eklenmeden 1X RIPA tamponu +, 1 ml SMRwt veya SMRmut peptid 2 ug ile önceden inkübe edilebilir.
   6. Yıkama tamponu 1 ml yeniden süspansiyon ile boncuk yıkayın (50 mM Tris • HCI, pH 7.4, 150 mM NaCI ve% 0.1 Tween 20). 4 5 dakika ° C için uçtan aşırı uç rotasyon ile inkübe Boncuk f ayırınrom Manyetik Ayırma Standı kullanarak yıkama. Sırasıyla, 250 mM ve 300 mM NaCI içeren, yıkama tamponları ile boncuklar, ikinci ve üçüncü kez yıkayın.
   7. PBS içinde 200 ul boncuk tekrar, temiz bir tüpe karışımı aktarın ve manyetik bir stand üzerine yıkama boncuk ayırın. 95 ° C de Laemmli numune tamponu 5 dakika 50 ul boncuk kaynatın, karışım oda sıcaklığında 10 dakika boyunca soğumaya bırakın ve daha sonra ayırma için manyetik bir stand üzerine karışım, koyun ve süpernatantlar ("sıvı kısımlar") toplamak .
   8. Bir% 8-16 Tris-HCl, Ölçütleri prekast jel üzerinde SDS-PAGE ile eluat proteinleri ayırın.
3. Kütle spektrometrisi
   1. Tüketim Coomassie-lekeli jeller gelen ilgi protein bantları.
   2. 37 ° de 45 dakika boyunca 10 mM 1,4-ditiyotretol (DTT) 'de örnek azaltmak ° C
   3. 25 ° C'de 45 dakika boyunca 55 mM iyodoasetamid, numuneyi alkile
   4. Sınıf deneyin sıralama ile gecede örnekleri Digest37 psin (Promega) ° C '
   5. C-18 ZipTip (Millipore) ile örnek peptidler Desalt. Alfa-ÇHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) ile örnek peptidler karıştırın ve bir MTP hedef çerçeve III (Bruker Daltonics Inc, Billerica, MA) üzerine onları nokta.
   6. Bir Bruker Daltonics ULTRAFLEX III TOF / TOF kullanarak (MALDI-TOF/TOF) Kütle Spektrometre analizi-uçuş tandem matris destekli lazer desorpsiyon / iyonizasyon zaman yapın.
   7. MS / MS veri Maskot algoritması (kullanarak NCBI olmayan gereksiz ve İsviçre-Prot veritabanlarına karşılaştırın www.matrixscience.com ).
4. İmmünoblot Analizi
   1. % 4-20 ya da% 8-16 Tris-HCl, Ölçütleri hazır jel (Bio-Rad) SDS-PAGE ile protein örnekleri ayırın. Bir nitroselüloz membrana elektroforetik bantları aktarın.
   2. 5 dakika boyunca, Tris membran yıkayın (Bio-Rad TBS) Tamponlu Salin. % 0.1 Tween 2 (TTBS içinde% 5 yağsız süt ile bloke TBS0), oda sıcaklığında çalkalanarak 1 saat boyunca.
   3. 4 ° C de bir gece boyunca çalkalama ile% 5 yağsız süt içinde belirli bir birincil antikor ile immunoblotting membran prosesi. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 yağsız süt, ikincil bir HRP-eşlenikli IgG (H + L) antikoru, ardından 20 dakika boyunca TTBS içinde yıkayın. 30-60 dakika boyunca TTBS içinde yıkayın.
   4. Western Blot Luminol Reaktif (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA) tarafından protein bantları tespit. Fotoğraf filmi için filtre Açığa. Not: Bazı deneylerde, bir soyma reaktif farklı bir birincil ve ikincil antikor ile takip eden hibridizasyon ile membran (Pierce, Rockford, İL) şerit için kullanılmıştır.
   5. Adobe Photoshop 5.0.2 içine Röntgen filmleri tarayın. ImageJ yazılımı (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD) kullanarak yoğunluk analizi yapın.

II. Fonksiyonel Analizde Antikor inhibisyonu kullanımı

II.1. Antibod Eş-transfeksiyonler Chariot Protein Teslim Reaktif Kiti kullanarak

1. Reaksiyon karışımı, transfeksiyon başına, 1X PBS ile 100 ul bir son hacme, wtNef-gfp plazmit DNA'sı 1 ug ve anti-mortalin antikoru veya anti-α-tubulin antikoru ya da 1 mg seyreltin. Not: Bu, daha önce bir anti-α-tubulin antikorun eş-transfeksiyon exNef salgılanması üzerinde hiçbir saptanabilir bir etkiye sahiptir ve bu nedenle, bu deneylerde etkili bir negatif kontrol olarak hizmet ettiği bulunmuştur.
2. Steril su ile 100 ul son hacim olması için seyreltilmemiş Arabası reaktifi 6 ul seyreltilir ve seyreltilmiş DNA-antikor karışımı ile bir araya getirmektedir.
3. Arabası / DNA-antikor kompleksinin oluşumuna izin vermek için 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
4. 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ile pelet 3 x 10 ⁵ Jurkat hücreleri.
5. 1X PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve Chariot / DNA-antikor kompleksi tekrar süspansiyon haline getirin.
6. Süspansiyonuna serum içermeyen RPMI 1640 ortamında 400 ul ekleyin ve C inkübe37 kültür plakaları içinde arşın ° 2 saat boyunca kurutuldu.
7. Her plaka için% 10 FBS ihtiva eden taze RPMI 1640 ortamı içinde 1 ml ilave edilir, ve 37, 48 saat boyunca hücrelerin inkübe ° C

II.2. Antikor inhibisyonu Nef-GFP floresan levha okuyucu ile Salgılama Deneyi

1. Toplanan hücreler, hücre içermeyen koşullandırılmış ortam toplamak, ve 96-çukurlu siyah mikrotitre plakasının her bir kuyu için 100 ul transfer.
2. Dalgaboyu 485 nm ve emisyon dalga boyu göreceli floresan birimlerinde 515 nm ile bir Tecan GENEios florimetresi üzerinde medyada ölçü GFP floresan.
3. Kontrol olarak, GFP floresans seviyesini (hücrelerden ortam Nef-GFP ve anti-α-tubulin antikoru ile birlikte-transfekte edilmiş),% 100 olarak belirlenmiştir.
4. Hücrelerden ortam Nef-GFP salgılama değişikliklerini belirlemek üzere anti-mortalin antikor ile birlikte transfekte GFP floresans seviyesi ile karşılaştırın.

Results

Peptidler kullanarak Biyolojik Fonksiyonel Motifler Haritalama. İki bölge apoptoz neden Nef proteinler üzerinde tespit edilmiştir. Peptit odaklı apoptoz N60 (aa40-60) ve N70 (aa50-70) zirve ve peptid N100 (aa80-100) de arka plan seviyelere azalan, peptid N50 (AA30-50) (Şekil 2) başında gözlendi. Aa50-60 merkezleme büyük Motif 1 (M1), tepe, tam uzunluktaki Nef proteini apoptotik seviyelerinin>% 80 indükler. İkinci bir, küçük apoptotik tepe peptidler N180 (aa160-180) ve N190 (aa170-190...

Discussion

Exosomal ticareti yolu exNef salgısının mühendislik roman inhibitörleri yararlı olacaktır işlemek için Nef yeteneğini altında yatan mekanizmaların anlaşılması. ExNef salgısının inhibisyonu CD4 T hücre tükenmesi ve CIA bu sürücü HIV / AIDS patogenezi düşecektir. Bu hedefe doğru, bize exNef salgılanması genetik analiz ve ilgili hücresel proteinleri belirlemek için başlamak için izin yeni maddeler ve yöntemler geliştirmiştir. Bu yaklaşım, aynı zamanda doğrudan exNef salgılanması SMRwt peptid hedef alan ilk inhibitörünün ge...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 amino asit örtüşmeli 20mer peptit seti	NIH AIDS Araştırma ve Referans Reaktif Programı	4641
TUNEL Testi	Roche	11 684 809 910
Savaş Arabası Protein Dağıtım Reaktifi	Aktif Motif	30100
Tecan GENEios florimetre	(Tecan Group, İsviçre)
96 oyuklu siyah mikrotitre plakası	Corning	3792
anti-FLAG M2 Afinity Jel	Sigma	A2220
Dynabeads Protein G manyetik boncuk	Invitrogen	100.03D
MagnaSphere Teknolojisi Manyetik Ayırma Standı (iki konumlu)	Promega Corp., Madison, WI	Z5332
C-18 ZipTip	Kırlangıç	ZTC18S096	C18 Reçine (0.6 μ l veya 0.2 μ l yatak hacimleri). Oligonükleotidler veya küçük (< 50 kDa) sulu çözelti içinde proteinler / peptitler
MALDI TOF / TOF	Bruker Daltonics ultraflex III TOF / TOF