Transsellüler protein etkileşimleri pankreatik beta hücre fonksiyonu önemli belirleyicidir. Burada ayrıntılı bir yöntem uyarlanmış özel transmembran proteinler insülin salgılanmasını nasıl etkilediğini araştıran sinaptogenez-için bir kokültürü model. Transfekte edilmiş HEK293 hücreleri ilgili proteinlerin ifade eder; beta hücreleri transfekte edilmiş veya başka şekilde doğrudan tedirgin gerekmez.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Pankreas Beta Hücreleri ile insülin salgılanması Etkileyen Ekstrasellüler Protein etkileşimleri kokültürü Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Hücre yüzey proteinleri arasındaki etkileşim, komşu hücrelerin fonksiyonu koordine yardımcı olur. Pankreas beta hücreleri pankreas adacık içinde bir araya kümelenmiş ve glikoz dengesini korumak için koordineli bir şekilde hareket edilir. Bu komşu beta hücrelerinin yüzeylerinde transmembran proteinler arasındaki etkileşimleri beta-hücre fonksiyonu önemli belirleyicileri olduğu giderek daha açık hale gelmektedir.
Kültür beta hücreleri veya in vivo olarak demonte, knockout ya da aşırı çalışmalarla özellikle transsellüler etkileşimlerinin rol izahı potansiyel etkileri analiz karıştırabileceklerinden edemeyeceği şekilde beta hücresi, sağlık ve / veya fonksiyonunu etkileyen, mRNA ve protein ekspresyonu, doğrudan pertürbasyon gerektiren spesifik etkileşimler. Bu yaklaşım, aynı zamanda hedef proteinlerin hücre içi etki düzeyleri değiştirebilir ve dis olmak için aynı hücre zarı içindeki proteinler arasındaki etkileşimlere bağlı etkileri önleyebilirtranssellüler etkileşimlerin etkileri bir biçimde ayrılır.
Burada beta hücrelerinin insülin salgılayan kapasitesi ve yanıt belirli transsellüler etkileşimlerin etkilerini belirlemek için bir yöntem sunulmuştur. Bu yöntem, INS-1 hücreleri gibi beta-hücre hatları, ve ayrışmış primer beta hücreleri için de geçerlidir. Bu HEK293 (veya COS) sinaps oluşumu sürüş için önemli hücre tabakaları tespit proteinler üzerinde ifade belirli nöronal proteinlere kültürlü nöronların maruz kalma bulundu neurobiologists, tarafından geliştirilen kokültürü modelleri dayanmaktadır. Nöronal sinapsların ve beta hücrelerinin salgı makine arasındaki paralellikler göz önüne alındığında, beta-hücre olgunlaşması benzer transsellüler etkileşimleri ile tahrik olabilir gerekçeli. Biz beta hücreleri ilgi bir protein ifade eden HEK293 hücreleri bir tabaka üzerinde kültive edildiğinde, bir sistem geliştirilmiştir. Bu modelde, beta hücre sitoplazması dokunulmamış bir hücre dışı protein-protein ETKİLEŞİM ikenns manipüle. Öncelikle glikoz ile uyarılan insülin sekresyonunda çalışmalar burada odak rağmen, diğer işlemler analiz edilebilir, örneğin, gen ekspresyonunda değişmeler gibi immünolojik veya QPCR tarafından belirlenir.
Giriş
Burada belirli bir transmembran proteinin hücre dışı etki insülin salgılanması nasıl etkilediğini araştırmalar kolaylaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Pankreatik beta hücre yüzeyi üzerinde proteinler (veya muhtemelen diğer moleküller) ile söz konusu protein etkileşimleri gibi bir yöntem problar etkiler. Gibi bir yöntem beta hücreleri tarafından veya diğer komşu hücreler (örneğin, endotel hücreleri, nöronlar, pankreatik alfa hücreleri) ifade eden hücre yüzeyi proteinlerinin transsellüler etkileşimler (örneğin, komşu yüzeyinde etkileşim ortakları ile etkileşim yoluyla yoluyla beta hücresi fonksiyonunu etkileyebilir nasıl araştırmalar sağlar: b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. HEK293 Katman Transfeksiyon
- 50 ml FBS, 5 ml 100X Penisilin / streptomisin solüsyonu, 5 ml 100x L-glutamin solüsyonu ve 500 ul amfoterisin: DMEM 500 ml'lik şişelerde (4.5 ug / ml glükoz, fenol kırmızısı ile ve glutamin olmadan) ekleyerek HEK293 hücre ortamı hazırlayın B.
- De başına HEK293 medya 0.5 ml kullanarak 24 plaka HEK293 hücreleri plaka. Hücrelerin plakanın alt üzerine yayılıyor emin olun.
- HEK293 hücreleri plazmid Lipofectamine protokolüne uygun olarak ilgi duyulan proteini (bir memeli ifade vektörünün içine) ve Lipofectamine 2000 2 ul kodlama 0.8 mikrogram ile% 100 birbirine karışmış, transfekte ulaşır. Biz memeli hücreleri....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada açıklanan yöntem kullanılarak, insülin salgılanması üzerindeki protein neuroligin farklı türevleri etkisini test ettik. Bu beta hücresi işlevi, 10 neuroligin-2 etkisini araştıran eden yayımlanmış çalışma tamamlar. Şekil 2, örneğin, burada adlandırılan bir neuroligin izoformu ifade etmek için transfekte HEK293 hücreleri ile birlikte coculturing INS-1 beta hücrelerinden elde edilen sonuçları göstermektedir NL- X Bu deney NL-X insülin salgısını artırdığı transsellüler etkileşimleri yürütm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan kokültürü yöntemi özel beta-hücre yüzey, transmembran proteinlerin fizyolojik önemini belirlemek için etkili bir yol sağlar, ve özel olarak ekstrasellüler etki. Hücre yüzeyi üzerinde bir ilgi protein görüntüleme HEK293 hücreleri ile temas içinde kültürlenmesi beta hücreleri ya da insülinoma hücrelerine (örneğin, burada kullanılan INS-1 hücreleri gibi) ile, deney doğrudan zarar vermeden hücre dışı protein-protein etkileşimleri etkilerini belirlemek için dizayn edilebilir hücrelerin hücre içi ortamı. Ilgi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Bu çalışma Sağlık hibe R01DK080971 ve Juvenil Diyabet Araştırma Vakfı hibe 37-2009-44 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Biz UCSD Pediatrik Diyabet Araştırma Merkezi (PDRC) alınan destek de teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| pcDNA 3.3 vektör/omurga | Invitrogen | K830001 | |
| Lipofektamin 2000 | Invitrogen | 18324012 | |
| DMEM | Mediatech | 45001-312 | |
| Kalem/strep çözümü | Mediatech | 45001-652-1 | |
| Amfoterisin B | Mediatech | 45001-808-1/30 | |
| RPMI-1640 | Mediatech | 45001-404 | |
| D-PBS | Mediatech | 45001-434 | |
| Sodyum Piruvat | Mediatech | 45001-710-1 | |
| 2-Mercapt– thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Hücre sıyırıcı | Mediatech | 45000-668 | |
| T75 Şişesi | BD | 1368065 | |
| %16 Paraformaldehit | Elektron Mikroskobu Bilimleri | 50980487 | |
| 10x PBS | Mediatech | 45001-130 | |
| Fetal sığır serumu | Mediatech | MT35010CV | |
| IBMX | Sigma | I5879-100MG | |
| RIPA lizis tamponu | Sigma | R0278 |
Kaynaklar
- Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
- Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates i....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
