Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon

17.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50371

⸱

7 Haziran 2013

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich

Bu makalede

Özet

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem rapor Arabidopsis thaliana Tohum. En fazla 40 embriyo alt uygulamaya bağlı olarak 1 saat ile 4 saat içinde izole edilebilir. Prosedür, DNA metilasyonu, muhabiri gen, immün ve floresan transcriptome için uygundur In situ Melezleme analizleri.

Özet

Endosperm - - anne tohum integuments (ya da tohum kabuğu) ile çevrili çiçekli bitkiler olarak, embriyo besleyici bir doku içinde gelişir. Sonuç olarak, erken dönemde (küresel sahneye 1 hücre) de bitki embriyoların izolasyonu teknik göreli erişilememesi nedeniyle zordur. Erken aşamalarında Verimli manuel diseksiyon güçlü genç Arabidopsis tohumların küçük boyutlu ve çevre dokulara embriyonun yapışma tarafından bozulur. Burada, biz aşağı uygulamaya bağlı olarak, 1 saat ile 4 saat içinde 40 embriyolar kadar verimli, genç Arabidopsis embriyoların verimli izolasyon sağlayan bir yöntem açıklanmaktadır. Embriyolar, hafif bir Eppendorf tüpü içinde plastik bir havan tokmağı ile 250-750 tohum ezilmesi izolasyon tampon salınır. Bir cam standart laboratuvar pipet ya bağlı microcapillary (bir lastik tüp ile) veya hidrolik kontrollü mikroenjektör damlacıkları yerden embriyo toplamak için kullanılırters ışık mikroskobu çok iyi slayt d. Gerekli teknik beceri basit ve kolay transfer edilebilir ve temel kurulum pahalı ekipman gerektirmez. Toplanan embriyolar gibi RT-PCR, RNA sekansları, DNA metilasyon analizleri, in situ hibridizasyon (FISH), floresan, immün ve haberci gen deneyleri gibi alt çeşitli uygulamalar için uygundur.

Giriş

Çiçekli bitkiler embriyo endosperm, ikinci bir gübreleme olay türetilen bir besleyici doku ile çevrilidir. Her ikisi de, embriyo ve endosperm çekirdek katının birkaç hücre tabakası ile çevrilidir. Toplu bu dokuların meyve içinde geliştirmek bir tohum, oluşturur. Böylece doku ve Arabidopsis embriyoların hücre spesifik analizleri güçlü bir şekilde erişilememesi nedeniyle bozulmaktadır. Bununla birlikte, geç-küresel ya da geç aşamalarında embriyo nispeten iyi stereomicroscope altında ince tungsten iğneler kullanarak manuel diseksiyon için uygun, ya da onları ayıklamak için forseps kullanarak tohum hafif baskı uygulayarak vardır. Bu tür teknikler, başarılı bir şekilde transkriptomunun veya mikrodizi hibridizasyon, bisülfit dizileme veya RNA sekansları (örneğin, 1-3) Epigenom profil analizleri için kullanıldı. Buna karşılık, erken küresel sahneye zigot de embriyoların çalışmalar teknik olarak zor kalır. Bugüne kadar, sadece birkaç çalışma temsilcisi varsabit tohum bölüm 4 veya ince araçlar 5 ile tohum içinde tek tek embriyo el çekiminden embriyonik dokuların ya lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak genç embriyolar üzerinde orted transcriptome analizleri. Ancak, LCM ekipman erken aşamalarında yaygın olarak bulunan ve manuel embriyo çıkarma değil zaman kolayca transfer edilemez mükemmel diseksiyonu becerileri tüketen ve gerektiren bir. Genom analizleri ek olarak, in situ gen ifade analizleri de Arabidopsis genç, tam monte edilen embriyoların gerçekleştirmek zordur. Bir dereceye kadar, genç embriyolar tohum hafif basınç ile mikroskop slaytlar yayınlanacak ve (örneğin 6,7 bakınız) immün tarafından bildirici gen deneylerinden veya protein tespiti için kullanılır. Bu teknik, ancak, bu nedenle kantitatif analizleri engelleyen, yüksek verimli embriyo izolasyon izin vermez.

Bu nedenle, etkin ve hızlı bir protokol geliştirdi, kolay transfer, ve alt çeşitli uygulamalar için uygun kurmak için basit Arabidopsis tohum erken embriyo izolasyonu için. Uygun bir izolasyon tampon plastik bir havan tokmağı kullanılarak bir Eppendorf tüpü içinde genç meyvalarda gelen parçalanmış - temel ilkesi, yavaşça tohum ezmek için. Tohum ekstresi, çok oyuklu slayt damlalar halinde yerleştirilir ve bir ters mikroskop kullanılarak istenen aşamada serbest embriyoların varlığı için taranır. Embriyolar bir cam mikroenjektör veya standart laboratuvar pipet bağlı microcapillary kullanılarak toplanır. Moleküler uygulamalar için, embriyo az hacimde hedef tampon aktarmadan önce yeni izolasyon tampon damla içine tekrarlanan serbest iki kez yıkanır. Sitolojik uygulamaları (muhabiri deneyleri, immün, FISH) için, yıkama adımları atlanabilir.

Bu yöntem çeşitli avantajlar sunmaktadır: (i) sitolojik uygulaması için ~ 45 dakika içinde 25-40 embriyolar üretirmoleküler uygulamaları (yıkama adımları dahil) Dokümanında veya 3-4 saat içinde, (ii) bu özel embriyonik aşamalarında izolasyonu, (iii) (iv), kolayca basit ayarları nedeniyle diğer kişi ve laboratuarlar için devredilemez sağlar , yükseltmeleri için uygun olan temel kurulum için uygun ekipman gerektirir, ve (v) başarıyla bu RNA sıralama 8, gen-spesifik DNA-metilasyon analizi 9, muhabiri testleri (10 ve Raissig ve ark. gibi çeşitli alt uygulamalar için kullanıldı olarak hazırlık.) ve FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux yayınlanmamış,) bkz. Şekil 5.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu prosedür, Şekil 1'de gösterilen akış şeması özetlenmiştir. Mikrokapilerler ve etkili kurulum Şekil 2 ve Şekil 3'te gösterilmiştir, ve embriyo izolasyon tipik aşamalar, Şekil 4 'de gösterilmiştir.

1. Gereç ve Tampon Hazırlanması

Cam mikrokapilerler 1.1 silikon kaplama

  1. Sigmacote (Sigma) ~ 5 ml, 15 ml Falcon tüp mikrokapilerler yerleştirin ve birkaç kez ters çevirin.
  2. Çözüm çıkarın, 60 ° C de bir alüminyum folyo ile kılcal içeren Falcon tüp yerleştirin ve 3 saat için onları fırında Oda sıcaklığında saklayın.

1.2 ~ 50-100 mikron çaplı microcapillary ipuçları elde

  1. El ile bir Bunsen beki üzerinden veya ticari bir çektirmesi (dikey filament çektirmenin veya mikropipet çektirmenin) kullanarak ya 1 mm çaplı cam kılcal çekin.
  2. Bir elmas kullanınuçlu kalem veya istediğiniz açılış oluşturmak için çekti kılcal ucu kesmek için bıçak. , Bir stereo mikroskop altında iyi şeklinde kılcal seçin. Açılış 50-100 mikron (Şekil 2) olması gerekmektedir.

1.3 Slayt hazırlanması

  1. 5 dakika boyunca Sigmacote (~ 1 ml / slayt) ile tüm kuyuları kaplayarak temiz slaytlar Siliconize, kaldırın. Alüminyum folyo ile fırında, 3 saat. Oda sıcaklığında saklayın.
  2. % 10 SDS, nükleaz içermeyen su içinde 2 x 2 dakika (DEPC GKD 2 O otoklavlanmış),% 70 etanol içinde 2 dakika,% 100 etanol içinde 2 dakika, 10 dakika süreyle çok iyi bir cam mikroskop lamları yıkayın hava kurulayın. Tüm adımlar otoklavlanmış Coplin kavanoz içinde yapılır. Slaytlar her kullanımı arasında kapsamlı bir temizlik sağlayan birden çok kez yeniden kullanılabilir.
  3. Hemen önce embriyo izolasyon yayılmasına ~ 10 0.5 ul mg / ml sığır serum albümin (BSA) her iyi ve hava-kuru tüm yüzey üzerinde bir pipet ile.

1.4 Mikroskop ve kılcal kurulum

  1. 10x ve 20x büyütme hedefi ile ters bir mikroskop kullanın. Işık kontrast Optimize (embriyo oldukça şeffaf).
  2. Mikroskop yanında kılcal cam tutmak için bir micromanipulator yerleştirin. Kılcal cam bir lastik tüp ile bir mikroenjektör (Şekil 3A) veya düzenli P-200 pipet bağlı (Şekil 3B, bu kurulum ayrıntılı bir açıklama için Tartışma bakınız).
  3. Bir ~ 70 ° 'lik açıyla mikroskop lamı (Şekil 3) üzerinde kılcal yerleştirin ve görüş alanında açılması için konumunu ayarlamak.
  4. Hemen önce embriyo izolasyon kadar sürebilir ve bırakın ~ 5-10 ul BSA (1 mg / ml) kat kılcal için.

1.5 Tamponlar

Tablo 1, alt uygulamalara bağlı olarak izolasyon ve hedef tampon listeler.

  1. ~ Örnek başına 1 ml izolasyon tampon taze önce kullanmak ve buz üzerinde tutmak hazırlayın.
  2. Buz (moleküler uygulamaları) ya da bir nemli odasında bir mikroskop lamı (sitolojik uygulamaları) bir 0.5 ml Eppendorf düşük bağlayıcı tüp hedef tampon hazırlayın.

2. Tohum Diseksiyon ve Embriyo Ekstraksiyon

Tohum Geliştirme 2.1 Senkronizasyon

  1. Çiçek erkekleştirmek ve diğer çiçeklerle maruz pistils temas kaçınarak onları iklim odasında 2 gün tutmak, sonra onları (örneğin 11) tozlaşmak.
  2. Temizlenir tohumların mikroskobik inceleme ile sizin büyüme koşullarında geliştirme aşamasında test edin. 4 DAP küresel vermiştir - büyüme koşullarına tohumları (DAP) tozlaşma sonra 2.5 gün toplanan (21 16 saat ışık ° C, 18 karanlık 8 saat ° C ve% 70 nem) özellikle 2-4 hücreli embriyo ve tohum 3,5 toplanan vermiştir embriyolar.

2.2 Tohum Diseksiyon ve Kopma

  1. S çıkarınforseps ve insülin iğneleri ile bir stereo mikroskop altında 10-15 meyvaları (~ 2.5 DAP) den eeds.
  2. Buz üzerine yerleştirilir, 2 ml lik yuvarlak dipli Eppendorf tüp içinde 20 ul tampon içinde izolasyon tohum daldırın.
  3. Yavaşça çekirdeği özütü bulutlu hale gelene kadar embriyo serbest bırakmak için bir plastik havaneli (DEPC GKD 2 O ile çalkalandı,% 10 SDS ile önceden temizlenmiş ve% 70 etanol ile yıkanmış) ile tohum kırmaktadır. Uygulamak için kuvvet deneme üzerine her kullanıcı tarafından belirlenecektir.
  4. Havaneli yıkayın ve örnek sulandırmak için izolasyon tampon 300 ul ile havan eli durulayın.
  5. Spin-aşağı 5 saniye için 5000 xg özü. Yavaşça yukarı ve aşağı 2-3 kez pipetleme pelet özü tekrar süspansiyon.
  6. 30 mikron naylon örgü (PartecCelltricks gelen örneğin, tüp adaptörler monte) ile süzülür. Ek bir 200 ul izolasyon tamponu ile örgü durulayın.

3. Embriyo İzolasyon

3.1 Slayt hazırlanması

  1. Yeri ters mikroskop sahnede temiz, BSA ile kaplanmış ve silikonlu çok iyi slayt, yukarı ve aşağı yavaşça pipetleme filtre çekirdeği ekstresi tekrar süspansiyon ve 1 veya 2 kuyulara 40-50 ul çekirdeği ekstresi 2 damlacıkları pipetle . Aynı anda sadece 1 veya 2 damla Eleme örnek buharlaşmasını önler.
  2. Daha önce olduğu gibi hazırlanan farklı bir slayt iyi taze izolasyon tampon Sıra 50 ul (1. yıkama damla). Buharlaşmasını önlemek için üstü kapalı, nemli odasında bu slayt tutun.

3.2 Ekran, temiz, toplamak

  1. 10x büyütme amacı ile istenilen aşamada embriyo için çekirdeği ekstresinin damlacıkları ekran. Gerekirse, 20x büyütme ile sahne onaylayın. Embriyolar genellikle slayt dibine çöker.
  2. Manuel bir tungsten iğne, bir insülin iğne veya benzeri ekipman ile embriyo etrafında pislikleri temizleyin.
  3. Mikromanipülatör, t kullanarak embriyo yakın kılcal cam taşıyınmümkün olduğu kadar az çözüm olarak ile embriyo kadar AKE.
  4. Birkaç embriyolar (örneğin tek bir damlacık) toplamak ve 1. yıkama damla (moleküler uygulama) veya hedef tamponu (sitolojik uygulamaları) bunları bırakın. Her toplama yuvarlak az hacmi (tüm toplama mermi toplam hacmi <5 ul olmalıdır) toplanmalıdır 5-10 dakika ve embriyoların içinde tutulmalıdır.
  5. Embriyoların istenilen miktarda (merkezi, mümkünse, hatırlama kolaylaştırmak için) 1. yıkama damla toplanan kadar tarama ve tahsilat tekrarlayın.
  6. Yıkama damla (enkaz üzerinden yapılmaktadır eğer, hatırlama önce iğne ile bunları kaldırmak) için aynı anda tüm embriyolar hatırlamak.
  7. 50 ul bir 2. yıkama damla içine embriyolar bırakın. 3.2.6 tekrarlayın.
  8. Hedef tampon içinde embriyoların bırakın. Transfer kılcal ucu sadece bir kişi değil, daldırma, içermelidir.
  9. Microcapil değiştirinBir sonraki örnek ları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Moleküler yıkama uygulamaları için, örneğin, gerçekleştirilmesi durumunda eden embriyo izolasyon prosedürü (Şekil 1), 4 saat içinde 40 embriyo kadar izolasyonu sağlayan ya da bir saatten daha kısa bir süre içinde yıkama, ihmal sitolojik uygulamalar için, örneğin eğer. Gösterir Şekil 2, yüksek ve alçak kalite mikrokılcal uçlarına ve Şekil 3, embriyo izolasyon makinenin bir yapıyı göstermektedir. Şekil 4, bu tersine mikroskobunda embriyo...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz etkili, hızlı bir embriyo izolasyon protokolü geliştirilmiş ve kolayca diğer laboratuarlara transfer edilebilir.

Burada tanımlanan cihaz, bir ters mikroskop, bir mikromanipülatör, cam mikrokapilerler, dikey bir filaman çektirme ve mikroenjektör (Şekil 3A) oluşur. Kurulum transkriptomik analizleri 17 için tek bir hayvan hücre izolasyonu için tarif edilen yönteme benzerdir. Biz de başarıyla cam mikrokapilerler elle bir alev gerilir (ve bir elmas bıçak ile kesili...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Biz embriyo izolasyon tavsiyeleri için Tal Nawy ve Martin Bayer teşekkür etmek istiyorum. MTR, VG, UG ve CB embriyo izolasyon ekipman geliştirmiştir. MTR, VG ve CB embriyo izolasyon protokolü geliştirdi. MTR, VG ve CB, protokol kurulan embriyolar izole ve oluşturulan embriyo cDNA, VG PCR, MTR GUS boyama, JJ FISH deneyler yaptı. MTR, VG, CG ve UG el yazması yazdı. Bu çalışma Zürih Üniversitesi, Roche Araştırma Vakfı (mtr) bir Bursu ve İsviçre Ulusal Vakfı (UG ve CB) hibe tarafından finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
REAGENTS
SigmacoteSIGMASL2-100 ml
RNAse OUTInvitrogen (yaşam teknolojileri)10777-019
Birinci iplikli tamponInvitrogen (yaşam teknolojileri)18064-022Superscript II paketinde bulunur
DTTInvitrogen (yaşam teknolojileri)18064-022Superscript II paketinde bulunan
Sığır serum albümini (BSA) 100x = 10 mg / ml New England Biolabs, Inc.Farklı tedarikçiler de çalışacak
İnce duvar Kılcal damarlar 1.0 mmWorld Precision InstrumentsTW100F-4
DNA LoBind tüpü 0.5 mlVaudaux-Eppendorf0030108.035
CellTricsΔ 30 μ mPARTEC04-0042-2316
5wells 10 mm çaplı kızaklarElektron Mikroskobu Bilimleri63421-10
Formaldehit ÇözeltisiSigma-AldrichF1635
Superfrost Plus slaytThermo FisherJ1800AMNZMenzel-Glä ser
TrisAmaresco0497
EDTAUygulamasıA2937
GlisinFluka50050
SDS peletleriRothCN30.3
Mikro HavaneliVWR431-0094
Mikro ince insülin şırıngalarıBDU-100
DEPCSigma-AldrichD5758
EtanolSchaurlauET00102500
Forseps N5Dumont0108-5
Biyoanalizör Pico ChipAgilent Technologies5067-1513
EQUIPMENT
Ters mikroskopNikon TMS (Japonya),
MikromanipülatörLeitzLeica
Mikomanipülatör Direk montajlı LH1 probuLeica mikrosistemler39430101Farklı marka da işi yapacak
Dikey filament çektirme SutteraletiP-20 modeliDiğer model de uygundur
Cell Tram varioVaudaux-Eppendorf5176.000.033
BiyoanalizörAgilent Technologies2100
Qubit FluorometerInvitrogen (yaşam teknolojileri)

Kaynaklar

  1. Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
  2. Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
  3. Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
  4. NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
  5. Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
  6. Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
  7. Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
  8. Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
  9. Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
  10. Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
  11. Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).
  12. SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
  13. Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
  14. Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
  15. Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
  16. Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
  17. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).
  18. Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
  19. Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
  20. Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Arabidopsis Embriyosu zolasyonuTohum DiseksiyonuMikrokapiler Aspirasyonnvert MikroskopiEmbriyo ToplamaEmbriyo TaramaBSA Kapl LamlarPlastik Havanda EzmeNaylon FiltrelemeEmbriyo Y kama
Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.