Yöntem makalesi

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

65.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/50374

⸱

25 Haziran 2014

 ,  ,  , 
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

Bu makalede

Özet

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Özet

Kontrolsüz glisemi diabetes mellitus bir özelliğidir ve nöropati, nefropati ve retinopati gibi hastalıklarının teşvik etmektedir. Diyabet, immün-aracılı tip 1 ve obezite bağlantılı tip 2 hem de diyabet patofizyolojisi ve tedavi mekanizmalarını ortaya koymaya yönelik çalışmaların artan yaygınlığı ile kritik bir önem taşımaktadır. Langerhans pankreatik adacıkların β-hücrelerinin uygun bir şekilde, yüksek kan şekeri konsantrasyonlarına yanıt olarak insülin salgılayan sorumludur. Glikoz ve diğer besinler, β-hücrelerinin aynı zamanda belirli hormonlar tarafından uyarılır Buna ek olarak, hücre içi siklik adenozin monofosfat üretimini artırmak β-hücresi reseptörleri üzerinde bir yemek ve hareket yanıt olarak bağırsak salgılanan inkretinler, (adlandırılır cAMP). Azalmış β-hücre fonksiyonu, kütle ve iç salgı bezi yanıt tip 2 diyabet patofizyolojisi katkıda iyi anlaşılmış olup, aynı zamanda giderek wi bağlantılı ediliyorinci tip 1 diyabet. Mevcut fare adacık izolasyon ve cAMP tespit protokolü hastalığın ilerlemesini ve terapötik müdahaleler, hücre içi cAMP üretiminin modülasyonu yoluyla hareket reseptörlerini inkretindir reseptörlerinin aracılık ettiği veya ilgili olduğu özellikle teşvik mekanizmaları tanımlamak yardımcı bir araç olabilir. Sadece cAMP ölçümleri tarif edilecek olmasına rağmen, tarif edilen doku adacığı izolasyonu protokolü de glikoz insülin salgılanmasını, [3H]-timidin katılması, protein bolluğu ve mRNA ifadesi uyarılmış de dahil olmak üzere diğer pek çok alt uygulamalar için izin temiz bir hazırlık oluşturur.

Giriş

Öglisemi sıkı bakım kontrolsüz tip 1 ve 2 diyabet 1 patoloji tüm özellikleridir nöropati, nefropati ve retinopati, hastalıklarının önlenmesi için zorunludur. Tip 1 ve tip 2 diyabetli hem de azaltılmış β-hücre fonksiyonu ve kütle kan glikozu konsantrasyonlarını 2 de karıştırabilir. Insülin üreten β-hücrelerinin, bozulmuş β-hücresi insülin salgılama ve çevresel insülin türü sinyal 2 diyabet yıkıcı kaybı immün aracılı tip 1 diyabet, birlikte hiperglisemi, dislipidemi ve sonunda ile sonuçlanan, artan hepatik glikoz üretimini teşvik Oysa β-hücrelerinin ayrı ayrı 3 β-hücre kütlesi ve insülin salgılama kapasitesinin kaybı. iki Tip 1 ve tip 2 diyabet ilerlemesinde temel β-hücresi mekanizmaların anlaşılması, bu hastalıkları önlemek ve tedavi etmek için yeni tedavilere yol açacaktır.

Vitro ti içindeBöyle INS-1 ve MIN6 gibi ssue kültür modelleri, β-hücre hatları ölümsüzleştirdi spesifik β-hücre fonksiyonlarını anlamak için yararlı bir araç olabilir. Bununla birlikte, adacık içinde farklı hücre tipleri arasında etkileşim kendileri β-hücresi fonksiyonunu regüle olabilir. Örneğin, glukagon parakrin etkisi (α-hücrelerinden salınan) ve insülin salgılanmasını artan ve azalan somatostatin (δ-hücrelerinden salınan), sırasıyla, endokrin tepkisinin 4 hücre, hücre yakınlık önemini ortaya koymaktadır. Ayrıca, β-hücreleri arasındaki ara bağlantılar insülin 5 salınımını mümkün kılmaktadır. Adımlar daha glikoz için izole edilmiş adacık fizyolojik yanıtı çoğaltılmış insülinom çizgileri üreten yapılmıştır, ancak ayrıca, (örneğin, INS-1-türevi 832/13 ve 832/3 hücre çizgileri), glikoz yanıt yine de, normal fare farklıdır 6,7 adacıklarının. Ayrıca, bu klonal insülinoma hücre çizgilerinin tepkiglukagon benzeri peptid-1 (GLP-1), bunların agonistlere karşı birbirinden önemli ölçüde farklı, hem de normal adacık 6 olabilir. Bu nedenle, ölümsüzleştirdi hücre hatları Maddeleri cAMP üretimi üzerinde etkisi olduğu tahlil için en iyi modeli temsil olmayabilir.

Insülinom-türevi hücre hatlarının tersine, bütün hayvan modellerinde, sadece β-hücresi fonksiyonu çalışmalarında komplikasyonların kendi kümesi sunar. Endokrin dokusu ile çalışan en büyük zorluklardan biri serbest hormon kesin konsantrasyonu ölçülmesidir. Özel olarak, karaciğer insülin metabolize önemli bir rol oynar ve kan akışı pankreas, karaciğer doğrudan gider. Böylece, plazma insülin ölçümü doğru pankreas kendisi veya insülin salgılanmasının 8'in oranı farklı tedavilerin etkisinden salgılanan insülinin miktarda tasvir olmayabilir. Ayrıca, glukagon renal metabolizması α-adacık hücreleri 9 glukagon çıkış güvenilirliğini sınırlayabilir. Bu nedenle, in vitro deney için primer fare adacıkları izole adacık in vivo koşullarında yapılan ölçümler güzelleştirmek için belli bir uyarana yanıt nasıl daha kesin bir anlaşılmasını sağlar.

Fare adacıklar izolasyonu için mevcut protokol (başarısını artırmak için yardımcı olabilir hafif değişiklikler) gruplarının bir dizi 10,11 tarafından kullanılan köklü bir protokoldür. Buna ek olarak, cAMP üretiminin belirlenmesi β-hücrelerinin iç salgı bezi yanıt doğrudan bir-okuma sağlar. CAMP ölçümü, protein içeriği ve insülin salgılanması ile bağlantılı olarak da β-hücre fonksiyonu bir kusur cAMP 10 proksimal veya distal yatıyor belirlemek için yardım, aynı cAMP numune hazırlık dan ölçülebilir. Bu protokol son cAMP içeriği ve insülin salgılanması uygulama aralarında, ilaç ve diyet bileşenlerinin etkisini anlamak için çok güçlü bir araç olabilirs, cAMP ve insülin salgılanması üzerinde. Tek başına glikozdan uyarılmaya ek olarak, diğer bileşikler, cAMP ve insülin salgılanması 10,11 değişiklikleri ölçmek için kullanılabilir.

İzole adacık insülin, glukagon ve bu tür somatostatin gibi diğer hormonlar,, hem de sitokinler, eikosanoidler ve siklik adenozin monofosfat ikinci tahlil birincil hormon olmasına rağmen, son olarak, aynı zamanda geçici bir uyarma deneyi ile ya da miktarının ölçülmesi ile, ya ölçülebilir kültür ortamında 12 kendi seviyeleri. Son olarak, diğer birçok uygulamalar, alt doku adacığı transplantasyonu, PCR ya da mikro-dizi analizi, nicel gerçek zaman RNA izolasyonu, bir protein olarak, takip edilebilir, böylece dış Bu yazının kapsamı, tarif edilen kolajenaz izolasyon yöntemi ile doku adacığı izolasyonu adacık koruma sağlar, ancak Western lekeleme, adacık yerleştirmesi ve immünofloresan görüntüleme ve adacık hücresi Repli bir ölçüsü olarak, [3H]-timidin dahil edilmesi için izolasyonÖnceki JoVE makalelerinde 13-16 'de tarif edilmiştir bazıları katyondur. Genel olarak, protokolde tarif adacık izolasyon prosedürü takip tedavilerin geliştirilmesi ve β-hücre fonksiyonu artırmaya yönelik ilaç keşfi teşvik için önemli ve yararlı bilgiler içeren bir araştırmacı sağlayabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde idam edildi. Gösterdiği ediliyor protokol Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) rehberliği ve onayı altında gerçekleştirildi.

Çözümleri 1. Hazırlanması

  1. Bu protokol ötenazi yöntemi (Tartışma bakın alternatifleri gözden için) Avertin anestezi altında kan kaybı olduğunu. Avertin yapmak için, 20-30 dakika boyunca 37 ° C'de 15 ml konik bir tüp ve ısı 2-metil-2-butanol 1.25 ml 2-2-2 tribromoethanol 0.625 gr (1.25 veya% 44.2 mM) ekleyin. Tam olarak 2-2-2 tribromoethanol çözmek için bir seferde 10-15 saniye boyunca yüksek bir çözüm vorteksleyin. Bir kez tamamen çözünmüş, 50 ml konik sargı, yeni bir 50 mL konik tüp içine, bir 0.45 um filtre içinden filtre, çift damıtılmış H2O 48,75 ml çözeltisini ekleyinkadar bir ay boyunca 4 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza al tüpü. Farelere enjekte önce, oda sıcaklığına kadar tüp getirin.
  2. , Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) yapmak çift distile H 2 O bir 10x stoklar (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) 1 L 1x HBSS makyaj, 0.35 g (4.2 mM) Nacho 3, ve mağaza eklemek için en fazla 1 ay boyunca 4 ° C 'de. Her bir fare için, bu çözeltinin (artı hata pipetle için ilave 5-10 mi) 105 ml doku adacığı izolasyonu için gerekli olacaktır.
  3. Islets hipoksik hasara karşı çok hassastırlar; Bu nedenle, HBSS kandaki O 2 konsantrasyonlarını taklit etmek için% 95 O 2/5% CO2 ile kabarcıklandırılmış. Özel gaz karışımları satın alınabilir ve köpüren bir istasyon esnek bir boruya bağlı bir Pasteur pipeti ile kurmak. 15 dakika boyunca% 95 O 2/5% CO2 ile HBSS gerekli miktarda köpürme sonra, hacimce% 0.02 RIA derece BSA (sığır serum albümini) ekleyin ve r için buz üzerinde tutmakadacık izolasyon emainder.
  4. Ficoll hazırlanması için, bir 400 ml çanak içinde 32.5 g Ficoll tartmak HBSS 80 ml ekleyin ve 30 dakika boyunca 500-700 rpm'de karıştırın. Bir kez çözüldü dereceli silindir içinde bir 250 ml Ficoll solüsyonu dökün ve% 25 Ficoll çözelti oluşturmak için dereceli silindirde 130 ml işaretine kadar HBSS ekleyin. Parafilm ® M (Pechiney Plastik Ambalaj Şirketi, Chicago, IL) ile iki porsiyon mezun silindir üst kapağı ve kuvvetlice birkaç kez çalkalayın.
  5. 50 ml konik tüpler için, sırasıyla,% 23,% 20.5 ve% 11 Ficoll çözümü için, 24,6 27,6 ekleyebilir, ve% 25 Ficoll'ün 13.2 ml. Daha sonra, HBSS ile 30 ml 'lik bir toplam için her bir çözüm getirmek ve karıştırmak için iyi sallayın. Dört Ficoll çözeltiler 4 ° C'de saklanır ve en fazla 2 hafta için iyi olmalıdır.
  6. Aktif adacıklar izole edilmesi için uygun olan kollajenaz çözelti, Clostridium izole edilmiş kolajenaz hazırlanır histiyositikum (Malzemeler tablo). Her bir çok enzim etkinlik için test edilmesi gerekmektedir. Tipik olarak, kolajenaz HBSS ml başına 0.3-0.5 mg kullanılır. Bu aralığı (genellikle 3 farklı konsantrasyonları) enzim konsantrasyonları kullanan yaştaki farelerin veya çalışma enzim konsantrasyonunu ayarlamak için littermates izole adacıklar kalitesini ve miktarını belirlemek.
  7. Doğru konsantrasyonu tespit edildikten sonra, her bir fare, tüm yalıtım protokolü için HBSS içinde 35 ml kolajenaz gerektirir. Çözünmesi HBSS içinde kolajenaz çalkalanır. Hemen önce ameliyat, kollajenaz çözüm ile 5 ml şırınga ön-yük üzerinde kanül yerleştirin ve hava kabarcıklarını çıkarmak ve ihtiyaç kadar buz üzerinde bırakın.
  8. O / N kuluçkalama için adacık kültür ortamı, bir takviye edilmiş RPMI 1640 ortamdır. Stok çözeltisi için, çift damıtılmış H2O 1 L bir RPMI 1640 paket (Gibco, New York) çözülür ve 1.19 g HEPES (5 mM) ve 2 g NACHO 3 (24 mM) ilave edilir. PH'ı 7.4 'e ayarlayın,karanlıkta 4 ° C'de filtre sterilize ve mağaza.
  9. Vasıta için, stok RPMI 1640 ortamına, sırası ile,% 10 FBS ve 100 IU/100 ug / ml penisilin / streptomisin ekleyin. Farklı bir glikoz konsantrasyonu isteniyorsa, glikoz içermeyen RPMI 1640 ortam kullanılabilir ve glikoz belirli bir konsantrasyon ilave edilebilir.
  10. NaCl (118,41 mM), KCI (4.69 mM), MgSO 4 (1.18 mM), KH 2 PO 4 (1.18 mM: bir stok Krebs Ringer bikarbonat tampon (Krebs), aşağıdaki konsantrasyonlarda çift damıtılmış su için aşağıdaki maddeler eklemek ), Nacho 3 (25 mM), HEPES (5 mM) ve pH 7.4 'te CaCl2 (2.52 mM). CaCl2 en son ilave edilmesi gerektiğini ve bu çözelti, 2 haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edilebilir.
  11. Krebs,% 0.5 RIA dereceli BSA ilave edildi ve ardından 37 ° C'de bir Pasteur pipeti ile 10-15 dakika boyunca% 95 O 2/182,% 5 CO2 ile gaz birinci bir çalışma stok yapmakhacimce. Daha sonra, glikoz in vitro tahlili için arzu edilen konsantrasyona kadar ilave edilir.

Araçlar 2. Hazırlanması

  1. Biraz 30 ipuçları künt - ve 27-G iğne sivri yuvarlamak için bir bileme taş kullanarak. Bir pense kullanarak ucundan bir inç ¼ konusunda iğne 45 derecelik bir viraj koydu. İğnenin iç çapı kapalı kapanacak olan, çok sert sıkmak için değil dikkatli olun.
  2. Yaklaşık 4 inç uzunlukta, her bir fare için bir tane olmak 3/0 ipek dikiş ipliği kesin.
  3. Aşağı plastik wrap ve bant ile diseksiyon mikroskop tabanı örtün.
  4. Fare başına en az 2 için emici kağıt tezgah, boyut olarak yaklaşık 3 x 5 inç, birkaç parça kesin.

3.. Fare hazırlanması

  1. 1 ml Avertin ile bir 1 ml şırınga doldurun.
  2. Vücut ağırlığının yaklaşık 40 ul / gram 'de periton içinden avertin solüsyonu enjekte edilir.
  3. Fare yok l sonraonger dikkatli diseksiyon mikroskop iş istasyonu aktarmak, kuyruğu ve arka ayak tutam yanıt verir.
  4. Sırtüstü pozisyonda fare ve onun baş distale bakacak,% 70 sulu etanol ile fareyi sprey. Maruz kalan göğüs boşluğunda kürk miktarını sınırlamak için% 70 etanol yeterli miktarda kullandığınızdan emin olun.

4. Göğüs boşluğuna açılması

  1. İki arka bacaklarının arasına fare kürk ve deri sıkın ve epidermis, dermis ve altta yatan zarından bir ilk kesim yapmak.
  2. Hala deri ve altta yatan membran sıkarken, fare herhangi bir iç organ kesme önlemek için dikkat çekici her iki tarafındaki ön ekstremite doğru kesti.
  3. Göğüs kafesi üzerinde deri ve membran kapağı katlayın ve enflasyon için pankreas daha kolay erişim sağlamak için kılıç şeklinde işlemi kaldırmak.
  4. Kafa proksimale bakan ile fare yönlendirme ve iş sağ tarafta st doğru iç organların hareketinen aorta ortaya tirme.
  5. Kan, doku toplanacak sürece, azalan aorta euthanization tamamlamak için kesilebilir. Ortak safra kanalı daha kolay erişim için tezgah kağıt veya bir Kimwipe aşırı kan emmek.

5.. Pankreas şişirilmesi

  1. Ortak safra kanalı fare başkanı ile bir dik bir çizgi oluşturur böylece bir diseksiyon mikroskobu ile ince bağırsak yeniden konumlandırmak.
  2. Bir forseps alın ve ince bağırsak kavramak ve pembe bağırsak üzerinde beyaz bir üçgen oluşturan, safra kanalından ince bağırsak üzerine kompleks bir yapıya sahiptir koledok, sonunda Oddi sfinkterin (ampulla sfinkter) bulabilirsiniz. Oddi Sfinkter bulunduktan sonra, bir # 5 Dumont forseps almak ve mümkün olduğunca ince bağırsağa yakın koledok altına ucu slayt, kanal delmek için dikkatli olmak.
  3. Ince bağırsak ve bağ dokusu ile delici sonra, kullanmaDumont ucu dikiş kavramak ve ortak safra kanalı altında çekin forseps. Düğüm kaçağını önlemek için gergin olduğundan emin yaparak, mümkün olduğunca Oddi sfinkter yakın olarak koledok kapalı kravat.
  4. Sütür iki ucunu tutun ve ortak safra kanalı biraz gerginlik koymak için kuyruk doğru çekin. Ücretsiz bir elinizi kullanarak, sadece karaciğere son çatallanma yukarıdaki koledokta mikro makas ile küçük bir kesi yapmak. Not: Bu pankreasın kısmi enflasyon neden olabilir gibi Oddi sfinkter çok yakın kesim ve aynı zamanda bir fakir enflasyon neden olacak gibi ortak safra kanalı yoluyla kesme önlemek değil önemlidir.
  5. Gergin koledokun ile dize iki ucu tutarken, şırıngayı belirlenen buz kovası 5 ml kollajenaz solüsyonu ile ön-yüklü olmuştur şırınga / kanül, kaldırmak ve kesim içine blunted 30 G iğne takın ortak safra kanalı, dikkatli olmak wa yoluyla delmek içinkanalının ll. 30 G iğne etrafında bir mühür formu safra kanalı için yeterince geniş değilse, çıkarın ve blunted 27 G iğne ile değiştirin.
  6. Iğneyi yerinde tutarken, dikiş bırakın ve 5 ml şırınga pick up. Yavaş yavaş şırınga pistonu bastırın. Not: iğne başarıyla koledok içine sokulduğu, genişletmek olacaktır.
  7. Pankreasın ilk bölümü nazik sabit basınç, ardından şişirir kadar yavaş ve ritmik bir tarzda kapalı izin pistonu basmaya devam pankreas artık açılırsa kadar. Not: Çoğu pankreaslardan sızıntı başlamadan önce 3-5 ml tutun. Ayrıca, başarılı bir şişirme ekzokrin doku dağılımını sahip olacak ve mide üstüne pankreasın bir parçası şişirilmiş olacaktır.
  8. Koledoktan iğneyi çıkarın ve yan yola.

6.. Pankreas Temizleme

  1. Bir yandan ve kavisli bir makas bir forseps almakdiğer. Forseps kullanarak, Oddi sfinkter de ince bağırsak kavramak. Kapalı makas ile, ince bağırsaktan pankreas ayrı bir parçası için ucunu kullanın.
  2. Ince bağırsak ve pankreas arasındaki boşluğu genişletmek için ayrı makas yayıldı.
  3. Ince bağırsak ve pankreas sadece yapıldığı boşluğunun sağ tarafında birbirine bağlamak makas "V" yerleştirin. Forseps kullanarak hafifçe pankreas kaldırmak için makas geçmiş ince bağırsak çekin.
  4. Pembe bağ dokusu ince bağırsağa aşağı çalışma tutun. Bu noktada, mide bağlandığı yere yakın küçük bağırsak alıp uzağa küçük bağırsağın kalanından pankreas kesiyorlar. Not: Söndür başlayabilir olarak pankreas snip için özen.
  5. Yavaşça, forseps (düz forseps iyi çalışma) ile mide bağlı pankreas bölümünü kapmak. Pankreas hafifçe yukarı çekerken, eğriyi kullanınd makas pankreas ve mide arasındaki bağlantılarda uzak snip.
  6. Dalak bulun ve pankreas üzerinde forseps ile tutun. Kavisli makas alın ve dalak ve pankreas arasındaki bağlantıları kesip.
  7. Pankreas, kalın bağırsak bağlı olduğu bulun. Forseps ile kalın bağırsak Pick up ve üzerinden poke makas ucu kullanın. Kalın bağırsak ve pankreas arasında bir boşluk oluşturmak için daha önce olduğu gibi ayrı makas yayın.
  8. Forseps ile kalın bağırsağa kadar tutun: Bu pankreas kalın bağırsak kendi kesin bağlantılarını açığa, uzak düşen neden olacaktır. Kalan bağlantıları Kırpmalı.
  9. Pankreas ve ince bağırsak bağlı pembe bağ doku bulmak ve mümkün olduğu kadar yakın olarak pankreas kesti. Not: pankreas delici bir endişe ise, bağ dokusu sonraki adımda filtre olacak gibi ince bağırsağa yakın kesmek için tavsiye edilir.
  10. Gmümkün olduğunca pankreas çok ve rab yavaşça kaldırın. Kavisli makas ile, tam pankreas kaldırmak için pankreas ve göğüs boşluğu arasındaki kalan bağlantılarını kesip. Not: doğru kaldırılmaz ise pankreas hala şişirilmiş olmalıdır.
  11. Diğer tüm pankreas şişirilmiş ve deney için kaldırılmış kadar buz üzerinde bir 50 ml konik bir tüp içinde kolajenaz çözeltisi ~ 2.5 ml uzaklaştırıldı pankreas saklayın.

7. Yıkama

  1. Tüm izole pankreasları almak ve her bir taze kolajenaz çözeltisi 25 ml içeren 50 ml konik tüp ayırmak için taşımak
  2. Çırpıcı ile, 220-250 devirde salınım yapabilen su banyosu sallayarak bir 37 ° C dik 50 ml konik tüpler yerleştirin kapatılır.
  3. % 95 O 2/5, bir Pasteur pipeti ile 5 dakika boyunca% CO2 ile her biri 50 ml konik tüp Gazı.
  4. Sıkıca her tüp Özetlemek ve sallayarak su yanlara yerleştirinsu yüzeyinin altında banyosu. 16 dakika kadar 6 dakika 'dan başlayan, 20 saniye boyunca 220-250 rpm, her dakika çalkalayın. (,, 10, 6, 14, 12, 8, en çalkalanır ve 16 dakika)
  5. Hemen hızlı bir dönüş için oda sıcaklığında santrifüj tüpleri aktarın. 1,500 rpm (400-500 g) santrifüj kadar getirin ve hemen kapatın.
  6. Bir vakumlu tutucu, aspire pelet bozmadan kolajenaz çözeltisi kullanılarak yaklaşık 22.5 ml. Pelet kırmak için yavaşça 10 ml HBSS ve vorteks ile yıkayın.
  7. 1,500 rpm (400-500 gr) kadar oda sıcaklığında başka hızlı sıkma gerçekleştirin.
  8. Yine pelet bozmadan çözeltisi aspire yaklaşık 10 mi,.
  9. Hafifçe bir kez daha topak parçalamak için başka bir 10 soğuk HBSS ml ve vorteks ile yıkayın. Çözeltinin hızlı eğirme ve aspirasyon 10 ml tekrarlayın.
  10. Yavaşça HBSS çözeltisi geri kalan 2.5 ml pelet vorteks. Yoluyla çözüm dökün1.000 mikron, yeni bir 50 ml konik tüp içine örgü. Bu kollajenaz tarafından sindirilmeyen büyük doku enkaz kaldırmak olacaktır.
  11. Soğuk HBSS 2.5 ml, eski 50 ml konik bir tüp içinde durulayın. Tamamen yeni 50 ml konik bir tüp içine örgü ile HBSS 2.5 ml aktarmadan önce tüpün tarafı durulama için bir Pasteur pipet kullanın.
  12. Doku pellet haline getirmek için 1500 rpm'de (400-500 g), oda sıcaklığında, başka bir hızlı bir dönüş gerçekleştirir.
  13. Vakum tuzak doğru tüpü bükerek HBSS her aspire. Not: Bu adacık kaybına neden olacak gibi pelet rahatsız için çok önemlidir. Pelet gevşek veya vakum tuzak doğru hareket etmeye başlarsa, çözüm aspire durdurmak ve dokuyu yeniden pelet ve ardından kalan çözüm aspire devam ediyor.
  14. Bir kez HBSS her kaldırıldı, pelet kırmak için% 25 Ficoll çözeltisi ve girdap 4.8 ml.
  15. Dikkatlice 2 2.4 ml katman50 ml konik tüp tarafına% 23 Ficoll çözeltisi ilave edilerek% 25 Ficoll çözeltisi üzerine% 3 Ficoll çözeltisi. Ficoll çözeltisi ilave bile katman sağlamak için, 50 ml konik tüp döndürün.
  16. % 20.5 'için katmanlama işlemi tekrarlayın ve daha sonra% 11 Fıcoll çözümleri. Not: 4 farklı katmanlar mevcut değilse, 50 ml işaretine kadar HBSS ekleyin ve Ficoll degrade artık var 4-6 defa veya tüpü ters çevirin. Dokuyu yeniden pelet ve adımlarını 7.14-7.16 yeniden deneyin.
  17. 15 dakika boyunca 1820 rpm'de (800 g), oda sıcaklığında, 50 ml konik tüp Spin.
  18. Arkasında ekzokrin doku pelet bırakmak için özen, yeni bir 50 ml konik tüp içine Ficoll'ün tüm dökün. 50 ml işaretine kadar buz HBSS ekleyin ve birlikte Ficoll ve HBSS karıştırmak için tüpü 4-6 kez ters.
  19. 5 dakika için 1820 rpm'de (800 g), oda sıcaklığında, 50 ml konik tüp Spin.
  20. Dikkatli bir vakum tra kullanılarak HBSS / Ficoll karışımının en aspires. O gevşek ve kolayca aspire edilebilir pelet rahatsız etmeyin.
  21. Pasteur pipeti almak ve bir tek kültür tüpüne pelet aktarın.

8. Islets Toplamaya

  1. Tek kültür tüpüne toplama ortam 5 ml (yani. Takviye edilmiş RPMI 1640 ya da Krebs Ringer bikarbonat tampon) ilave edin. Not: Ortam toplama alt uygulamalara bağlı olarak değişecektir.
  2. Adacıklar, 5 dakika boyunca kültür tüpün dibine çöker olsun. 60 mm Polistren Petri tarafından Pasteur pipet 15 mm kullanarak aktarabilirsiniz. Not: Bu tedavi edilmez gibi bir Petri kabı kullanmak ve çanak yapışmasını adacıklar önleyecektir önemlidir.
  3. (; Filtre sterilize 100 ml RPMI 1640 Stok Medya, 10 ml Isı Inactivated FBS, 1 ml Pen / Strep) 60 mm polistiren Petri kabı ayrı bir 15 mm, 5 fare adacık kültür ortamı ml ekleyin.
  4. Backlig ile bir diseksiyon mikroskop yardımı ileht yeteneği, asiner doku enkaz aktarılmasını önlemek için özen, adacık kültür ortamı içeren Petri kabı içine adacıklar almak için bir P-20 pipet kullanın. Ne zaman aydınlatmalı asiner doku açık gri ve mat görünür ise, adacıklar, kahverengimsi-altın ve dış zar parlıyor olabilir görünecektir. Adacık hazırlık enkaz büyük miktarda içeriyorsa, taze ortama kez adacıklar elle almak için tavsiye edilir. Debris kirlenme azaltılması bir gece inkübasyon sonrasında doku adacığı topaklanma sınırlayacaktır. Sindirim tampon DNAz (3.000 U / ml) ekleme de adacık kümeleşmeyi (JWJ, kişisel gözlem) sınırlamak için yardımcı olabilir. Not: Bu mansap deneyler için plan izole adacıklar sayısını saymak için önemlidir.
  5. % 5 CO2 ile 37 ° C'ye ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde Adacıklar O / N inkübe edin.

9. CAMP Deneyi

  1. 1.7 ml mikrofüj tüpler, tahlilin her tekrar için bir etiketleyin. Not: cAMP deneyler, en az du olmalıdırHer bir tedavi durumu için plicates, ancak tedavi başına daha fazla kez tekrar tercih edilir.
  2. Pasteur pipeti ile% 95 O 2/5% CO2 ile 15 dakika boyunca Krebs Ringer bikarbonat tampon gazlama sonra,% 0.5 RIA dereceli BSA ve 1.7 mM (bir ön kuluçka çözeltisi) bir son glükoz konsantrasyonu ekleyin. Daha sonra her bir mikrofüj tüpüne taze gazlanmış Krebs 1 ml. Krebs iki ml ön-inkübasyon ve tedavi zaman noktaları için tüp için gereklidir; ancak bu ilave, en azından 5-10 ml hazırlanması önerilir.
  3. Petri kabı ortasına adacıklar girdap ve bir P-20 pipet kullanarak, glikoz-ihtiva eden kültür ortamı yıkamak için inkübasyon çözeltisi 5 ml ihtiva eden 60 mm polistiren Petri kabı yeni bir 15 mm adacıklar elle almak adacıkları.
  4. Kullanılan cAMP tahlil kiti GE Healthcare cAMP Doğrudan Biotrak ÇED olduğunu. Kullanılan prococol "Hücre içi cAMP ölçümü için tarif edilen bir modifikasyonudur, roman parçalama reaktifleriyle olmayan Asetilasyon ÇED prosedürü kullanarak "ve kaydedilebilmesidir tedavi koşulları ve teknik çoğaltır artan sayıda sağlayan, tüp başına adacıklar az sayıda kullanım için optimize edilmiştir. 1 ml ön inkübasyon tamponu ile borular arasındaki adacık büyüklüğü tutarlılık, bakımı, aşama 9.2 her bir tüp içine, bir P-20 pipet, transfer en az 13 adacık kullanılması. Not: çoğaltır sayısını arttırmak tüp başına adacıklarının sayısı fazla faydalıdır. Eşit tüp başına adacıklar sayısını artırmak için yeterli adacık varsa Ancak, tüp başına 25-50 adacık kadar, bunu yapmak için tavsiye edilir.
  5. Mikrofüj tüpü kapaklar açıkken,% 5 CO2 ayarlanmış bir 37 ° C inkübatöre aktarmak ve 45 dakika için bir taban düzeyi her adacık insülin salgılanmasını normalleştirmek için inkübe edilir.
  6. Numuneler kuluçka da, gaz verilerek Krebs fr olarak tedavi (yani 8 mM, 11.1 mM, 16.7 mM glikoz, vs) hazırlanmasıom 9.2 adım. 15 ml konik tüplere, bir pipetleme hata için hesap ilave 1 ml. 200 uM nihai konsantrasyona kadar 3-izobutil-1-metilksantin (IBMX) ilave edin. IBMX bloke da üretildiği anda cAMP hücre içinde birikmesine izin cAMP bozunmasını, genel bir fosfodiesteraz inhibitörüdür. (Not:.. Bu gerçek bir cAMP üretim tahlildir ölçme cAMP üretimi arzu olmayabilir anlarda için tartışma bölümüne bakın IBMX tahlil dışında bırakılırsa, daha adacıklar cAMP verileri elde etmek için tüp başına gerekli olacaktır , standart eğrinin lineer aralığında).
  7. 45 dakika ön inkübasyondan sonra, kuluçka makinesi, kapak ve darbe girdap her bir örnek (en az 0,5 saniye) 'den mikrofüj tüpleri çıkarın. Bu olasılığı nedeniyle tüpün alt konsantre edildi olan adacık oluşturulur edilmiş ensülin gradyanı karıştırmaktır. Kapaklı: Bu olumsuz adacık istikrarı (Not etkileyebilir olarak bakım, çok sert vortekslemedeki değil alınmalıdıradacıkları ile tüpler hafifçe gezdirdikten veya hafifçe-vorteks nabız mümkün değilse ters olabilir. Bu seçenekler deney planlanırken dikkate alınması gereken tahlil,) zaman katacak.
  8. Adacıklar 10,000 rpm (7,000-7500 g) ulaşmak ve sonra hemen kapatın kadar bir masa üstü santrifüj (RT) ve spin her tüp transferi.
  9. Adacık pelet üzerine Krebs yaklaşık 10-15 ul bırakarak her bir mikrofüj tüpteki Krebs çoğunun çıkması için bir P-1000 pipet kullanın. En yakın olan adacık pelet kısmını kaldırmak için bir P-20 pipet kullanın. Pelet rahatsız edilirse, geri tüp ve yeniden spin içine Krebs pipetle.
    (Not: deneyci çok zor bunu bozmadan adacık pelet Krebs tümünü kaldırmak için bulursa, son 10-15 ul sol ve daha sonra protokolde toplam hacim oluşturuyor olabilir.
  10. İnkübasyondan sonra numuneler dondurma snap izole edilmiş bir kap içinde sıvı azot yeterli miktarda elde edilir.
  11. Kuluçka numune almak, kap, girdap hızlı (az 0.5 sn) 10,000 rpm (7,000-7500 g) kadar bir masa üstü santrifüj (RT) olarak mikrofuge'ye tüpleri dönmeye ve sonra hemen kapatın. Insülin ya da başka bir metabolit arzu edilen bir alt uygulaması, daha fazla analiz edilinceye kadar -20 ° C'de bir mikrofüj tüpüne ve mağaza ortamının bir kısım toplamak için bir P-1000 pipet kullanın. Uyarım ortam toplanır değilse, bu atılabilir.
    (Not: IBMX glukoz ile uyarılmış insülin salgılanması (GSIS güçlü bir potansiyatördür) Bu nedenle, cAMP stimülasyon ortamından elde GSIS sonuçlar doğru GSIS belirli tedavilerin gerçek etkisini temsil edemezler, bu etkiler ince özellikle.).
  12. Adacık pelet rahatsız etmeden, mümkün olduğunca çok uyarım orta kaldırmak için adım 9.9 tekrarlayın. Krebs az 10-15 ul doku adacığı topak üzerinde kalan orada sonra ek bileşen, sıvı azot içinde adacık pelet dondurma. Bir kere bütünNumuneler çırpıda cAMP ölçümüne kadar -80 ° C'de, mağaza donduruldu.
  13. CAMP belirlenmesi gününde, üreticilerin protokole göre yeni lizis reaktifler hazırlamak. 30 saniye boyunca en yüksek hızda her bir mikrofüj tüpün ve vorteks 200 ml liziz reaktif 1B ekleyin. Tüpler 30 saniye boyunca her 2 dakikada bir vorteks, 10 dakika boyunca buz üzerinde bekletin. (Not: Protokol hücre parçalanmasını sağlamak için Mavitripanla ile mikroskobik analizi gerçekleştirilmesi önerir, ancak bu adacıklar için yapılmaz).
  14. Çalışma standartları hazırlamak ve üreticinin protokol açıklandığı gibi tam ÇED mikroplağı kurmak. Enzim alt-tabaka, 30 dakika için mikroplaka ile inkübe edildikten sonra, isteğe bağlı olarak 1.0 M sülfürik asit aşamasını gerçekleştirmek ve bir mikro-plaka okuyucusu kullanılarak 450 nm'de mikro levha boşluklarda absorbansını belirler.
  15. Siklik AMP sonuçları finol / sıra kaydedilecektir. Bu toplam orijinal numunenin hacmi (200 ul + herhangi normalize edilmelidirartık Krebs) adım 9.9 den adacıklar üzerine bıraktı. Daha sonra, her iki sonuç fmol cAMP / adacık üretilebilir veya lisat numuneleri (fmol / ug protein verilmesi), toplam hücresel protein sonuçları normalleştirmek için bisinkoninik asit (BCA) proteini deneyi tabi olabilir vererek, adacık toplam sayısı olarak normalleştirilebilir . İkincisi adacık boyutları örnekler arasındaki tutarsız olduğunda tavsiye edilir, ve adacık boyutu için bir vekil olabilir. Pierce BCA protein tahlil kiti Bu protokolde başarı ile kullanılabilir, ve örnek sadece 25 ml gerektirir edilmiştir. BSA standartlar cAMP tahlili kiti liziz reaktif 1B olarak hazırlanmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Izolasyon sırasında yüksek adacık verim sağlamak için, protokolde belirtilen cerrahi teknikler yakından takip edilmelidir. Burada sunulan teknikleri her laboratuvara uygun olacak olsa da, başarılı bir izolasyona yol açacak bir kaç kritik adımlar vardır. Safra kanalı kolayca erişilebilir hale getirmek için, bu organlar farenin sağ tarafına (Şekil 1) yer değiştirebilir önerilir. Ayrıca, bu daha az ağırlık kısıtlayan genişleme olacağından pankreas direnci küçük bir miktarı ile şişirmek için izin verecektir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Dünya nüfusunun% 7.7 etkileyebilecek tahmin diyabet yaygınlığı ile, yeni araştırma tekniklerinin gereksinimi hem anlamak ve diyabet 18 tedavisi zorunludur. Mevcut adacık izolasyon in vitro deney için kullanılan bir iyi kurulmuş bir protokoldür ve hafif değişiklikler 11,14,16 ile daha önce sunulmuştur. Insülin salgılanması gibi, cAMP gibi yukarı bileşenleri üzerinde odaklanarak, izole adacık için ortak bir alt bir uygulama olmakla birlikte, insülin üretimini ve salgılanmasını güçlendirmek m...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Biz bu çalışmada açıklanan protokollere uzman teknik yardım için Renee L. Pasker ve Harpreet K. Brar teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, bize zaman izin laboratuvar üyelerinin desteği ile birlikte, Wisconsin-Madison Üniversitesi Duke Üniversitesi ve Alan D. Attie, Christopher B. Newgard ve danışmanlık kabul ve optimize etmek için gerekli destek istiyoruz açıklanan protokolleri. Özellikle, verimli tartışmalar ve tavsiye için Attie Laboratuarında Hans HOHMEIER, Danhong Lu, ve Helena Winfield Newgard Laboratuvarı ve Mary Rabaglia teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe DK080845 ve Çocuk Diyabet 594 tarafından desteklenen
(MEK) Araştırma Vakfı hibe 17-2011-608

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aktif adacıkları izole etmek için uygun Clostridium histolyticum kollajenazSigma-AldrichC7657
Ficoll 400Sigma-AldrichF9378
Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi 10XInvitrogen (Gibco)14065-056
HEPESSigma-AldrichH3375
RPMI 1640 (toz)Invitrogen (Gibco)31800-022
Sığır Serumundan Albümin (BSA)Sigma-AldrichA7888
3/0 İpek Sütür İpliğiGüzel Bilim Araçları18020-30
Dumont #5 ForsepsGüzel Bilim Araçları11251-10
0.8 mm Forseps   Güzel Bilim Aletleri11050-10
Kavisli MakasGüzel Bilim Aletleri14061-10
Vannas-Tü bingen Yaylı Makas - Düz/Keskin/8,5 cm/5 mm Kesici Kenarİnce Bilim Aletleri15003-08
Diseksiyon MakasıGüzel Bilim Aletleri14002-14
5 ml BD Luer-Lok ŞırıngaBD309646
1 ml BD şırıngaBD309628
30 G BD İğne 1/2" UzunlukBD305106
27 G BD İğne 1/2" UzunlukBD305109
Bileme TaşıGüzel Bilim Araçları29008-01
2-2-2-tribromoetanolSigma-AldrichT48402-25G
2-metil-2-bütanolSigma-Aldrich240486-100mL
Sodyum Klorür (NaCl)Sigma-AldrichS9888
Potasyum KlorürSigma-AldrichP3911
Monopotasyum Fosfat (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662
Sodyum Bikarbonat (NaCHO3)Sigma-AldrichS6014
CaCl2· 2H2OSigma-AldrichC3881
MgSO4· 7H < alt > 2 < / sub >OSigma-AldrichM9397
Penisilin-Streptomisinİnvitrojen (Gibco)15140-122
Isı ile İnaktive Fetal Sığır Serumu (HI FBS)Fisher ScientificSH30088.03HI
3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX)Sigma-Aldrich5879-100MG

Kaynaklar

  1. Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
  3. Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
  4. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  5. Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
  6. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  7. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
  8. Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
  9. Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
  10. Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
  11. Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
  12. Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
  13. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
  15. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
  16. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
  17. Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
  18. Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  19. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
  20. Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
  21. Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
  22. Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
  23. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  24. Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
  25. Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
  26. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Adac k zolasyonuEnzim mm nosay mKollagenaz SindirimiYo unluk Gradyan Santrif jasyonuAdac k K lt r BesiyeriGlikozla Stim le Edilmi ns lin Sal n mYaban Tipi FarelerGen Nakavt Fareler

İlgili makaleler