Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem
Bu makalede
Özet
Özet
Kontrolsüz glisemi diabetes mellitus bir özelliğidir ve nöropati, nefropati ve retinopati gibi hastalıklarının teşvik etmektedir. Diyabet, immün-aracılı tip 1 ve obezite bağlantılı tip 2 hem de diyabet patofizyolojisi ve tedavi mekanizmalarını ortaya koymaya yönelik çalışmaların artan yaygınlığı ile kritik bir önem taşımaktadır. Langerhans pankreatik adacıkların β-hücrelerinin uygun bir şekilde, yüksek kan şekeri konsantrasyonlarına yanıt olarak insülin salgılayan sorumludur. Glikoz ve diğer besinler, β-hücrelerinin aynı zamanda belirli hormonlar tarafından uyarılır Buna ek olarak, hücre içi siklik adenozin monofosfat üretimini artırmak β-hücresi reseptörleri üzerinde bir yemek ve hareket yanıt olarak bağırsak salgılanan inkretinler, (adlandırılır cAMP). Azalmış β-hücre fonksiyonu, kütle ve iç salgı bezi yanıt tip 2 diyabet patofizyolojisi katkıda iyi anlaşılmış olup, aynı zamanda giderek wi bağlantılı ediliyorinci tip 1 diyabet. Mevcut fare adacık izolasyon ve cAMP tespit protokolü hastalığın ilerlemesini ve terapötik müdahaleler, hücre içi cAMP üretiminin modülasyonu yoluyla hareket reseptörlerini inkretindir reseptörlerinin aracılık ettiği veya ilgili olduğu özellikle teşvik mekanizmaları tanımlamak yardımcı bir araç olabilir. Sadece cAMP ölçümleri tarif edilecek olmasına rağmen, tarif edilen doku adacığı izolasyonu protokolü de glikoz insülin salgılanmasını, [3H]-timidin katılması, protein bolluğu ve mRNA ifadesi uyarılmış de dahil olmak üzere diğer pek çok alt uygulamalar için izin temiz bir hazırlık oluşturur.
Giriş
Öglisemi sıkı bakım kontrolsüz tip 1 ve 2 diyabet 1 patoloji tüm özellikleridir nöropati, nefropati ve retinopati, hastalıklarının önlenmesi için zorunludur. Tip 1 ve tip 2 diyabetli hem de azaltılmış β-hücre fonksiyonu ve kütle kan glikozu konsantrasyonlarını 2 de karıştırabilir. Insülin üreten β-hücrelerinin, bozulmuş β-hücresi insülin salgılama ve çevresel insülin türü sinyal 2 diyabet yıkıcı kaybı immün aracılı tip 1 diyabet, birlikte hiperglisemi, dislipidemi ve sonunda ile sonuçlanan, artan hepatik glikoz üretimini teşvik Oysa β-hücrelerinin ayrı ayrı 3 β-hücre kütlesi ve insülin salgılama kapasitesinin kaybı. iki Tip 1 ve tip 2....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri ilgili tüm kurallar, düzenlemeler ve düzenleyici kurumlar ile uyum içinde idam edildi. Gösterdiği ediliyor protokol Wisconsin-Madison Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) rehberliği ve onayı altında gerçekleştirildi.
Çözümleri 1. Hazırlanması
- Bu protokol ötenazi yöntemi (Tartışma bakın alternatifleri gözden için) Avertin anestezi altında kan kaybı olduğunu. Avertin yapmak için, 20-30 dakika boyunca 37 ° C'de 15 ml konik bir tüp ve ısı 2-metil-2-butanol 1.25 ml 2-2-2 tribromoethanol 0.625 gr (1.25 veya% 44.2 mM) ekleyin. Tam olarak 2-2-2 tribromoethanol çözmek için bir seferde ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Izolasyon sırasında yüksek adacık verim sağlamak için, protokolde belirtilen cerrahi teknikler yakından takip edilmelidir. Burada sunulan teknikleri her laboratuvara uygun olacak olsa da, başarılı bir izolasyona yol açacak bir kaç kritik adımlar vardır. Safra kanalı kolayca erişilebilir hale getirmek için, bu organlar farenin sağ tarafına (Şekil 1) yer değiştirebilir önerilir. Ayrıca, bu daha az ağırlık kısıtlayan genişleme olacağından pankreas direnci küçük bir miktarı ile şişirmek için izin verecektir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Dünya nüfusunun% 7.7 etkileyebilecek tahmin diyabet yaygınlığı ile, yeni araştırma tekniklerinin gereksinimi hem anlamak ve diyabet 18 tedavisi zorunludur. Mevcut adacık izolasyon in vitro deney için kullanılan bir iyi kurulmuş bir protokoldür ve hafif değişiklikler 11,14,16 ile daha önce sunulmuştur. Insülin salgılanması gibi, cAMP gibi yukarı bileşenleri üzerinde odaklanarak, izole adacık için ortak bir alt bir uygulama olmakla birlikte, insülin üretimini ve salgılanmasını güçlendirmek m.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Teşekkürler
Biz bu çalışmada açıklanan protokollere uzman teknik yardım için Renee L. Pasker ve Harpreet K. Brar teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, bize zaman izin laboratuvar üyelerinin desteği ile birlikte, Wisconsin-Madison Üniversitesi Duke Üniversitesi ve Alan D. Attie, Christopher B. Newgard ve danışmanlık kabul ve optimize etmek için gerekli destek istiyoruz açıklanan protokolleri. Özellikle, verimli tartışmalar ve tavsiye için Attie Laboratuarında Hans HOHMEIER, Danhong Lu, ve Helena Winfield Newgard Laboratuvarı ve Mary Rabaglia teşekkür ederim. Bu çalışma NIH hibe DK080845 ve Çocuk Diyabet 594 tarafından desteklenen
(MEK) Araştırma Vakfı hibe 17-2011-608
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Aktif adacıkları izole etmek için uygun Clostridium histolyticum kollajenaz | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640 (toz) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 | |
| Sığır Serumundan Albümin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 İpek Sütür İpliği | Güzel Bilim Araçları | 18020-30 | |
| Dumont #5 Forseps | Güzel Bilim Araçları | 11251-10 | |
| 0.8 mm Forseps | Güzel Bilim Aletleri | 11050-10 | |
| Kavisli Makas | Güzel Bilim Aletleri | 14061-10 | |
| Vannas-Tü bingen Yaylı Makas - Düz/Keskin/8,5 cm/5 mm Kesici Kenar | İnce Bilim Aletleri | 15003-08 | |
| Diseksiyon Makası | Güzel Bilim Aletleri | 14002-14 | |
| 5 ml BD Luer-Lok Şırınga | BD | 309646 | |
| 1 ml BD şırınga | BD | 309628 | |
| 30 G BD İğne 1/2" Uzunluk | BD | 305106 | |
| 27 G BD İğne 1/2" Uzunluk | BD | 305109 | |
| Bileme Taşı | Güzel Bilim Araçları | 29008-01 | |
| 2-2-2-tribromoetanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-metil-2-bütanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| Sodyum Klorür (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Potasyum Klorür | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Monopotasyum Fosfat (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodyum Bikarbonat (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2· 2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4· 7H < alt > 2 < / sub >O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Penisilin-Streptomisin | İnvitrojen (Gibco) | 15140-122 | |
| Isı ile İnaktive Fetal Sığır Serumu (HI FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI | |
| 3-İzobutil-1-metilksantin (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
Kaynaklar
- Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
- Alberti, K. G., Zimmet, P. Z.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
