Biz fizyolojik ve patolojik ilgili uyaranlara ile asiner hücre kalsiyum sinyalleri ve hücresel hasarı incelemek amacıyla bir fare fare pankreas asiner hücre hazırlama tekrarlanabilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücrelerin, adenoviral enfeksiyon için bir yöntem de sağlanmaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması
Bu makalede
Özet
Özet
Pankreas asiner hücre ekzokrin pankreasın ana parankimal hücre ve pankreatik kanal içine pankreatik enzimlerin salgılanmasını birincil rol oynar. Ayrıca pankreatit başlatılması için bir sitedir. Burada bütün pankreas dokusu ve hücre içi kalsiyum sinyallerinden asiner hücreler izole nasıl tarif ölçülür. Buna ek olarak, in vitro olarak hücre hasarının neden asinar koşullarında, Adeno yapıları bu hücreleri transfekte etmek, ve daha sonra laktat dehidrojenaz, hücre hasarının işareti olan kaçak ölçme teknikleri tarif eder. Bu teknikler asiner hücre fizyolojisi ve patolojisi karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar.
Giriş
Sitozolik kalsiyum dinamik değişiklikler fizyolojik hem de patolojik asiner hücre olayları için gereklidir. Kalsiyumun bu farklı etkileri 1 sinyal kalsiyum farklı mekansal ve zamansal desen kaynaklandığı düşünülmektedir. Örneğin, asinar hücreden enzim ve sıvı salgılamadan yerine 2 alır apikal kutbunun bir kısıtlı bölge kalsiyum sivri bağlantılıdır. Buna karşılık, yoğun olmayan salınımlı kalsiyum sinyalleri tarafından izlenen bir küresel dalga kalsiyum akut pankreatit 3,4 yol patolojik erken olayları ile ilişkilidir. Bu içi asiner proteaz aktivasyonu, düşük enzim salgılanmasını ve asiner hücre hasarı içerir. Bizim laboratuvar in vi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kalsiyum Görüntüleme için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması
- 20 mM HEPES, 95 mM NaCI, 4.7 mM KCI, 0.6 mM MgCl2, 1.3 mM CaCl2, 10 mM glükoz, 2 mM glutamin, 1 x ve en az Eagle ortamının esansiyel olmayan amino asitler ihtiva eden HEPES inkübasyon tamponu hazırlayın. NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın, nihai çözelti.
- HEPES kuluçka tampon maddesi (yukarıda tarif edilmiştir), 25 ml BSA (% 1 w / v son) eklenerek bir BSA inkübasyon tamponu hazırlayın.
- 1.1 mg / ml (/ 200 adet mi) tip-4 kolajenaz ve 1 mg / ml soya fasulyesi tripsin inhibitörü ile 6 BSA kuluçka tampon maddesi (yukarıda açıklandığı gibi) ml ilave edilere....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Fizyolojik uyarıcıya tepki olarak hücre kalsiyum asinar ölçümlerinin bir örneği Şekil 3'te verilmektedir. Acinar hücreleri kalsiyum ile yüklenen boya Fluo-4 ve asetilkolin analog karbakol (CCh, 1 uM) ile perfüze) 8. Hücreler, apikal bölgedeki başlatır ve bazolateral bölge 3,9 ile yayılan bir kalsiyum dalga şeklinde verdi. Şekil 3B gösterilen Temsilcisi iz yaygın olarak 1 mcM karbakol ile gözlenen tipik tepe-plato desen göstermektedir. Tersine, kolesistokinin an.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Hücre izolasyonu yöntemi ve sonraki deneyleri pankreas fizyolojik ve patofizyolojik özellikleri incelemek için hangi ile güçlü araçlar temsil burada tasvir. Dağınık pankreas asiner hücreleri izole etmek için yöntemi ilk kez 1972 11 Amsterdam ve Jamieson tarafından tanımlanmıştır. Burada sunulan yöntem Van Acker ve arkadaşları 12 tarafından tarif daha yeni izolasyon yöntemleri uyarlanmıştır. Bu tekniklerin son derece tekrarlanabilir ve kolay öğrenilen olmasına rağmen, tam olarak gerçekleştirilmelidi.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma Sağlık Hibe DK083327 ve DK093491 bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (SZH için) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Fareler NCI | N/A | Erkek 20-30 gram; hemen hemen her suş karşılaştırılabilir sonuçlar vermelidir. | |
| HEPES | Amerikan Biyoanalitik | AB00892 | |
| Sodyum Klorür | J.T. Baker | 3624-05 | |
| Potasyum Klorür | J.T. Baker | 3040-01 | |
| Magnezyum Klorür | Sigma | M-8266 | |
| Kalsiyum Klorür | Fischer | C79 | |
| Dekstroz | J.T. Baker | 1916-01 | |
| L-Glutamin | Sigma | G-8540 | |
| 1X minimum Eagle'ın orta esansiyel olmayan amino asit karışımı | Gibco | 11140-050 | |
| Sodyum Hidroksit | EM | SX0593 | |
| Sığır Serumu | Albümin Sigma | A7906 | |
| Kollajenaz | Worthington | 4188 | |
| Soya Fasulyesi Tripsin İnhibitörü | Sigma | T-9003 | |
| Karbondioksit | Matheson Gazı | 124-38-9 | |
| 125 ml Erlenmeyer plastik şişe | Crystalgen | 26-0005 | |
| Diseksiyon kiti | Güzel Bilim Araçları | 14161-10 | |
| %70 Etanol | LabChem | LC222102 | |
| >P1000, P100, P10 pipetleri | Gilson | FA10005P | |
| Tartı teknesi | Heathrow Scientific | HS1420A | |
| Plastik transfer pipetleri | USA Scientific | 1020-2500 | |
| 15 ml konik tüpler | BD Falcon | 352095 | |
| 50 ml konik tüpler | BD Falcon | 352070 | |
| 1.5 ml mikro santrifüj tüpü | Fisher | 05-408-129 | |
| 0.65 ml mikro santrifüj tüpü | VWR | 20170-293 | |
| 22 x 22 mm cam lameller | Fisher | 032811-9 | |
| Nitrik Asit | Fischer | A483-212 | |
| Hidroklorik Asit | Fischer | A142-212 | |
| Deiyonize su | N/A | N/A | |
| 18 x 18 mm lameller | Fischer | 021510-9 | |
| Laboratuvar filmi | Parafilm | PM-996 | |
| Fluo-4AM | Invitrogen | F14201 | |
| Dimetilsülfoksit | Sigma | D2650 | |
| Luer kilidi | Becton Dickinson | 932777 | |
| 60 ml şırınga | BD Bioscience | DG567805 | |
| 23 & # 190; ölçer iğnesi | BD Bioscience | 9328270 | |
| PE50 boru | Kil Adam | PE50-427411 | |
| Düz başlı tornavida | N/A | N/A | |
| DMEM F-12, Fenol Kırmızısı yok | Gibco | 21041-025 | |
| 30.5 ölçer iğne | BD Bioscience | 305106 | |
| 5 CC şırınga | BD Bioscience | 309603 | |
| 25 ml Erlenmeyer şişesi | Fischer | FB50025 | |
| Naylon örgü filtre | Nitex | 03-150/38 | 150 um gözenek boyutu |
| 48 kuyu doku kültürü plakası | Costar | 3548 | |
| 96 kuyu doku kültürü plakası | Costar | 3795 | |
| 6 kuyulu doku kültürü plakası | Costar | 3506 | |
| Sıvı nitrojen | Matheson Gazı | 7727-37-9 | |
| Sitotoksisite test kiti | Promega | G1782 | |
| Adeno-GFP | N/A | /A | J. Williams |
| Equipment | |||
| Kelepçeli halka standı | United Scientific | SET462 | |
| Perifüzyon odası | N/A | N/A | S.Z.H ve Yale Üniversitesi'ndeki meslektaşları tarafından tasarlanmıştır |
| Vakum hattı | Manostat | 72-100-000 | |
| Çalkalayıcılı | su banyosuHassas Bilimsel | 51220076 | |
| Konfokal mikroskop | Zeiss | LSM 710 | |
| BioTek Synergy H1 plaka okuyucu | BioTek | 11-120-534 | |
| Doku kültürü başlığı | Nuaire | NU-425-600 | |
| Doku kültürü İnkübatörü | Thermo | 3110 |
Kaynaklar
- Toescu, E. C., Lawrie, A. M., Petersen, O. H., Gallacher, D. V. Spatial and temporal distribution of agonist-evoked cytoplasmic Ca2+ signals in exocrine acinar cells analysed by digital image microscopy. Embo J. 11, 1623-1629 (1992).
- Ito, K., Miyashita, Y., Kasai, H.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
