Yenidoğanların İnsan Sitomegalovirüs (HCMV) enfeksiyonu zeka geriliği önemli bir nedeni temsil, henüz virüs kaynaklı patogenezinde yol açan moleküler olayların hala tam olarak anlaşılamamıştır. Beyin enfeksiyon dinamiğini incelemek için, bütün hayvan adapte In vivo Görüntüleme lusiferaz-rekombinant virüs ile enfekte yenidoğanların zaman ders analiz yapmak için.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan Sitomegalovirüs (HCMV veya HHV-5) bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde hayatı tehdit eden bir patojendir. Konjenital veya neonatal enfeksiyon üzerine, virüs bulaşabilir ve sağırlık ve zeka geriliği gibi ciddi nörolojik hasar, neden olabilir gelişmekte olan beyin, çoğaltmak. Semptomların potansiyel ciddiyeti rağmen, tedavi seçenekleri, bir aşı ve belirli bir antiviral tedavinin yokluğunda olmaması ile sınırlıdır. Gözlemler çoğunlukla enfekte çocukların otopsi türeyen bu yana Ayrıca, merkezi sinir sistemi (MSS) enfeksiyon sırasında meydana gelen moleküler olayların kesin bir açıklamasına hala eksiktir. Bu Rhesus makak CMV gibi çeşitli hayvan modellerinde, MSS CMV patogenezinde dönüştü ve önemli bilgiler verilmiştir. Ancak, insanlar ile evrimsel yakınlığı rağmen, bu model hayvanlar ve eksilerini bulaştırmak için kullanılan kafa içi aşılama prosedürü ile sınırlıydıistently MSS enfeksiyonu neden. Ayrıca, etik fare sitomegalovirüs (MCMV) ile yeni doğan farelerin neonatal enfeksiyon son zamanlarda önemli adımlar atılmış durumda aralarında, alternatif modellerin geliştirilmesi teşvik var. Örneğin, Balb / c yenidoğan için MCMV intraperitoneal, beynin spesifik bölgelerinde nöronlar ve glial hücrelerin enfeksiyonu neden olduğu rapor edilmiştir. Bu bulgular, farelerin deneysel aşı çocuklarda HCMV enfeksiyonuna tarafından uyarılan açıkları özetlemek olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, yenidoğanların MCMV enfeksiyon dinamik bir analiz klasik yöntem viral yükü ve / veya bağışıklık ile ilgili parametreler analiz etmek için farklı zaman noktalarında hayvanların önemli sayıda kurban gerektirdiği için yapmak zordur. Bu darboğaz aşmak için ve nadir mutant hayvanlar gelecekteki araştırmalar sağlamak için, biz vira bir zaman ders analiz gerçekleştirmek için in vivo görüntüleme teknolojisi uygulananC57BL / 6 yenidoğan için lusiferaz ifade eden bir rekombinant MCMV periferik enjeksiyon üzerine beyinde l dağıtılması.
Giriş
İnsan Sitomegalovirüs (HCMV/HHV-5) β-herpes ailesinin bir üyesidir. HCMV genellikle asemptomatik enfeksiyon 1 gibi erken ömrü boyunca elde edilir son derece yaygın, fırsatçı patojendir. Tüm herpes gibi, HCMV bağışıklık sistemi sıkıca viral replikasyon kontrol eden ev sahibi, tüm ömrü boyunca devam. Viral reaktivasyonu Bölüm çoğunlukla böyle greft reddi 2 önlemek için ilaç alan transplant hastaları gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde ortaya çıkar. Yetişkinlerde, HCMV, glioblastomlar da 3 ile bağlantılı olmuştur. Buna ek olarak, HCMV olgunlaşmamış bağışıklık 4-6 ile yeni doğanlar için önemli bir patojendir. Gelişmekte olan fetus veya yenidoğanda primer enfeksiyon ciddi sonuçlara yol açabilir. HCMV enfeksiyonu, gelişmiş ülkelerde konjenital doğum kusurlarına ve çocukluk çağı bozukluklarının en yaygın enfeksiyonlu hastalık nedenidir. Bu yenidoğan HCMV enfeksiyonu insidansı% 0.5-1 O etkilediği tahmin edilmektedirf% 5-10, mikrosefali veya serebellar hipoplazi gibi ciddi belirtiler yaşayacaktır aralarında tüm canlı doğumlar. Buna ek olarak, subklinik viral enfeksiyon ile enfekte bebeklerin% 10 daha sonra kaybı, görme bozuklukları veya nöbet ve epilepsi 7,8 işitme, zeka geriliğine yol sequellae geliştirecektir.
Gibi enjeksiyon 9 farklı yolla farelere inoküle edilebilir gibi Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1) gibi diğer insan herpes karşı, sitomegalovirüs çoğaltma tür özgüdür. Bu özellik, ciddi bir şekilde farklı hayvan modellerinde gerçekleştirilen HCMV, patojenez araştırmalar engel (fare, sıçan, kobay, al yanaklı maymun) ve kendi orijinal ana özgü CMVs biriktirdi. Tüm CMVs genom büyüklüğü ve organizasyon, doku tropizm ve gen ifadesinin düzenlenmesinde önemli benzerlikler gösterirler. Ayrıca kendi ev sahibi benzer patolojiler neden. Rağmen genomik çeşitlilik olmakHCMV, ara ve fare sitomegalovirüs (MCMV) (ORF% 50 sıçangil CMV tanımlanan insan virüsü olarak mevcut), fare modeli, en son çok mutant virüs kontrol etme kabiliyeti açısından test edilebilir, çünkü avantajlı olduğu kanıtlanmıştır in vivo çoğaltma. Bu, bu virüs 10 "resistome" oluşturan yetişkin aşamada ifade fare gen sayısı, bir tahmini etkin bir genetik bir ekran yol açmıştır. Toplamda, bu, MCMV ile enfekte farelerde yetişkinlerde konak-virüs etkileşimleri çalışma için cazip bir modeli temsil gösterir. Insan ve fareler arasındaki plasental katman organizasyon farklılıklar farelerde viral enfeksiyon anne-to-fetus aktarımını etkileyebilir çünkü konjenital CMV enfeksiyonu keşif daha karmaşıktır. Son zamanlarda, gebeliğin gün 12.5 ile plasenta MCMV doğrudan enjeksiyon bozukluğu 11 işitme yol açan fareler yenidoğanların beyin enfeksiyonu sağladı. Bununla birlikte, çoğu investigations şimdi potansiyel hematojen beyin enfeksiyonu yol açan sistemik viral yayılması, bir kafa içi enjeksiyon bundan daha uygun bir model sağlamak için 4-20 saat-eski yenidoğanların intraperitoneal kullanın. Bu protokol, CMV patogenezinde önemli bilgiler verilmiştir ve daha özel olarak ise, bu makrofajlar 12 gibi tek çekirdekli hücreleri ile infiltre inflamatuvar odaklar bulunan nöronal ve glial hücrelerde viral replikasyonda yeni doğan sonuç olduğunu MCMV enfeksiyon gösterilmiştir. Bu rapor ayrıca, azalmış granül nöron çoğalması ve yer değiştirmesi ve birden fazla interferon uyarımlı gen oluşumu ile birlikte, beyincik değiştirilmiş morfojenezini tarif. Merkezi sinir sisteminde MCMV bölgesinin kontrolü için CD8 + T hücrelerinin önemli bir rol aynı grup 13 tarafından rapor edilmiştir. Bir mikrobun patolojik etkisini analiz dikkate alınması gereken önemli bir yönü enfekte dinamikleri olaniyon. MCMV durumunda, gelecekte nörobiyolojik yaralanma büyüklüğünü anlamak ve tahmin etmek için gelişmekte olan beyin viral yayılması ve ilerlemesini keşfetmek ve ölçmek için özellikle önemlidir. Geleneksel olarak, bir enfeksiyonun ilerleme miktarının enfekte hayvanların normal kurban başka nedenden ötürü erişilemez olan beyin gibi dokularda patojen, titre gerektirir. Protokol Bu tür şimdi gerekli hayvan refahı iyileştirilmesi ve 3RS (Değiştir, daraltın azaltın) ilkeleri 14 tarafından meydan. In vivo görüntüleme teknolojileri kullanılarak in vivo enfeksiyon deneylerde gerekli olan hayvanların sayısı ciddi bir azalma sağlayabilir. Burada, rapor ve fare yenidoğanlarda için periton MCMV-Luc enjeksiyon üzerine beyin içine viral yayılması bir zaman ders analizi tarif. Aynı hayvanlar kullanarak, yoğun vi siteleri takip ve in vivo takip2 haftalık bir dönemde ral çoğaltma.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Viral Süspansiyon hazırlanması
- Ulrich Koszninowski en laboratuvardan MCMV ifade Lusiferaz en Smith suşu (MCMV-Luc 15) edinin. Bu rekombinant olarak, lusiferaz geninin MCMV genomun IE2 lokusunda eklenir.
- MCMV-Luc yükseltmek için, enfeksiyon çokluğu farklı (İB, 0,001-1) 16 MCMV bir fare kemik iliği stromal hücre hattı (M2-10B4, ATCC # CRL-1972), Infect. Bunun için, 37 serumsuz ortamda kültürlenmiş hücrelere virüs eklemek ° C Bir saat sonra, süpernatant kaldırmak ve DMEM,% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile takviye ile değiştirin. Beş gün sonra, daha sonra kullanmak kadar -80 kültür ortamı ve mağaza alikotları ° C hasat.
- Plak yöntemi ile viral süspansiyon Titrasyon.
- DMEM 40,000 hücre, bir 24 yuvalı plaka 3T3 hücreleri (ATCC # CRL-1658) split / oyuk içinde 1 ml penisilin (200 IU / ml) ve steptomycin (200 mg / ml ihtiva eden% 10 FCS ile desteklenmiş) Ve 37 'de 24 saat inkübe ° C
- DMEM MCMV süspansiyonun bir alikotu seri dilüsyonları (10 -1 10 -8) hazırlanması ve hücre kültürü ortamı çıkarıldıktan sonra 200 ul seyreltme ile hedef hücreler (3T3) Infect. 1 saat 37 ° C'de inkübe Üst orta 1 ml (DMEM% 3 FCS,% 2 (v / v) gentamisin, 200 IU / ml penisilin, 200 mg / ml streptomisin, 8 g / L, karboksimetil selüloz) ekleyin ve 37 ° 5 gün inkübe ° C
- Her kuyuya 200 ul% 10 formaldehit (su formaldehid ile seyreltme toksik inhalasyon önlemek için kimyasal bir kaput yapılmalıdır) eklenmesi ve oda sıcaklığında 6 saat inkübe edilmesiyle hücreleri saptamak. Pipetleme ile kültür ortamı + fiksatör çıkarın ve 200 ul hücre boyama çözeltisi (% 20 etanol içinde% 1 kristal viyole (w / v)) ekleyin. Kullanımdan önce, 9 kısım Milli-Q su ile 1 kısım seyreltin. Oda sıcaklığında 2 dakika inkübe, suyla ıslatılarak 3-4x plakasını yıkayın, gözlü olan plakların sayısını saymak ve kuru sağlar.
- 50 ul 50 PFUs almak ve daha sonra kullanmak kadar buz üzerinde bırakmak DMEM MCMV-Luc seyreltilir. Yenidoğanların yaş 2-3 hafta ulaşmadan yüksek viral mikroorganizma kullanarak ölümcül neden olur. Bizim tecrübelerimize göre, 500 PFUs enjeksiyon sonrası her yenidoğanda 5 ila 7 gün içinde öldürücü neden.
2. Yenidoğan enjeksiyon
- Yenidoğanlarda (4 ila 20 saat-farelerden) mevcut olduğunda, anne stres ve yavruların reddedilmesi neden olur "yabancı" kokuları ile kirlenmesini önlemek için dikkatli bir şekilde yavrular kullanmadan önce çöp ve eldiven ile kafesin dışkı işlemek .
- Şekil 1A 'de gösterildiği gibi bir insülin şırıngası (29 g) kullanılarak, bir intraperitoneal gerçekleştirin. Dorsal deri ile yenidoğan tutun. Ventral tarafı yukarı gelecek şekilde, ön ayak altında iğne tanıtmak ve yavaşça periton boşluğuna (göbek biraz altında) elde etmek için cilt altına itin. Şu anda DPBS seyreltilmiş 1% metilen mavisi enjekte ve p hayatta kalma izlemekviral enfeksiyonlar gerçekleştirmeden önce ractice tekniği. Metilen mavisi enjeksiyon işlemi sırasında açıkça görünür olduğu için, biz intraperitoneal boşluğunda viral süspansiyon uygun teslim edilmesini sağlamak için önce bu "eğitim" enjeksiyon performans öneririz.
- Ortaya çıkan ve yenidoğan geri kafesin içine yerleştirebilir küçük kan damlaları ortadan kaldırın.
3. In vivo Görüntüleme
- 7. günde, aynı daha önce belirtildiği gibi dikkat ile yenidoğan ele. Intraperitoneal anestetik madde (4 mg / ml ketamin, 0.8 mg / ml 'ksilazin) ve her hayvan 50 ul içinde luciferase (0.15 mg / g vücut ağırlığı) oluşan bir karışım enjekte edilir. Hayvanların ortalama vücut ağırlığı 1-2 g ve anestezik hayvan başına doz olduğunu: luciferase emisyonunun maksimum ulaşıncaya kadar ketamin 40 mg, ksilazin 8 mikrogram 12-15 dk bekleyin. Bu önceden belirlenmelidir ve luciferase sağlayıcı ve kullanılan görüntüleme sistemine bağlıdır.
- Yavrular anestheti olsa dazed, gelecek tanımlama için onları etiketlemek ve mutant hayvanlar kullanıldığında daha sonra gelecek genotipleme için kullanılabilir doku küçük bir parça hasat.
- Görüntüleme sisteminde yavrular yerleştirin ve tüm vücudunun yaydığı ışığın satın gerçekleştirin. Enfeksiyondan sonra yedi gün, virüs hedef karaciğer gibi organlar, böbrek, akciğer ve tükürük bezleri çok sayıda kopya içine çoğaltıldıktan, bu nedenle, maruz kalma süresi kısa olmalıdır. Bizim durumda, 10-20 saniye (Şekil 1B) için toplama yerine getirir. Görüntüleme cihazı satın odasındaki platformun anestezi hayvanların vücut sıcaklığının aşırı soğutma önlemek için ısıtılması gerekmektedir. Buna ek olarak, bu satın alma bir tur içinde birkaç hayvan düşük çözünürlüklü görüntüler elde etmek ve daha sonra, diseksiyon sonra belirli bir hayvan ya da izole organ bir parçası odaklanmak için platform yakın kamera lensi için yukarı taşımak için yararlıdır. Yazılım hızlı değişimler etkinleştirmeniz gerekirilgi ve anlık görüntülerin gelecekteki ihracat tanımlanan bölgelerin parametrelerin (maruz kalma süresi, mesafe örnek / lens, hassasiyet), miktar.
- Sadece baş ışık sinyali elde etmek için, yüksek viral replikasyon oluşur organların düzeyi (karaciğer, akciğer, tükrük bezleri) de yayılan fotonlar maske ve gerçekleştirecek bir kalın, koyu kağıt ile yanal yatan yenidoğanların vücudu kaplar 5 ila 10 dakika (Şekil 1C) için satın alma. Aynı koşullar altında, hayvanın karşılıklı yan edinimi yapın.
- Kafesin içine yavrular reintroduce ve anestezi yenidoğanların aşırı soğutma önlemek için üzerine bir ısıtma lambası yerleştirin. Düzenli sonrası anestezi kurtarma izlemek. Sözü edilen doz ile, anestezi anda 30 dakika sürer.
- Gün 9, 11 ve 14 aynı işlemi tekrarlayın. Gün 11 ve 14 üzerinde, anestezik (6 mg / ml ketamin, 1.2 mg / ml 'ksilazin)' in dozu değiştirin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Temsili bir deney Şekil 1 'de gösterilmiştir. MCMV-Luc 50 PFUs (A Paneli iğnenin deri altı görselleştirmek için metilen mavisi ile yapılan benzer bir enjeksiyonunu göstermektedir) intraperitonal enjeksiyonu sırasında, yeni doğan bebekler anestezi edilmiştir ve aynı zamanda, lusiferaz substrat (luciferase, kaliper), 0.3 mg. On beş dakika sonra, hayvanlar IVIS 50 edinimi odası (Vivo Görüntüleme Sistemi, Kaliper) ventral yüzü yukarı yerleştirildi ve bütün hayvan yaydığı ışık 10 sn pozlama sırasında yak...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fareler yenidoğanlarda MCMV-Luc yayılmasını izlemek için in vivo görüntüleme teknolojisi kullanarak, biz yabani tip karşı mutant hayvanların beyin viral yayılma gözlemlemek mümkün. Beynin hayvan ve ex vivo görüntüleme daha fazla diseksiyon merkezi sinir sisteminde lüminesan virüsünün varlığını doğruladı. Buna ek olarak, aynı zamanda MCMV E1 erken protein için spesifik bir antikor ile beyin ince kesitler üzerinde (gösterilmemiş olan) immünohistokimya gerçekleştirilir ve gerçekten de, MCMV lümin...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar herhangi bir mali çıkar beyan ederim.
Etik açıklama
Hayvanlar Institut d'İmmunolojik et d'hematologie en hayvan bakım tesisi patojen içermeyen koşullar altında muhafaza edildi. Fare ve deneysel prosedürlerin işleme Laboratuvar Hayvanları Koruma Fransız Kanun uyarınca yapılmıştır. Prosedür yetki numarası A-67-345 altında hizmet vétérinaire de la Préfecture du Bas-Rhin (Fransa) tarafından onaylandı.
Teşekkürler
Biz Viroloji Enstitüsü hayvan tesis kullanma izni için yükseltme ve MCMV-Luc ve Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) titre için Lee Tuddenham (IBMC, Strasbourg) teşekkür ederim. INSERM, Université de Strasbourg ve Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) maddi destek kabul edilmektedir. Yüksek lisans proje süresince Sonia Beroud ve Laetitia Lelieur ilk katılımı da kabul edilmektedir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif/Malzeme | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Metilen mavisi | Sigma Aldrich | 319112 | |
| İnsülin iğneleri | VWR | 613-4897 | |
| Ketamin | CentraVet | Ket 201 | |
| Ksilazin/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Kaliper | 760504 | |
| gentamisin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penisilin / streptomisin | Gibco | 15070 | |
| karboksimetilselüloz | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehit | Sigma Aldrich | F8775 | |
| kristal menekşe | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Kaliper/Perkin Elmer |
Kaynaklar
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy? Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G. Immunity in neonates. Vet. Immunol. Immunopathol. 87, 207-213 (2002).
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K. Immune responsiveness in the neonatal period. J. Comp. Pathol. 137, 27-31 (2007).
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70(2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
